המחשת לחץ חמצוני שנגרם על ידי פתוגן ב-C. elegans באמצעות SKN-1 מתויג GFP
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 3:12 דק׳ • March 31st, 2026
התחל עם שתי פלטות המכילות תולעי C. elegans המבטאות חלבון ירוק מסומן בפלואורסצנטי SKN-1, גורם שעתוק הממוקם בציטופלזמה של המעי. תולעים אלו מכילות גם גרגירי ליפופוסין במעי שמראים אוטופלואורסצנציה.
צלחת אחת מוזרעת בחיידקים לא פתוגניים כקבוצת הביקורת, והשנייה עם חיידקים פתוגניים כקבוצת הבדיקה.
בקבוצת הבדיקה, מי חמצן המיוצר על ידי הפתוגן גורם ללחץ חמצוני, הגורם להעברת SKN-1 לגרעיני המעי.
בקבוצת הביקורת, רוב SKN-1 נשאר מפוזר באופן מפוזר בציטופלזמה.
שטוף כל צלחת עם בופר והעבר את התולעים לצינורות.
צנטריפוגה להפרדת התולעים והסרת הבופר.
הוסף מדיום המכיל אזיד נתרן כדי להרדים אותם.
התקן את התולעים על כריות אגרוז, הנח משטחי כיסוי, וצפה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש באוטופלואורסצנציה כדי להמחיש את גבולות הגרעין.
אות SKN-1 גרעיני חזק בבדיקה, ביחס לאות הציטופלזמי המפוזר בבקרות, מצביע על מיקום גרעיני ומאשר לחץ חמצוני שנגרם על ידי פתוגנים.
באמצעות פיפטה, הוסף כ-100 זחלים L4 לכל לוחות עם זרעי STREPTOCOCCUS THY ו-NGM E.coli . השתמש בשלוש צלחות לכל זן חיידק.
דגרו את הצלחות במשך 2 עד 3 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את הצלחות מהאינקובטור. שטוף אותן עם M9W ואסוף את התולעים בצינורות חרוטיים של 15 מיליטר.
שטפו את התולעים שלוש פעמים כפי שעשו בעבר בשלב הצנטריפוגלי. להסיר את רוב ה-M9W לפי השאיפה. והו
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים