שינויים מורפולוגיים בהדמיית חיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה של תאים חיים

התחילו בתרבית חיידקים המשובצת מתחת ללוח אגרוז בקערת זכוכית.

ממברנות תאי החיידקים מסומנות בצבע פלואורסצנטי.

החיידקים גם מהונדסים לבטא RNA אנטיסנס שמכוון ל-mRNA ספציפי, ומעכב ייצור חלבון חיוני לחלוקת תאים.

הוסיפו טיפה של שמן טבילה למטרה של מיקרוסקופ הפלואורסצנציה הפוך.

הניחו את הצלחת בתוך מארז מתכתי וקבעו אותה על שלב המיקרוסקופ.

הרם את המטרה עד שהשמן נוגע בצלחת, ואז התמקד בתאים.

השתמש בתוכנת הדמיה כדי להגדיר ערימות Z ללכידת תמונות בעומקים שונים.

התחל לצלם תמונות טיים-לאפס פלואורסנטיות.

כאשר התאים מגיבים לביטוי ה-RNA האנטיסנס, הם לא מתחלקים ומפתחים צורות נפוחות.

ארגון הממברנה מופרע, מה שמוביל לפלואורסצנציה לא אחידה וממוקדת, שמעידה על חלוקה לקויה של התאים.

כדי לצלם את הדגימה, השתמשו בכפתור המיקוד הגס כדי לוודא שהמטרת מורדת במלואה לפני אתחול המיקרוסקופ בתוך תוכנת המיקרוסקופ. הנח טיפה של שמן בעל מקדם שבירה 1.517 במטרה לטבילה בשמן 100X, והעבר את הצלחת עם תחתית הזכוכית המכילה את הדגימה אל ארון המתכת.

החליק בעדינות את הצלחת לתוך מהדק הבמה, והשתמש בכפתור הכיוון הגס כדי להרים את האובייקטיב עד שהשמן נוגע בתחתית הזכוכית של הצלחת. השתמש בעינית ובכפתור הכיוון העדין כדי למקסם את הדגימה, ועבר למצב מצלמה. בתוכנת ההדמיה בחלון Resolve 3D, בחר בסמל Design/Run Experiment.

תיבת דיאלוג חדשה תופיע בשם Design/Run Experiment. פתח את לשוניות העיצוב והחתך בתיבת הדו-שיח כדי להגדיר את מספר ערימות ה-Z ועובי הדגימה. כדי למדוד את עובי התאים בדגימה, כוונן בהדרגה את מישור ה-Z באמצעות החצים למעלה ולמטה בתיבת הדו-שיח התלת-ממדית של Resolve (Resolve 3D), כך שהמקום שבו התאים יוצאים מהפוקוס הוא הגבולות העליונים והתחתונים של רכישת התמונה.

לאחר התאמת אחוז השידור של עוצמת האור ומשך החשיפה עבור הערוצים הנבחרים בתיבת הדו-שיח Resolve 3D, לחצו על רשימת נקודות כדי לפתוח את רשימת הנקודות. בלשוניות Design ו-Time Lapse, בחרו בתיבת הסימון Time Lapse והזינו את פרמטרי ה-timelapse. בחר באפשרות רשימת נקודות ביקור, והזן את הנקודות שיש לצייר בתיבת הטקסט, תוך הפרדת הנקודות בפסיקים או מקפים לרצפים שלמים.

לאחר מכן, ערוך את שמות הקבצים ומיקומי הקבצים בלשונית Run ובחר Play בתיבת הדו-שיח של Begin Experiment כדי להתחיל את הניסוי.