בדיקת עמידות לאתנול להערכת שלמות מטריצת הביופילם

קחו לדוגמה ביופילמים שמקורם בחיידקים פתוגניים שגדלו על אגר תזונתי.

הביופילם שלא טופל כולל חיידקים דחוסים בצפיפות בתוך מטריצה חוץ-תאית מגנה.

הביופילם המטופל במעכב כולל תאים קשורים באופן רופף בתוך מטריצה דלילה.

חצו כל ביופילם, ואז חשפו חצי אחד לבופר כבקרה, ואת החצי השני לאתנול כדי להפעיל לחץ אנטימיקרוביאלי.

בביופילם הלא מטופל והחשוף לאתנול, המטריצה הצפופה מפחיתה את דיפוזיית האתנול ומגבילה את חדירת התאים, מה שמוביל לפחות הרג חיידקים.

בביופילם המטופל במעכבים וחשופ לאתנול, המטריצה הדלילה מאפשרת לאתנול לחדור בקלות רבה יותר, מה שמוביל להריגת חיידקים מוגברת.

צנטריפוגה את הצינורות והסר את הסופרנטנט. הוסף בופר וסוניקט כדי לפזר את התאים.

ציפוי את התלייה המדוללת ודגרה כדי לאפשר צמיחת חיידקים חיים.

יחידות הקמת מושבות (CFUs); פחות CFUs מהביופילם המטופל במעכבים וחשופים לאתנול מאשרים כי שלמות המטריקס חיונית לעמידות לאתנול.

קח להב גילוח נקי וחתוך את מושבות הביופילם לשני חלקים שווים בעזרת התבנית. הרם בזהירות חצי מהמושבה עם מרית נקייה, והעבר אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר, המכיל 500 מיקרוליטר של PBS.

קח את החצי השני של המושבה והעבר אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל 500 מיקרוליטר של 50% אתנול. אלו ישמשו להערכת עמידות לסוכני עיקור. לאחר מכן, קחו גם את החצי הראשון של המושבה המטופלת ב-D-לוצין, והניחו אותה ב-PBS.

לאחר מכן, קח את החצי השני של המושבה הזו, והעבר אותו לאתנול. דגרו את כל הצינורות המכילים את חצאי הביופילם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. ואז, צנטריפוגה אותם במשך חמש דקות ב-18,000 כפול גרם.

באמצעות פיפט, הסר בזהירות את הסופרנטנט. הוסף 300 מיקרוליטר של PBS, ואז סוניקה את התאים במצב נמוך, עם מיקרוטיפ סוניקטור. הוסיפו 700 מיקרוליטר PBS נוספים לנפח סופי של מיליליטר אחד.

לאחר מכן, בצע דילול סדרתי של 10 למינוס שבע ב-PBS. קחו 100 מיקרוליטר מאחד הדילולים, והחסנו צלחת LB של 1.5% אגר. חזור על שלב זה עבור שני דילולים נוספים לכל דגימה.

מרחו את החיסון בעזרת חרוזי זכוכית, ואז דגרו את הצלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. בדוק את הלוחות וספר את יחידות יצירת המושבות, או CFU. לאחר חישוב ערך ה-CFU למיליליטר, חשב את אחוז הניצולים ב-PBS לעומת טיפולי אתנול.