Name: גילוי Metalloproteinases מטריקס פונקציונלית על ידי Zymography (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: גלה פעילות מטריקס מטלופרוטאינאזים (MMPs) בדגימות ביולוגיות באמצעות זימוגרפיה. שיטה זו מאפשרת זיהוי כמותי של אנזימים בתרביות תאים או נוזלי גוף לחקר תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד&quot;ר ס &#39;רסלר (המחלקה לביולוגיה מולקולרית תאית, ביילור לרפואה) עבור מציע את השימוש של ריכוז החלבון כדי להגביר את ריכוז MMPs ב supernatants תרבית תאים. פרויקט זה נתמך על ידי מענקים מקרן קליפורד הגברת אלדר גרהם הלבן מחקר נתרמו ואת NIAMS NIH / (AR059838) ל CB. התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של NIH.

1. טוען והפעלה של ג'ל האלו ורה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הדגימות חייב להיות מוכן כראוי כדי לשמור על תפקוד האנזימים בשימוש מיד לאחר איסוף או מאוחסנים קפוא ב -80 ° C. דוגמאות לא חייב להכיל סוכני צמצום (כגון β-mercaptoethanol) או להרתיח לפני טעינת ג'ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את שקיק המכיל ג'ל בתוך קלטת, יש לשטוף את הקלטת עם מים deionized. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסרט המגן מהחלק התחתון של הקלטת ואת מסרק מהחלק העליון של הג'ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים בארות עם חיץ ריצה (מדולל במים כדי 1X deionized). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הג'ל לתוך תא ה-Mini-, להבטיח כי הצד קטן יותר של קלטת הפנים פנימה. נעל למקום עם וודג את המתח ג'ל. ה-Mini-Cell מאפשרת להריץ אחד או שניים ג'לים במקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את החדר העליון (בפנים) עם חיץ 1X פועל מעל פני בארות, לבדוק אם קיימת דליפה כלשהי. במקרה של דליפה, להסיר את החיץ למקם את הג'ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את החדר התחתון עם חיץ 1X פועל. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 10 μL של חלבון סמן מולקולרי אחד טוב. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב כמות שווה של חיץ ג'ל העמסה של מדגם לטעון לתוך הבארות של ג'ל בעזרת ג'ל טעינת טיפים (השתנה בין כל דגימה). בארות אלה יכולים להיות עמוסים עד לסך 20 μL. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המכסה על תא ה-Mini-ולחבר את מיתרי אלקטרודה לאספקת חשמל. החלף את אספקת החשמל על ולהגדיר אותו לרוץ 125 V קבוע במשך 90 דקות. בדוק את היווצרות של בועות קטנות על חוט של החדר התחתון, המציין במחזור הנוכחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת הרצת הג'ל הראשון שלך, לעקוב אחר ההתקדמות של הגירה כל 15 דקות, באמצעות כחול bromophenol כלול למאגר טעינת אינדיקטור. תנו לרוץ ג'ל עד צבע אינדיקטור מגיע לתחתית הג'ל. </li></ol> 2. Renaturing ופיתוח ג'ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל ג'ל, להכין 100 מ"ל של חיץ 1X renaturing ו -200 מ"ל של denaturing חיץ, הן מים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר צבע bromophenol מעקב כחול מגיע לתחתית הג'ל, לעבור את אספקת החשמל כבוי, לפתוח את תא מיני, ולהסיר את הג'ל. הפרד את שני הצדדים של הקלטת באמצעות סכין ג'ל (או מרית במשקל). גזור פינה כדי לסמן כיוון של ג'ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את הג'ל מתוך קלטת והמקום לתוך מיכל עם חיץ renaturing 100 מ"ל. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוצץ renaturing ולהוסיף 100 מ"ל של פיתוח המאגר על הג'ל. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוצץ בפיתוח להוסיף 100 מ"ל יותר חיץ מתפתחות הג'ל. דגירה לילה (16-18 שעות) בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוצץ בפיתוח לשטוף שלוש פעמים (5 דקות כל אחד) עם מים deionized תחת תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את הג'ל להציל את המיקום המדויק של להקות תקן חלבון כפי שהם יהיו פחות או אינם גלויים לאחר צביעת הג'ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם ג'ל על ידי הוספת 20 מ"ל של SimplyBlue Safestain על הג'ל. דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את SafeStain SimplyBlue ו-de הכתם ג'ל 100 מ"ל מים או deionized יותר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת תוצאות טובות יותר, להחליף מים deionized דגירה טרי עוד שעה או יותר בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה. </li></ol> 3. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את הג'ל מהמים ומניחים מגן יריעת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את הג'ל עם רזולוציה של 300 dpi ומעלה. שמור את התמונה בפורמט TIFF (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת עוצמות הלהקה עם ImageJ (או תוכנה דומה אחרת). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ TIFF ב ImageJ (איור 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו בשחור לבן על ידי בחירת "תמונה&gt; סוג&gt; 8 סיביות" (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלי בחירה מלבני מתאר את הלהקה הראשונה, ציור מלבן לפחות פעמיים גבוה יותר מאשר זה הוא רחב (זוהי דרישה תוכנה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש "1" או לבחור "נתח&gt; ג'ל&gt; בחר מסלול ראשון" הלהקה יפורטו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלבן חדש יופיע, להעביר אותה הלהקה בא ונבחר "נתח&gt; ג'ל&gt; בחר בנתיב הבא". חזור על הפעולה עד שכל הלהקות שנבחרו (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצו על "3" או לבחור "נתח&gt; ג'ל&gt; נתיבי מגרש" כדי ליצור את העלילה פרופיל עבור כל הלהקה (תרשים 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הבחירה בקו ישר (צריך להיות כבר נבחר אוטומטית) כדי לצייר קווים בסיס כך שיא של עניין הוא אזור סגור לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו בכלי מטה ולחץ בתוך כל שיא כדי לבחור בו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר "נתח&gt; ג'ל&gt; פסגות לייבל" להשיג שולחן עם אזור השיא עבור כל נבחרת. נתונים אלה ניתן להתוות ככזה (F1D igure) או יכול להיות מנורמל לערך של הלהקה שנבחר. נורמליזציה זה חשוב במיוחד כאשר איחוד ערכים ג'לים לשכפל מספר כדי לקבוע מובהקות סטטיסטית של התוצאות. </li></ul></li></ol> 4. נציג תוצאות אנחנו מראים ג'ל עם 11 בארות עמוסה שונה תרבות supernatants התא המכיל כמויות שונות של MMP-2 (איור 1 א). תצפית ישירה של ג'ל זה מראה הבדלים ברורים MMP-2 ריכוזים בין כמה בארות. לדוגמה, ברור כי בארות # 4 ו -5 מכילים הרבה יותר MMP-2 # 11 טוב יותר, או אפילו טוב # 10. עבור כימות אובייקטיבי של להקות השתמשנו צפיפות עם התוכנה ImageJ (איור 1B-D), המאשר את ההבדל כ -4 של פי MMP-2 כמויות בין טוב # 11 ובארות # 4 ו 5 ו כ -2 הפרש של פי MMP-2 כמויות בין טוב # 10 ובארות # 4 ו -5. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. איתור של MMP-2 על ידי zymography ג'לטין. התמונה, סרוקות של ג'ל ג'לטין. ובכן המספרים מצוינים בחלק העליון של הג'ל. B, ג'ל זהה המוצג בשחור לבן של צפיפות. הלהקה נבחרה עם כל מלבן ב ImageJ. C, שתי דוגמאות של פרופילים עבור צפיפות ג'ל המוצג A ו-B (להקות # 4 ו - # 11). קו ישר נמשך בבסיס שיא כל ליצור שטח סגור. ד ', מגרש האזורים השיא ג'ל המוצג נורמליזציה A ו-B (מימין) לפני (משמאל) לאחר לצפיפות של הלהקה מס' 1. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. נתון זה מדגים כיצד zymography יכול לשמש טכניקה וכמותיות. יש לנו טעון דילולים סדרתי (מדרגות 01:01 דילולים) ב -7 בארות רצופים מדדו את צפיפות הלהקה הן הפרו MMP-2 ו - MMP-2.

<ol><li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+the+morphogenesis+of+the+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex.</a> Cerebellum. 4, 239-245 (2005).</li>
<li>Pasternak, B., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloproteinases+and+their+inhibitors+-+diagnostic+and+therapeutic+opportunities+in+orthopedics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthop%22%5BJournal%5D)">Metalloproteinases and their inhibitors - diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics.</a> Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).</li>
<li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases%3A+regulators+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li>
<li>Lagente, V., Boichot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+matrix+metallopreoteinases+in+the+inflammatory+process+of+respiratory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).</li>
<li>Rodríguez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metallopreoteinases%3A+what+do+they+not+do%3F+New+substrates+and+biological+roles+identified+by+murine+models+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).</li>
<li>Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+%28MMPs%29+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+%28TIMPs%29%3A+positive+and+negative+regulators+in+tumor+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion.</a> Semin. Cancer Biol. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochem. , 102-196 (1980).</li>
<li>Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+matrix+metalloproteinases+%28MMPs%29+activities%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review.</a> Biochimie. 87, 265-272 (2005).</li>
<li>Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Biotechniques. 38, 73-83 (2005).</li>
<li>Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+activity+assays%3A+importance+of+zymography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).</li>
<li>Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+zymography%3A+detection+of+pictogram+quantities+of+gelatinases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases.</a> Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).</li>
<li>Yu, W. H., Woessner, J. F. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-enhanced+zymographic+detection+of+matrilysin+and+collagenases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases.</a> Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנחנו הדגימו כיצד לבצע ניתוח zymographic של MMP-2 ב supernatants תרבית תאים. כמות המדגם כדי לטעון את הג&#39;ל צריכה להיקבע באופן אמפירי בהתאם למקור ו MMP ​​של עניין. טעינת מעט מדי ימנע גילוי בעת טעינת מדי עלול להוביל הרוויה כפי שיש כל כך הרבה רק המצע פרוטאז יכולים לעכל באזור של הלהקה. במידת הצורך, את המדגם יכול להיות מדולל במים deionized לפני ערבוב עם חיץ העמסה או הזמן לפתח יכולות מופחת דה מן לילה עד 4 שעות. אפשר גם לרכז חלבונים בתמיסה באמצעות ריכוז (למשל קטלוג Millipore # UFC803024). אם להקות להישאר בקושי נראה, זה עשוי להיות נחוץ כדי לפתח את הג&#39;לים לתקופה ארוכה של זמן, אפילו עד 48 שעות. בעת הכנת דגימות supernatants בתרבית רקמה, יש לציין כי בסרום שור העובר (וסרה אחרים) מכיל MMPs שיכולים להשפיע על התוצאות. מסיבה זו, אנו אוספים את כל supernatants שלנו לאחר התרבות בינוני בסרום חינם. שוטף המתוארים בסעיפים 2.9 ו - 2.10 של פרוטוקול נחוצים כדי להסיר את הרקע מכתים של להקות מעוכל. פעמים לשטוף ארוכים תסיר את הרקע יותר, אבל יהיו גם כתמים עמומים של המצע לאורך הג&#39;ל. אם כבר לשטוף פעמים יש צורך, מומלץ לסרוק את הג&#39;ל כל כמה שעות כדי לבחור את הסריקה עם ניגודיות את הטוב ביותר. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לזהות MMPs אחרים. לדוגמה, MMP-9 ניתן להבחין על ג&#39;לים ג&#39;לטין, וגם במידה נמוכה MMP-1, MMP-8, ו - MMP-13 כמו ג&#39;לטין אינו המצע המועדף עליהם. MMP-1 ו - MMP-13 מזוהים הטוב ביותר zymography קולגן תוך קזאין הוא המצע המועדף MMP-11 וגם מאפשר זיהוי של MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12, ו - MMP-13 9. MMP-7 (matrilysin) ו collagenases (MMP-1 ו - MMP-13) קשה לזהות כאשר נוכח רמות נמוכות של קזאין או ג&#39;לים ג&#39;לטין. תוספת של הפרין המדגם בזמן הטעינה ג&#39;ל משפר באופן משמעותי את גבול הגילוי של MMP-7. עבור MMP-1 ו-MMP-13, הפרין צריך להוסיף ג&#39;ל לאחר ריצה electrophoretic כבר בעיצומן 12. מאז zymography אמצעים הפעילות האנזימטית לאחר denaturation ו renaturation של אנזימים, זה יהיה למדוד את הפעילות של כל MMPs הנוכחית במדגם. זה כולל אנזימים, הפרו אנזימים, ואנזימים חייב מעכבי אנדוגני (למשל TIMP-2). זה אפשרי אך כדי לקבוע את רמת ההפעלה MMP במדגם על ידי השוואת צפיפות הלהקה של האנזים פעיל מזה של הפרו האנזים, אשר יהיה בעל משקל מולקולרי גבוה מעט יותר. Zymography הוא לעתים קרובות לא מספיק כדי לזהות MMP. השוואה של רמת ההגירה של MMP עם ידוע סטנדרטים משקל מולקולרי עוזר בזיהוי אך יש לציין כי חלק תקנים אלה מכילים סוכן צמצום וכי כאשר נעשה שימוש תחת אי - הפחתת התנאים הם עשויים להצביע משקולות מולקולריים שונים 9. אופציה היא לטעון MMP מסיס רקומביננטי על ג&#39;ל זהה דגימות הבדיקה. MMPs עשויה להיות קשורה אך עם חלבונים אחרים, גרימת שינוי משקל מולקולרי לעין. מעכבי MMP סלקטיבי ניתן להוסיף ג&#39;ל (או חלק לחתוך ג&#39;ל במחצית) במהלך הדגירה של חיץ ככלים לפיתוח תרופתי זהות MMP של הטכניקה interest.A השני (המערבי כתם, immunocytochemistry, או ELISA) מומלץ עזרה בזיהוי של MMP של עניין. יצוין, כי מגבלות זיהוי כתמים המערבי הם לעתים קרובות נמוכים בהרבה מאלה של ג&#39;לים zymographic, שעלול כדי שווא שלילי תוצאות בעת שימוש בטכניקה זו.

<table><tbody><tr><td>מכשיר אלקטרופורזה Xcell SureLock Mini-Cell CE mark</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח (דגם 302)</td><td>VWR international</td><td>93000-744</td><td></td></tr><tr><td>ג'לים לזימוגרמה Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells</td><td>Invitrogen</td><td>EC61752BOX</td><td></td></tr><tr><td>בופר טעינה לג'ל Blue Juice</td><td>Invitrogen</td><td>10816015</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לטעינת ג'ל</td><td>VWR international</td><td>53509-015</td><td></td></tr><tr><td>סולם משקלי מולקולרי של חלבונים</td><td>Invitrogen</td><td>LC5800</td><td></td></tr><tr><td>בופר הרצה Novex Tris-Glycine-SDS</td><td>Invitrogen</td><td>LC2675</td><td></td></tr><tr><td>בופר רנטורציה לזימוגרמה Novex zymogram renaturing buffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC2670</td><td></td></tr><tr><td>בופר פיתוח לזימוגרמה Novex zymogram developing buffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC2671</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>סורק תמונות Epson Perfection 4490 Photo Scanner</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ImageJ</td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/</td><td>n/a</td><td>נכתב על ידי W. Rasband, NIH/NIMH</td></tr></tbody></table>

גילוי metalloproteinases מטריקס פונקציונלית על ידי zymography

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Metalloproteinases מטריקס (MMPs) הם אבץ המכיל endopeptidases. הם לבזות חלבונים על ידי המחשוף של אג&quot;ח פפטיד. יותר מעשרים MMPs זוהו מופרדות לשש קבוצות על בסיס המבנה שלהם ואת המצע סגוליות (collagenases, gelatinases, סוג קרום [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, ואחרים). MMPs לשחק תפקיד קריטי בפלישה התא, השפלה סחוס, שיפוץ רקמות, ריפוי פצעים, ועל העובר. לכן הם להשתתף בשני תהליכים נורמליים בפתוגנזה של מחלות רבות, כגון דלקת מפרקים שגרונית סרטן, או מחלת ריאות חסימתית כרונית 1-6. כאן נתמקד MMP-2 (gelatinase, סוג IV collagenase), MMP ביטוי נרחב. אנו מדגימים כיצד לזהות MMP-2 ב supernatants תרבית תאים על ידי zymography, נפוץ, טכניקה פשוטה, ובכל זאת מאוד רגיש שתוארה לראשונה על ידי ג Heussen ו EB דאודל 7-10 בשנת 1980. טכניקה זו היא חצי כמותית, ולכן הוא יכול לשמש כדי לקבוע רמות MMP בדגימות מבחן כאשר הריכוזים הידועים של MMP רקומביננטי נטענים על ג&#39;ל אותו 11. פתרונות המכיל MMPs (למשל תרבית תאים supernatants, שתן, או בסרום) נטענים ג&#39;ל polyacrylamide המכיל נתרן גופרתי dodecyl (SDS, כדי linearize את החלבונים) ו ג&#39;לטין (המצע של MMP-2). חיץ מדגם נועד להגביר צמיגות מדגם (כדי להקל על טעינת ג&#39;ל), לספק צבע מעקב (כחול bromophenol; לפקח הגירה לדוגמה), לספק מולקולות denaturing (עד linearize חלבונים), וכן לשלוט על ה-pH של המדגם. חלבונים מותר אז להעביר תחת זרם חשמלי במאגר ריצה נועד לספק קצב העברה קבוע. המרחק של הגירה היא בקורלציה הפוכה עם משקל מולקולרי של החלבון (חלבונים קטנים לנוע מהר יותר מאשר באמצעות ג&#39;ל חלבונים גדולים לעשות ולכן להגר בהמשך הג&#39;ל). לאחר ההגירה, הג&#39;ל מושם חיץ renaturing לאפשר חלבונים להחזיר מבנה שלישוני שלהם, הדרושים הפעילות האנזימטית. הג&#39;ל מושם אז חיץ בפיתוח נועד לאפשר פרוטאז לעכל את המצע שלה. המאגר מכיל גם בפיתוח p-aminophenylmercuric אצטט (APMA) כדי להפעיל את הלא proteolytic הפרו MMPs לתוך MMPs פעיל. הצעד הבא מורכב מכתים את המצע (ג&#39;לטין בדוגמה שלנו). לאחר שטיפת צבע עודף את הג&#39;ל, תחומי העיכול פרוטאז יופיעו להקות ברור. ברור הלהקה, מרוכז יותר פרוטאז שהוא מכיל. מכתים עוצמת בנד אז יכול להיות נקבע על פי צפיפות, באמצעות תוכנה כגון ImageJ, המאפשרות השוואה המדגם.

פרוטוקול זה מתאר assay פעילות מבוססי לאיתור metalloproteinases מטריקס supernatants תרבות או נוזלי גוף.

גילוי Metalloproteinases מטריקס פונקציונלית על ידי Zymography

מטריקס מטאלופרוטאינאזים (MMPs) הם אנדופפטידאזים המכילים אבץ. הם מפרקים חלבונים על ידי שבירה של קשרי פפטיד. יותר מעשרים סוגי MMPs כבר...

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות מטריקס מטאלופרוטאינזות (matrix metalloproteinases) פעילות. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הכנת הדגימה לזימטוגרפיה (zymography) באמצעות הוספת בופר טעינה נטול חומרי חיסור. לאחר מכן, ג'ל ג'לטין-זימוגרם נטען עם הדגימה ומופעל עד שצבע המעקב מגיע לקצה הג'ל.בעקבות האלקטרופורזה, הג'ל עובר דנטורציה חוזרת (renaturation), פיתוח, צביעה והסרת צבע. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא סריקת הג'ל לצורך ניתוח נתונים. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את הפעילות של matrix metalloproteinase בדגימות באמצעות ניתוח צפיפות הפסים.שלום, אני מהמעבדה של ד"ר Kristin Bitten במחלקה לפיזיולוגיה מולקולרית וביופיזיקה ב-LER College of Medicine. היום נדגים לכם פרוטוקול לזיהוי מטריקס מטלופרוטאינזות (matrix metalloproteinases) באמצעות זימות. אנו משתמשים בפרוטוקול זה במעבדתנו כדי לחקור מטריקס מטלופרוטאינזות המופרשות על ידי תאי מקור בתרבית.אם כן, נתחיל בלימוד. לפני תחילת פרוטוקול זה, הכינו את כל המטריקס מטלופרוטאינזים או ה-MMPs כראוי כדי לשמור על תפקוד האנזימים. ניתן להשתמש בדגימות באופן מיידי או לאחסנן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס.כאן נעשה שימוש ב-MMP two, הידוע גם כ-gelatinize A או קולגנאז מסוג 4, כדי להדגים ויזואליזציה של פעילות MP באמצעות זימוגרפיה. לאחר הכנת אנזימי ה-MMP, השג שקית ג'ל של gelatin zy gram בריכוז 10% המכילה ג'ל בתוך קסטה. שטוף את הקסטה במים דה-יונזים.הסיר את סרט ההגנה מתחת לקסטרה ואת המסרק מחלקו העליון של הג'ל. שטוף את הבארות שלוש פעמים עם Tris Glycine SDS running buffer.הנח את הג'ל למכשיר אלקטרופורזה מסוג mini cell, תוך הבטחה שהצד הקטן יותר של הקסטה פונה פנימה. נעל את הג'ל במקומו באמצעות טבעת קיבוע הג'ל (gel tension wedge). מלא את התא העליון של המכשיר בבופר הרצה tris glycine SDS עד לגובה שמעל הבארות, ובדוק שאין דליפות.מלאו גם את התא התחתון של מערכת האלקטרופורזה בג'ל בבופר ריצה. לאחר מכן, טענו 10 µL של סמן מולקולרי לחלבונים. ערבבו כמות שווה של הדגימה עם בופר טעינה לג'ל, שאינו מכיל חומרים מחזרים.בניגוד ל-SDS page רגיל, אין להרתיח את הדגימות ובמקום זאת יש להעמיס אותן ישירות לתוך בארי הג'ל. באמצעות טיפים להעמסת ג'ל, בארים אלו יכולים להכיל נפח של עד 20 µL. הנח את המכסה על התא המיני (mini cell) וחבר את כבלי האלקטרודות לספק הכוח.הפעילו את ספק הכוח והגדירו את הג'ל להרצה במתח קבוע של 125 וולט למשך 90 דקות. בעת הרצת הג'ל הראשון, בדקו את היווצרותן של בועות קטנות על תיל תא התחתון, המעידות על זרימת זרם. עקבו אחר התקדמות ההגירה מדי 15 דקות, כאשר ה-bromo phenol blue הכלול בתמיסת הטעינה משמש כאינדיקטור עבור כל ג'ל.הכינו 100 מיליליטר של תמיסת Rena buffer בריכוז one time xmo gram, ו-200 מיליליטר של תמיסת developing buffer בריכוז xmo gram, שניהם במים דה-יוניים. כאשר צבע המעקב ברומו-פנול כחול מגיע לתחתית הג'ל, כבו את ספק הכוח. פתחו את התא המיני (mini cell) והוציאו את הג'ל.הפרידו בין שני צדי הקסטרה. באמצעות סכין לג'ל, חתכו פינה אחת כדי לסמן את כיוון הג'ל. הוציאו בזהירות את הג'ל מהקסטרה והניחו אותו במיכל המכיל 100 milliliters של Rena Buffer.דגרו את הג'ל למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תוך כדי ניעור עדין, הסירו את באפר ה-Rena והוסיפו לג'ל 100 milliliters של באפר פיתוח. דגרו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תוך כדי ניעור עדין. לאחר מכן, הסירו את באפר הפיתוח והוסיפו לג'ל 100 milliliters נוספים של באפר פיתוח טרי.דגרו את הג'ל למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. לאחר הדגירה למשך לילה, הסירו את בופר הפיתוח ושטפו את הג'ל על ידי הדגרה במים דה-יוניים (deionized water) ותנועה עדינה. חזרו על שטיפה זו פעמיים, למשך חמש דקות בכל פעם, בטמפרטורת החדר.הניחו את הג'ל על גבי כיס ניילון להגנה והסִירו בועות. לאחר מכן, סרקו את הג'ל באמצעות סורק תמונות כדי לשמור את המיקום המדויק של פסי סטנדרט החלבון, שכן הם יהיו בקושי גלויים לאחר צביעת הג'ל.צבעו את הג'ל על ידי הוספת 20 milliliters של simply blue safe stain לג'ל. דגרו את הג'ל למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. תחת ערבול עדין, הסירו את ה-simply blue safe stain והסירו את הצבע מהג'ל ב-100 milliliters של מים דאיוניים בטמפרטורת החדר תחת ערבול עדין.לאחר שעה, החליפו למים דה-יוניים טריים והמשיכו לדגור את הג'ל למשך שעה אחת לפחות. כדי לנתח את הנתונים באמצעות ציטומטריה, הוציאו תחילה בזהירות את הג'ל מהמים והניחו אותו בתוך כיס פלסטיק שקוף. בעזרת סורק תמונות, סרקו את הג'ל ברזולוציה של 300 dots per inch או יותר.שמרו את התמונה בפורמט TIFF. פתחו את קובץ ה-TIFF בתוכנת Image J או בתוכנה דומה לכימות לצורך מדידת עוצמות הפסים. הציגו את התמונה בשחור-לבן על ידי בחירת סוג תמונה eight bit.השתמש בכלי הבחירה המלבני כדי להקיף את הפס הראשון, תוך ציור מלבן שגובהו לפחות כפול מרוחבו. בחר ב-analyze gels. בחר ב-first lane, והפס ייבחר.לאחר מכן יופיע מלבן חדש. העבירו אותו לפס הבא ובחרו ב-Analyze gels, ולאחר מכן בחרו ב-next lane. חזרו על תהליך זה עד שכל הפסים ייבחרו.בחר את "analyze gels plot lanes" כדי להפיק את גרף הפרופיל עבור כל פס. השתמש בבחירת הקו הישר כדי לסמן קווי בסיס, כך ששיא העניין יהיה שטח סגור לחלוטין. בחר בכלי המטה (wand tool) ולחץ בתוך כל שיא כדי לבחור אותו.בחרו ב-analyze gels ולאחר מכן ב-label peaks כדי לקבל טבלה עם השטח של כל פסגה שנבחרה. ניתן להציג נתונים אלו כפי שהם או לנרמל אותם לערך של פס רצועה נבחר. נורמליזציה זו חשובה במיוחד בעת איחוד ערכים ממספר ג'לים חוזרים כדי לקבוע את המובהקות הסטטיסטית של התוצאות.כל באר בג'ל המוצג כאן טוענה עם תרבית תאים שונה. סופינאט המכיל כמויות שונות של MMP 2. תצפית ישירה של ג'ל זה מראה הבדלים ברורים בריכוזי MMP 2 בין חלק מהבארים.לדוגמה, ברור כי הן באבור 4 והן באבור 5 יש ריכוז גבוה בהרבה של MMP 2 מאשר באבורים 10 ו-11, לצורך כימות אובייקטיבי של הפסים. נעשה שימוש בציטומטריה דחוסה באמצעות תוכנת Image J. תוכנה זו חשפה הבדל של פי ארבעה בקירוב ב-mmp.שתי כמויות בין, ובכן, בארות 11 ובארות ארבע וחמש. באופן דומה, נצפה הבדל של פי שניים בכמויות MMP2 בין באר 10 לבארות ארבע וחמש. אנו רק מראים לכם כיצד לזהות מדדים תפקודיים.שימור מתכת על ידי xog. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לא להרתיח את הדגימה. אחרת, לא ניתן יהיה לראות פסים כלשהם על הג'ל.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוי שלכם.

detection-of-functional-matrix-metalloproteinases-by-zymography

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במאמר זה נתאר את השימוש פינצטה מגנטיים ללמוד את ההשפעה של כוח על proteolysis האנזימטית ברמה של מולקולה בודדת באופן parallelizable ביותר.

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

בסרטון זה אנו מבצעים זימוגרפיה, טכניקה אלקטרופורטית, כדי לנתח את הפעילות הפרוטאוליטית בתוך דגימות ביולוגיות.

Zymography פפטיד פלואורסצנטי: טכניקה שונה לזיהוי פעילות פרוטאז באמצעות מצעים פלואורוגניים בג'ל זימוגרפיה

סרטון זה מדגים את טכניקת אלקטרופורזה של ג'ל זימוגרפיה כדי להעריך את הפעילות של מטלופרוטאזות מטריצה (MMPs) הקיימות בתרביות תא. ה-MMPs הפעילים מפרקים את המצע הספציפי ל-MMP המוטבע בג'ל פוליאקרילאמיד, המופיע כפסים שקופים על רקע מוכתם כהה לאחר הצביעה.

אלקטרופורזה של ג'ל זימוגרפיה: טכניקה אלקטרופורטית לזיהוי מטאלופרוטאזות מטריקס על ידי הערכת הפעילות האנזימטית

מדידת מסה מדויקת מייצגת צעד חשוב במהלך החקירה של חלבונים. desorption / יינון בסיוע מטריקס לייזר (MALDI) ספקטרומטריית מסה (MS) יכולה לשמש לקביעה כאמור והיתרון המרכזי שלו הוא הסובלנות למלחים, חומרי ניקוי וחומרים מזהמים. כאן אנו מדגימים גישה נגישה לניתוח חלבונים גדולים יותר מאשר על ידי MALDI-MS 100 kDa.

מטריקס בסיוע לייזר Desorption / יינון זמן של טיסה (MALDI-TOF) Mass ניתוח Spectrometric של חלבונים שלמים גדול מ100 kDa

פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין מטריצה ​​מעורבת 2D, המורכב של ג 'לטין קולגן אני, קולגן 3D אני תקע ללימוד invadosomes ליניארי. פרוטוקולים אלה מאפשרים את המחקר של היווצרות invadosome ליניארי, פעילות מטריקס השפלה, ויכולות הפלישה של תאים ראשוניים שורות תאים סרטניים.

2D ו 3D מטריצות לחקר Invadosome לינארי גיבוש ופעילות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבוע ירידה לפרטים פרוטאז ברקמת העכבר גולמי תמציות באמצעות ספקטרומטר MALDI-TOF.

קביעת כמות מועטת פרוטאז ברקמת העכבר של תמציות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף: מניפולציה PH כדי לגרום לשינויים ירידה לפרטים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור טכניקה שונה zymographic שבו ניאון פפטידים משמשים את המצע מתכלה במקום חלבונים מקורית. אלקטרופורזה של דגימות ביולוגיות בפפטיד פלורסנט zymograms מאפשר זיהוי של מגוון רחב יותר של פרוטאזות מאשר טכניקות zymographic הקודם.

זיהוי של פרוטאז פעילות על-ידי ניאון פפטידים Zymography

. הנה, פרוטוקול מוצג לבצע, culturing בתאי poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized עם fluorogenic מטריקס מטאלו-פרוטאינאז (MMP)-פפטיד מתכלה. MMP הסלולר ופעילות מטבולית נמדדים ישירות מן התרבויות הידרוג שימוש בקורא microplate סטנדרטיים.

מדידת הסלולר העולמי מטריקס מטאלו-פרוטאינאז ופעילות מטבולית Hydrogels תלת-ממד

טיהור התג שלו, דיאליזה, והפעלה מועסקים כדי להגדיל את התשואות של מסיס, מטריצה פעילה metalloproteinase-3 ביטוי חלבון תחום קטליטי בחיידקים. שברי חלבון מנותחים באמצעות ג'ל SDS-PAGE.

ביטוי חיידקי וטיהור של מטריקס אנושי Metalloproteinase-3 באמצעות כרומטוגרפיה זיקה

חלבונים חיוניים לפתוגנזה של חיידקים, ומאפשרים פלישה והתחמקות חיסונית. מיצוי חד-שלבי של חלבונים ציטופלזמיים וממברנה של חיידקים בצורתם הפעילה הוא מטריד. מאמר וידאו זה מדגים מיצוי של חלבונים תאיים שלמים של לפטוספירה לניתוח זימוגרפיה לאיתור ואפיון ג'לטינאזות.

מיצוי חד-שלבי וניתוח זימוגרפי של ג'לטינזות חיידקיות

גלה פעילות מטריקס מטלופרוטאינאזים (MMPs) בדגימות ביולוגיות באמצעות זימוגרפיה. שיטה זו מאפשרת זיהוי כמותי של אנזימים בתרביות תאים או נוזלי גוף לחקר תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

גילוי Metalloproteinases מטריקס פונקציונלית על ידי Zymography

גלה סרטונים נוספים