אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 2:43 דק׳ • March 31st, 2026
התחילו עם כליה של עכבר שנדבקה בחיידקים גרא-חיוביים מהונדסים שמתיישבים ברקמה ויוצרים נגעים.
כל תאי החיידקים מבטאים פלואורסצנציה אדומה, בעוד שתנאי מארח ייחודיים לנגע מאפשרים ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק בתאים מסוימים.
טפל בכליה עם קיבע ודגר בחושך כדי לשמור על מבנה הרקמה ולחדור חלקית לקרומי התאים.
הטמיעו את האיבר במדיום מתאים, הקפיאו אותו וחתכו אותו לפרוסות רקמה דקות.
הנח את הפרוסה על מגלש זכוכית טעון לצורך היצמדות.
צבעו את הרקמה בצבע גרעיני.
הצבע חודר לתאי המארח והחיידקים ונקשר ל-DNA.
הנח כיסוי מעל הרקמה וצפה בסלייד תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה באמצעות ערוצי הדמיה ספציפיים.
צביעה גרעינית מגדירה את ה-DNA המארח והחיידק.
כל החיידקים ברקמה מבטאים פלואורסצנציה אדומה, בעוד שביטוי פלואורסצנציה ירוק מציין את אתר האינטראקציה בין המארח לפתוגן.
בנקודת הניסוי המתאימה, אספו את הכליה, הלב, הכבד, הריאות והטחול לצינורות פוליפרופילן בנפח 15 מיליליטר המכילים 10% פורמלין מפופר לדגירה של 24 עד 48 שעות בחושך בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין או סיבוב.
בסיום הקיבוע יש להטמיע את האיברים במדיום הקפאת רקמות שקופות לאחסון בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. השתמשו בקריוסטט כדי להשיג קטעי רקמה בעובי 10 מיקרומטר ולייבש את החלקים על מחסניות זכוכית טעונות שננקו מראש למשך 20 דקות בחושך לפני יישום מדיום קשה עם תוספת DAPI. לאחר מכן הניח כיסוי ומקפץ את המגלשות בטמפרטורת החדר במהלך הלילה לפני העברת הדגימות לאחסון ארוך טווח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
כדי לזהות נגעים בתוך הדגימות, הניחו שקופית על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקלי סורק בלייזר והשתמשו במטרה מתאימה להצגת תאים בודדים כדי לצלם תמונות של הנגעים.