פרוטוקול רקומביננטי מזוכך מבוססי חיסונים הסארס: הכנת חלבון, חיסון בעלי חיים איתור נטרול

בנוהל זה מוכן חיסון רקומביננטי המבטא את חלבון ה-RBD של SARS COV, ויכולתו להשרות פעילות ניטרול נגד פסאודו-וירוס של SARS מוערכת. ראשית, חלבון ה-RBD מובטא ומבודד מנוזל העל של תרבית תאי 2 9 3 T שעברו טרנספקציה. החלבון המבודד משמש לאחר מכן לצורך חיסון.

עכברים ונסיובים נאספים מהעכברים המחוסנים בנקודות זמן שונות לאחר החיסון כדי לכמת את פוטנציאל הנטרול של הנסיובים החיסוניים. מבוצע מבחן נטרול של פסאודו-וירוס, כאשר פסאודו-וירוס של sars המבטא לוסיפרז המיוצר באופן רקומביננטי מופק ומודגרה עם נסיוב עכבר שעבר טיטראציה. לאחר מכן, נבדקת יכולתם של וירוסים אלו, לאחר נטרול, להדביק תאים המבטאים את ACE, הקו-רספטור של SARS, על ידי מדידת הפעילות היחסית של הלוסיפרז בתאים המודבקים.

ניתן לחשב כעת את titer של נוגדנים מנטרלים ב-50%. שמי tu. אני כעת פוסט-דוקטורנט במעבדה.

היתרון המרכזי של בדיקת נטרול באמצעות פסאודו-וירוס על פני טכניקות קיימות, כגון בדיקות נטרול המבוססות על וירוס חי, הוא שטכניקה זו בטוחה יחסית. היא אינה דורשת וירוס SARS זיהומי וניתן לבצעה במעבדה שאינה ברמת בטיחות 3 (BSL-3). מי שתדגים את הפרוצדורה היא Laying Due, ש-Due היא פוסט-דוקטורנטית במעבדתי המתמקדת בפיתוח חיסונים נגד מחלות זיהומיות מתהוות כגון SARS ושפעת. הפשיר אלקווטים של בופר 2X HBBS סטרילי ב-pH 7, CaCl₂ 2.5 M, ופלסמיד RBD בטמפרטורת החדר.

לאחר הפשרת התמיסות, העבירו 2 milliliters של 2 XHBS למבחנה קונית של 50 milliliters; במבחנה של 15 milliliters ערבבו 200 microliters של calcium chloride עם 40 micrograms של פלסמיד RBD. השלימו את הנפח ל-2 milliliters באמצעות מים מזוקקים סטריליים בטמפרטורת החדר, בעזרת פיפט סטרילית של 5 milliliters. הוסיפו את תמיסת הפלסמיד ל-2 XHBS בטפטוף, תוך שמירה על ערבוב רציף אך עדין באמצעות vortex.

שמירה על ערבוב סיבובי (vortex) איטי ורציף היא קריטית להשגת משקע בעל עקביות נאותה לצורך יעילות טרנספקציה גבוהה. אחסנו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר אינקובציה זו, הוסיפו את התערובת טיפה אחר טיפה לבקבוק המכיל תאי 2 9 3 T במצב של 50% עד 70% התלכדות (confluency).

בנפח של 40 milliliters של מצע לתרבית תאים, חשוב לפזר את תמיסת הטרנספקציה באופן שווה. ערבבו את המצע מיד לאחר הוספת תערובת הטרנספקציה. הניחו את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בתוך אינקובטור עם 5% carbon dioxide.

לאחר שמונה עד 10 שעות של דגירה, יש להסיר את מצע התרבית המלא ולהחליפו ב-50 milliliters של מצע Optimum fresh serum free, כדי למנוע הפרעה של סרום בתהליך טיהור החלבון העוקב, ולאחר מכן להחזיר את התאים לדגירה ב-37 degree Celsius. לאחר יומיים יש לאסוף את העלייה (supernatant), המכילה את חלבון ה-RBD שהובע, ולצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-6,000 RPM כדי להסיר שאריות תאים. לאחר ששקיעת התאים הושלמה, יש להעביר את העלייה למבחנה נקייה ולהוסיף תערובת מעכבי פרוטאז (protease inhibitor cocktail).

כדי למנוע דגרדציה של חלבונים, השתמש ב-nickel NTA super flow בהתאם להוראות היצרן כדי לטהר את חלבון ה-RBD הרקומביננטי מהעליון שנאסף. בצע אלוציה (elute) של חלבון ה-RBD באמצעות באפר המכיל 250 millimolar ole. לאחר מכן, באמצעות מבחנות Emon Ultra 15, רכז את החלבון המטוהר המכיל OLE על ידי סבוב ב центריפוגה במהירות של 3000 RPM בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius למשך כ-15 דקות. השלף את הנוזל שעבר סינון (flow through).

הוסיפו PBS למבחנות הריכוז של ה-RBD וסובבו שוב בצנטריפוגה במהירות של 3000 RPM בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. חזרו על השטיפה פעמיים. כדי להבטיח הסרה מלאה של כל השאריות, המיסו כעת את החלבון המטוהר ב-PBS והעבירו את החלבון באמצעות פיפט למבחנה נקייה של 1.5 מיליליטר מסוג Eppendorf.

לבסוף, חשבו את ריכוז החלבון המטוהר באמצעות NanoDrop תוך שימוש ב-PBS כביקורת (blank), ואחסנו את הדגימה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. ראשית, הוסיפו 1 mL של PBS סטרילי למבחנה אחת של מערכת העזר (adjuvant system) של Sigma. חממו מראש במקלחת במעלה של 40 עד 45 מעלות צלזיוס וערבבו את המבחנה היטב במערבל Vortex למשך שתיים עד שלוש דקות.

בשלב הבא, הכינו את אמולסיית העזר החלבונית במבחנה מסוג einor בנפח 1.5 מיליליטר. ערבבו את הכמות הרצויה של חלבון מנוקה שהופשר ומדולל ב-PBS עם נפח שווה של מערכת עזר (adjuvant system) וערבבו ב-vortex בעוצמה במשך שתי עד שלוש דקות. כמו כן, הכינו אמולסיות ביקורת על ידי ערבוב של חומר העזר עם PBS בלבד. בהזרקה תת-עורית.

הזריקו לפחות לחמישה עכברי BC בני ארבעה עד שישה שבועות 200 microliters של תערובת החיסון הראשונית המכילה 20 micrograms של חלבון למנה, או את אמולסיית הביקורת, תת-עורית ביום ה-21 לאחר ההזרקה הראשונית. הזריקו מנות דחף המכילות 10 micrograms של חלבון בנפח סופי של 200 microliters לכל מנה. אספו דגימות דם מכל עכבר לפני החיסון הראשוני ו-10 ימים לאחר כל חיסון, ואחסנו את הסרום המבודד בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius לאחר חימום.

נטרול המשלים בטמפרטורה של 56 °C למשך 30 דקות, 16 שעות לפני הטרנספקציה. זרע תאי 293T בצלחות תרבית רקמה של 100 מילימטר בצפיפות של 2 מיליון תאים לצלחת. הכן את ריאגנט הטרנספקציה כפי שתוכננ קודם לכן, ובצע קו-טרנספקציה לתאים עם פלסמיד המקודד לחלבון S של SARS-CoV ופלסמיד נוסף המקודד לגנום HIV-1 המבטא לוסיפראז עם פגם ב-ENV. שמונה עד 10 שעות לאחר הטרנספקציה.

החלף את המצע ב-10 milliliters של מצע DMEM טרי המכיל 10% serum ולאחר מכן החזר את התאים לאינקובטור. לאחר יומיים, אסוף את העלייה (supernatant) המכילה את ה-SARS pseudo virus. העבר את העלייה דרך מסנן מזרק של 0.45 micron כדי להסיר שיירי תאים וחלק את הנגיף לאליקוטות.

יש להשתמש מיד או להקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לשימוש עתידי באמצעות פלטת פיפט רב-ערוצית. יש לזרוע תאי 293T המבטאים את הקולטן ACE2 של SARS-CoV בפלטת תרבית רקמות בעלת 96 בארות בריכוז של 10,000 תאים ל-100 µL לבארה, ולהדגיר את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. השתמש בפלטת 96 בארות נפרדת כדי לבצע טיטרציה של פסאודו-וירוס SARS המבטא לוסיפראז רקומביננטי, וקבע את ריכוז הנגיף המתאים לבדיקת הניטרול בשורות A ו-B בפלטה הראשונה.

150 µL למבב של 10% F-B-S-D-M-E-M. לאחר מכן, הוסף 150 µL של נגיף לא מדולל לשורות A1 ו-B1, ובצע דילול סדרתי כפול בשכפול על ידי העברה של 150 µL מהמבבבים בשורה הראשונה למבבבים בשורה הבאה וכן הלאה עד שורה 11. השלך את 150 µL האחרונים ואל תוסיף נגיף לשורה 12.

לאחר ביצוע המיהול הסידורי ודגירה של תאי ACE 2 93 במשך 16 שעות, הדביקו את התאים על ידי העברה של 100 µL מכל באר בלוחית הנגיף לבאר המתאימה בלוחית המכילה את התאים. דגרו את התאים למשך יומיים בטמפרטורה של 37 °C כדי לאפשר לנגיפים להדביק את התאים. קבעו את רמת ההדבקה בכל באר באמצעות קריאת הלוחית בלומינומטר ultra 3 84.

מידת הזיהום פרופורציונלית לעוצמת הפעילות של הלוקיפראז. בריסוק הניטרול ייעשה שימוש בריכוז הנגיף שבו יחידת הלוקיפראז היחסית גדולה בכ-אלף פעם מ-RLU הרקע של התאים לבדם בעמודה 12. הגדירו את הניטרול בפלטה נפרדת של 96 בארות, תחילה באמצעות פיפט רב-ערוצי, על ידי הוספת 150 µL של 10%F-B-S-D-M-E-M לבארות בעמודה הראשונה ו-120 µL לבארות בעמודות האחרות.

בשלב הבא, העבירו שלוש מיקרוליטרים של כל סרום עכבר לבדיקה לשני בארות כפולות בעמודה הראשונה. בדוגמה זו, שתי הבארות הראשונות מכילות סרום מהול פי 50 מעכבר שחוסן ב-RBD. שתי הבארות הבאות מכילות סרום מעכבר שני שחוסן ב-RBD, וארבע הבארות האחרונות מכילות סרום משתי חיות ביקורת שחוסנו ב-PBS. באמצעות פיפט רב-ערוצי, בצעו דילול סדרתי פי 5 של הסרום על ידי העברת 30 מיקרוליטרים מכל הבארות בעמודה הראשונה לבארות בעמודה השנייה, וחזרו על פעולה זו עד לעמודה 11.

שפכו את 30 microliters הנותרים והשאירו את הבארים בעמודה 12 ללא סרום. לאחר מכן, הוסיפו לכל באר 120 microliters של פסאודו-וירוס SAR מדולל. הדגירו את הפלטה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה אחת כדי לאפשר לנוגדני anti RBD בסרום של העכבר להיקשר ולנטרל את הפסאודו-וירוס של SARS.

לאחר דגירה זו, העבירו 100 µL של וירוס מנוטרל מכל באר לבארים המתאימות בלוחית 96 בארות המכילה תאי 2 9 3 T המבטאים ACE two. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות כדי לאפשר הדבקה. לאחר הדבקת התאים, הסירו את התווך באמצעות פיפט רב-ערוצי והחליפו אותו ב-100 µL של תווך טרי לכל באר.

החזיר את הפלטה לאינקובטור למשך 72 שעות ב-37 degrees Celsius. שוב, הסר את הנוזל העליון באמצעות פיפט רב-ערוצי. בנקודה זו, כל pseudo virus שלא נוטרל על ידי סרום העכבר אמור היה להיות מסוגל להדביק תאים. הוסף 60 µL לכל באר של ריאגנט לליזיס של תרבית תאי luciferase.

הניחו את הפלטה על שייקר בטמפרטורת החדר ואפשרו לתאים לעבור ליזיס במשך שעה עד שעתיים. לאחר סיום הליזיס של התאים, העבירו 50 µL של ליזאט תאים לפלטה של לומינומטר בעלת 96 בארות והוסיפו 50 µL של מצע ללוציפראז לכל בארה. השתמשו בלומינומטר ultra 3 84 המוגדר למצב לומינסנציה בפלטות של 96 בארות כדי לקרוא את הפלטה ולהעריך את פעילות הלוציפראז היחסית בבארות השונות, ממנה ניתן להסיק את אחוז הנטרול של הווירוס.

נתונים אלה מראים כי אחוז נטרול הנגיף שהושג פרופורציונלי לריכוז הסרום מעכברים שחוסנו ב-RBD. לעומת זאת, סרום מבעלי חיים שהוזרק להם PBS אינו מצליח לנטרל את הנגיף בכל ריכוז לפי נתונים אלה. ניתן לגזור בקלות את ה-NT 50 או את תיתור הסרום שבו 50% מהנגיף מנוטרל.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שביטחון וסבלנות הם חיוניים להצלחת הניסויים. לאחר צפייה בסרטונים אלה, תהיה לכם הבנה טובה יותר לגבי אופן הביטוי של חיסון SARS רקומביננטי בתרבית תאי maman, וכיצד לקבוע את היכולת להשרות תגובת נוגדנים מנטרלים במודלים של עכברים.