Name: שילוב של צבע lipophilic, באתרו, אימונוהיסטוכימיה ו היסטולוגיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: חקור שילוב של צבע lipophilic, הכלאה באתרו, אימונוהיסטוכימיה והיסטולוגיה לניתוח רקמת עכבר. שיטה זו מאפשרת מתאם בין מוטציות גנטיות לפרופילים מורפולוגיים וביטוי גנים בדגימה בודדת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

תמונות Confocal התקבלו באוניברסיטת איווה קארבר המרכז הדמיה. המימון ניתן על ידי מענק SBIR (MH079805) כדי לתמוך BF נוסף לגידול עכברים עבור פרויקט זה סופק על ידי NIDCD (5R01DC00559007) ל BF

<ol><li>Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+three-color+neuronal+tracing+in+fixed+tissue+using+NeuroVue+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes.</a> Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).</li>
<li>Tonniges, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-+and+bio-physical+characterization+of+novel+violet+and+near-infrared+lipophilic+fluorophores+for+neuronal+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing.</a> Journal of Microscopy. , (2010).</li>
<li>Bartheld, C. S. von, Cunningham, D. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+tracing+with+DiI%3A+decalcification%2C+cryosectioning%2C+and+photoconversion+for+light+and+electron+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis.</a> J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).</li>
<li>Gurung, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+embryonic+midbrain+thalamic+and+thalamic+auditory+connection+development+in+mice+as+revealed+by+carbocyannine+dye+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection.</a> J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).</li>
<li>Fritzsch, B., Nichols, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI+reveals+a+prenatal+arrival+of+efferents+at+the+differentiating+otocyst+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice.</a> Hear Res. 65, 51-60 (1993).</li>
<li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurod1+suppresses+hair+cell+differentiation+in+ear+ganglia+and+regulates+hair+cell+subtype+development+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea.</a> PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).</li>
</ol>

רקמה עכבר נאסף בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי האוניברסיטה של ​​טיפול בבעלי חיים איווה מוסדיים ועדת שימוש (ACURF 0,804,066).

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את השיטה לשלב ארבע טכניקות על מנת למקסם את איסוף הנתונים על ידי לכידות correlating נתונים בתוך חיים נתון (איור 3). גישה זו תפחית את כמות רבייה ולכן הזמן הדרוש כדי להשיג נתונים, תוך שיפור לפרסום מידע אודות לוקליזציה שיתוף ואפקטים המתאם של מוטציות. למרות עכברים עובריים נוצלו בעכבר הווידאו הזאת, מבוגרים, כמו גם בעלי חיים אחרים כגון עוף, xenopus, ואת דג הזברה ניתן לנתח באמצעות טכניקות אלה גם כן. בעת שימוש מינים אחרים העיכול proteinase k ייתכן שיהיה צורך לשנות. כאן אנו משתמשים בצבעים שונים NeuroVue fluorescing במיוחד כדי התווית עד שלוש אוכלוסיות נוירונים של עניין. היתרון של צבעים אלה היא שהם ניתן להשתמש בעכברים מוטנטים, אשר עשוי להיות בעייתי כאשר להסתמך רק על אימונוהיסטוכימיה כי עשויה או לא עשויה להיות מושפעת על ידי מוטציות להיות מנותח, והם תווית נוירונים retrogradely ו anterogradely 5. מחקר שנערך לאחרונה גדל גם מספרם של אוכלוסיות נוירונים שיכולים להיות מתויג בו זמנית לשישה 2. לאחר, לצבוע lipophilic מתווים את הרקמה באותו עניין אז יכול להיות מנותח משתמש הכלאה באתרו, לניתוח של שעתוק הגנים ניתן לנתח לאחר מכן באמצעות אימונוהיסטוכימיה להפצה חלבון. הניתוח האחרון ניתן להוסיף על ידי היסטולוגיה מפורט אשר יכול להוסיף ואפיון פנוטיפ 6. זה ניתוח multifactorial יש פוטנציאל תובנות חדשות באמצעות ניתוח המתאם בתוך החיה אותו שעלולים להיות סבירה אחרת או לפחות בצורך של פרוטוקולים יותר נרחב הרבייה העכבר.

<table><tbody><tr><td>&lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית בשימור (EM)&gt;in situ&lt;/em&gt; הibridiזציה:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת תמיסות שטיפה וחסימה PC DIG</td><td>קבוצת Roche</td><td>1585762</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת בופר 20x SSC מוכנה מראש</td><td>קבוצת Roche</td><td>1666681</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K בריכוז 20mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>דיאתיל פירוקרבונאט (DEPC) </td><td>Research Products International Corp.</td><td>D43060</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>דקסטראן סולפייט</td><td>Research Products International Corp.</td><td>D20020</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple </td><td>קבוצת Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Fragments של Fab של Anti-Dig-AP</td><td>קבוצת Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>אנזים RNase A בריכוז 10mg/ml</td><td>Fermentas</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Research Products International Corp.</td><td>7003</td><td></td></tr><tr><td>DNA מזרע סלמון 10 מג/מ"ל</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>יחידת סינון Stericup 0.22&amp;mu;מ'; 500 מ"ל</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>דיסקי סינון 0.2&amp;mu;מ'; 25 מ"מ</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>שקיות של תמיסת סלין buffered phosphate (PBS) ב-PH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>&lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית בשימור (EM)&gt;אימונוהיסטוכימיה:&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;צבע CHST</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>9460</td><td></td></tr><tr><td>&lt;מיקרוסקופ אלקטרונים במנח רחב (EM)&gt;היסטולוגיה:&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת Poly/Bed 812 Embedding Media/DMP-30 </td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08792-1</td><td></td></tr><tr><td>פרופילן אוקסיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110205</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת גלוטראלהיד 50%</td><td>Fisher Scientific</td><td>G151</td><td></td></tr><tr><td>חומר סגירה DPX</td><td>Fluka</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>רוקר (מכשיר לנעועה)</td><td>מידסיי (MidSci)</td><td>55D1114</td><td></td></tr><tr><td>בלוק חימום</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-715-125D</td><td></td></tr><tr><td>מערבל (Rotator)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור המכוון ל-60&amp;#x00B0;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;מיקרוסקופ אלקטרוני למשאיה (EM)&gt;מעקב באמצעות צבע:&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מספריים</td><td>Geuder</td><td>G-19775</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה עדינה</td><td>E.M.S</td><td>72680-F</td><td></td></tr><tr><td>צבע NeuroVue: בורדו, אדום, ג'ייד</td><td>MTTI</td><td>FS-100(1,2,6)</td><td></td></tr><tr><td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>טווח הניתוח</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור המוגדר ל-36&amp;#x00B0;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-506DQ</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica Microsystems</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות</td><td>Surgipath</td><td>00240</td><td></td></tr><tr><td>לוחיות כיסוי</td><td>Surgipath</td><td>00106</td><td></td></tr><tr><td>RPI</td><td>גליצרול</td><td>G22025-0.5</td><td></td></tr><tr><td>פראפורמלידהיד (4% ו-0.4%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td></td></tr></tbody></table>

שילוב של צבע lipophilic, באתרו</emהכלאה>, אימונוהיסטוכימיה ו היסטולוגיה

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

הולך מעבר פונקציה גן יחיד לחתוך עמוק יותר לתוך רשתות גנים רגולטוריים דורש מוטציות רבות בשילוב בעלי חיים אחת. ניתוח כזה של שניים או יותר מהגנים צריך להיות כהשלמה עם ב הכלאה באתרו של גנים אחרים, או אימונוהיסטוכימיה של חלבונים שלהם, גם כל האיברים המתפתח או חלקים רכוב לפתרון מפורט של השינויים ביטוי תאית רקמות. שילוב של שינויים גן מרובים מחייב שימוש cre או flipase כדי למחוק תנאי גנים ולהימנע הקטלניות עובריים. תוכניות רבייה חובה לשפר באופן דרמטי את המאמץ ואת העלות ביחס ישר במספר גנים שעברו מוטציה, עם תוצאה של חיות מעט מאוד עם הרפרטואר המלא של שינויים גנטיים הרצוי. Amortizing כמות עצומה של מאמץ וזמן כדי להשיג דגימות אלה יקר מעט, כי הם נושאים מוטציות רבות מחייב אופטימיזציה של רקמות. יתר על כן, חוקרת בעלי חיים אחד עם טכניקות מרובות מקלה לתאם המחיקה ליקויים גן עם פרופילי הביטוי. פיתחנו טכניקה כדי להשיג ניתוח מעמיק יותר של חיה מסוימת, את היכולת לנתח כמה מבנים לזיהוי בהיסטולוגיה שונים, כמו גם ביטוי גנים וחלבונים מן כל דגימה זהה בשני האיברים רכוב קטעים שלמים. אמנם בעכברים כבר נוצלו כדי להדגים את האפקטיביות של טכניקה זו הוא יכול להיות מיושם על מגוון רחב של בעלי חיים. לשם כך אנו משלבים lipophilic צבע העתקה, הר שלמה הכלאה אימונוהיסטוכימיה באתרו, ו היסטולוגיה כדי לחלץ את סכום מקסימלי אפשרי של נתונים.

שילוב של טכניקות שונות על מנת למקסם את איסוף הנתונים מרקמות העכבר מוצג.

כדי להעמיק מעבר לתפקוד של גן בודד אל תוך רשתות ויסות גנים, נדרשות מוטציות מרובות המשולבות בבעל חיים בודד. ניתוח כזה של...

מעבר לפונקציה של גן בודד וניתוח של רשתות ויסות גנטיים דורשים מוטציות מרובות בבעל חיים בודד. במערכת זו, אנו מבצעים אופטימיזציה לכמות הנתונים המופקים מרקמה בודדת כדי לבצע קורלציה בין מוטציות גנטיות לבין פרופילים מורפולוגיים ופרופילי ביטוי. דבר זה מושג תחילה על ידי הזרקת צבע ליפופי כדי להדמיא מספר אוכלוסיות נוירונליות נפרדות.היברידיזציה בסיטו (In situ hybridization) מבוצעת כדי להדמיות של הדפוס המרחבי-זמני של תמלילי גנים. בעוד שאימונוהיסטוכימיה משקפת דפוסים ספציפיים של ביטוי חלבונים, הממד הנוסף של חיתוך היסטולוגי תורם לאפיון הפנוטיפ. מערכת ניסויית משולבת זו מאפשרת לנתח מספר מבנים שונים הניתנים לזיהוי היסטולוגי, כמו גם ביטוי של גנים וחלבונים, וכל זאת מאותו דגימה הן בהכנות שלמים והן בחיתוכים, במערכת המשלבת מעקב באמצעות צבע ליפופילי, היברידיזציה בסיטו, אימונוהיסטוכימיה והיסטולוגיה.טכניקה זו ממקסמת את המידע המופק מדגימה בודדת תוך קורלציה בין המורפולוגיה לבין ביטוי של גנים וחלבונים עבור כל הדיסקציות והמניפולציות ברקמות. קבעו את בעלי החיים ב-4%paraldehyde בבופר פוספיהט 0.1 molar באמצעות פרפוזיה טרנס-קרדיאלית תוך שימוש במשאבות פריסטלטיות עם מחטים בגודל מתאים. מכיוון שה-DY רגישים לאור, אחסנו אותם במדור סגור וחשוך, וכדי למנוע זיהום צולב, הקצו סט נפרד של מכשירים לטיפול בכל צבע תחת מיקרוסקופ דיסקציה.קבעו את אתר יישום הצבע כדי לסמן באופן סלקטיבי את אוכלוסיית הנוירונים הנדונה ולא מבנים זרים אחרים. הסירו רקמות מיותרות כדי לאשר חזותית את האתר הנבחר ולאפשר גישה להנחת הצבע. כעת, גזרו את רצועות פילטר הצבע של ה-neuro view הטעונות מראש לחתיכות משולשות בגודל מתאים באמצעות מיקרו-מספריים.הקפידו לחתוך חתיכה קטנה ככל האפשר כדי למנוע סימון של מבנים אחרים בעת ההחדרה לרקמות רכות, כגון המוח באופן ישיר. הכניסו את המסנן באמצעות אחת מזוויות המשולש של המסנן כדי לחדור לרקמה. עבור רקמות קשיחות יותר, בצעו חתך כדי לאפשר החדרת D קלה יותר. אין להשתמש במחט דיסקציה כדי לדחוף את המסנן אל תוך הרקמה.הנח את הדגימות בתוך מבחנה סגורה היטב עם 4%para formaldehyde והדגר בטמפרטורה של 36 degrees Celsius בחושך למשך יומיים עד 14 ימים, בהתאם לגיל ולמרחק הדיפוזיה הנדרש. באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה עם epi fluorescence, ודא שהצבע התפשט עד למיקום הרצוי ובצע דיסקציה לרקמה הרלוונטית. בצע קיבוע של הדגימה על עלית זכוכית באמצעות glycerol לצורך דימות במיקרוסקופ קונפוקאלי.לאחר הדמיית העיניים הליפופיליות במיקרוסקופ קונפוקאלי, העבירו את הדגימות למבחנת Eppendorf של 2 ml נטולת RNase עם PBS נטול RNase כדי לשטוף את הגליצרול באופן שיטתי. עבדו את הדגימות בתהליך של דהידרטציה ורהידרטציה באמצעות סדרת מיתנול מדורגת בטמפרטורה של 4 °C. התחילו באינקובציה ב-100% methanol למשך שעה אחת לפחות והמשיכו בריכוזים יורדים עד ל-25% methanol למשך 15 דקות.שטפו שלוש פעמים ב-PBS בריכוז של פי 1 למשך חמש דקות בכל פעם. עובו את הרקמה באמצעות 2 µL של Stock proteinase K בריכוז 20 mg/mL בתוך 2 mL של PBS טרי. עקבו אחר תגובת העיכול על ידי השינוי בעכירות הרקמה, מעכורה לשקופה כמעט.כדי לעצור את עיכול האנזים, דגרו את הדגימות ב-4% para formaldehyde למשך חמש דקות. לאחר מכן, שטפו פעם אחת עם PBS למשך דקה אחת, ולאחר מכן בצעו שלושה שטיפות של חמש דקות כל אחת. השליכו את שטיפת ה-PBS האחרונה, תוך הקפדה מיוחדת להסיר כמות גדולה ככל האפשר כשלב מקדים להיברידיזציה.דגרו את הדגימות ב-1.8 milliliters של תמיסת היברידיזציה. ערבבו במשך שעה אחת ב-60 degrees Celsius במכשיר ערבוב הופכי (inverter). דנטורו DNA של זרע סלמון על ידי דגירה ב-85 degrees Celsius למשך 10 דקות והניחו על קרח. הוסיפו 200 microliters של DNA דנטורי בעל גדיל יחיד וכ-100 nanograms של גשושית riba המסומנת ב-DIG לכל דגימה, ובצעו היברידיזציה למשך הלילה ב-60 degrees Celsius בתנור היברידיזציה.עבדו את הדגימות באמצעות שלושה שלבי שטיפה של 10 דקות ב-2× SSC בטמפרטורה של 60 °C בתנור ההיברידיזציה. חשוב להסיר כל פעילות אנדוגנית של פוספטאז אלקלי באמצעות שטיפה ב-2× SSC למשך 60 דקות ב-70 °C בבלוק חימום ISO temp. שטפו את הדגימות ב-PBS למשך חמש דקות.כעת החליפו את ה-PBS והוסיפו מיקרוליטר אחד של 10 milligrams per milliliter מ-RNAs A, ודגרו למשך 60 דקות ב-37 degrees Celsius בבלוק חימום ISO temp. השליכו את ה-PBS RNAs A ושטפו שלוש פעמים בתמיסת שטיפה למשך 10 דקות בכל פעם.לבסוף, יש לחמם ולהפעיל את כל ה-RNAs שנותרו על ידי אינקובציה למשך 60 דקות בטמפרטורה של 70 degrees Celsius בבלוק חימום ISO temp. השלב הסופי הוא הדמיה של ה-ribo probe. יש להדגיר את הדגימות ב-one times block buffer למשך שעה אחת.יש להסיר את תמיסת החסימה (block buffer) ולהוסיף שני מיליליטר של תמיסת חסימה המכילה מיקרוליטר אחד של נוגדן anti ditch לכל דגימה. יש להדגיר למשך הלילה ולשטוף מספר פעמים עם תמיסת שטיפה בריכוז 1x כפי שצוין. לאחר מכן, יש להדגיר את הדגימות בתמיסת שטיפה בריכוז 1x למשך הלילה.שטפו את הדגימות עם תמיסת שטיפה (detection buffer) פעם אחת למשך 10 דקות והעבירו את הדגימות לפלטת בארות. השליכו את התמיפה ופתחו את הצבע באמצעות BM purple, כיוון ש-BM.Purple רגיש לאור. כסו בנייר אלומיניום או בקופסה כאשר התושב של עוצמת האות הרצויה הושג.שטפו את הדגימות עם באפר גילוי בריכוז של פי אחד בבארים למשך חמש דקות. דמיינו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופיית תמסורת או שמרו אותן ב-4% Para formaldehyde בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. במידת הצורך, הסירו מהרקמה צבעים ליפופיליים באמצעות סדרת אתנול מדורגת.לאחר מכן, יש להחזיר את הנוזלים לרקמה על ידי הוספה הדרגתית של PBS במשך חמש עד 10 דקות. כעת, יש לבצע חסימה (blocking) של הרקמה למשך שעה אחת ב-2.5% normal goat serum ו-0.5% Triton X 100 בטמפרטורת החדר על שייקר; דגרו עם נוגדן ראשוני המדולל בתמיסת החסימה למשך 48 שעות ב-4°C על שייקר; שטפו שלוש פעמים עם PBS למשך שעה אחת בכל פעם; בצעו חסימה של הדגימות שוב, ולאחר מכן דגרו עם נוגדן משני מצומד למסמן פלואורסצנטי, המדולל בתמיסת החסימה, למשך 12 עד 24 שעות ב-4°C על שייקר. מנקודה זו ואילך, יש להקפיד למנוע חשיפה של הדגימה לאור, מכיוון שהנוגדים המשניים רגישים לאור.שוב, שטפו את הדגימות שלוש פעמים עם PBS למשך שעה בכל פעם. לבסוף, נתחו את הדגימות באמצעות דימות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית-אפיקונטרית וקונפוקלית. הטמעה באפוקסי וחיתוך דורשים קיבוע של הרקמה ב-2.5% GLUTARALDEHYDE 1% PFA בבופר פוספט 0.1 מולרי, בדרך כלל למשך לילה בבקבוק דגימה מזכוכית; בצעו דהידרטציה לרקמה באמצעות אינקובציות באתנול בריכוזים מדורגים כדי לעבור לממסים, עם אינקובציה ביחס של אחד לאחד של אתנול מוחלט לפרופילן אוקסיד למשך חמש דקות, ולאחר מכן חמישה שטיפות של 10 דקות בפרופילן אוקסיד בלבד; חלחלו את הדגימה בשרף באמצעות אינקובציה פשוטה ביחס של אחד לאחד של פרופילן אוקסיד לשרף למשך לילה על שייקר.שפכו את התמיסה עם הדגימה לתוך תבנית השכבה שטוחה והשאירו על השיש למשך ארבע עד שש שעות לאידוי של ה-propylene oxide. העבירו את הדגימות ל-100%resin למשך ארבע שעות בתבנית הסופית. הטמיעו את הדגימות בשרף והדביקו תווית.אפשרו לשרף להתפלמר על ידי דגירה ב-60 °C למשך 24 עד 48 שעות. על מנת למזער את עודפי השרף, גלפו את בלוק השרף בעזרת להב תער לפי הצורך. במיקרוטום אולטרה.בצעו חיתוכים סדרתיים בעובי של 1 עד 2 מיקרון, רכבו והדמיאו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופיית תמסירה ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה אפיפוסקופית. צבעים ליפופיליים באורכי גל שונים יכולים להקל על ויזואליזציה של השליחות המרכזיות של שלושה עצבים קרניאליים שונים. כאן, צבע ליפופילי מוחדר לחלקים ההיקפיים של העצב הטריגמינלי, העצב הגלוסופרינגיאלי ועצב הוואגוס.לאחר דגירה להפצת הצבע, מדמיים את שלוחות העצבים המרכזיות המובילות לגזע המוח באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר. כאשר המוח האחורי מנותח ומוצמד בצורה שטוחה, ניתן לראות בבירור סימון של השלוחות המרכזיות של שלושת העצבים המסומנים. תחת מיקרוסקופיית שדה בהיר, המיקרוסקופ הקונפוקאלי מאפשר תפיסת ממדיות שבה אזורים ספציפיים מוארים, והשימוש בשלושה צבעים שונים מאפשר להעריך את ההפצה של כל אוכלוסייה.ביחס לאחרים, כאן, סיבי העצב האפרנטיים של האוזן הפנימית ממופים בעכבר רך-גול בשיטת neuro view. צבע אדום בטיבוב היברידיזציה של C בשביל prox one, ושילוב של תגובתיות חיסונית לאנטי tubulin ולאנטי prox. One כדי להדמיות של הסיבים האפרנטיים.בנוסף, חתך שרף אפוקסי בעובי שני מיקרון מדגים את השבלול כחתך רוחבי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לבחור בזהירות את מיקום העין הליפופילית. הבנה טובה של נוירו-אנאטומיה תסייע בתהליך זה, ויש לנקוט משנה זהירות בכל השלבים הרגישים לאור.נוהל זה יצמצם את כמות ההכלאות ואת הזמן הדרוש להשגת נתונים הניתנים לפרסום, תוך שיפור המידע על קולוקליזציה (colocalization) והשפעות כיסוי במוטנטים.

combining-lipophilic-dye-situ-hybridization-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

טכניקה המשלבת ב מכתים tetramer באתרו של הכלאה באתרו (ISTH) מאפשר, הדמיית מיפוי וניתוח של הקרבה המרחבי של ספציפיים וירוס CD8 תאים + T ליעדים הנגועים בנגיף שלהם, וקביעת היחסים הכמותיים בין effectors מטרות החיסונית לתוצאות זיהום.

טכניקה במקביל דמיינו ספציפיות וירוס CD8 + T ו-תאים הנגועים בווירוס תאים באתרו</em

מקור: Jolly, S., et.al. שילוב של פלואורסצנציה כפולה  בהכלאה באתר עם תיוג חיסוני לזיהוי ביטוי של שלושה גנים במקטעי מוח של עכברים. J. Vis. Exp. (2016). סרטון זה מדגים את השימוש בפלואורסצנציה כפולה בהכלאה באתרה כדי לדמיין את הביטוי של שתי מטרות RNA במקטעי מוח של עכברים. הפרוטוקול כולל זיהוי רציף של RNA באמצעות בדיקות המסומנות בפלואורסצאין איזותיוציאנט ודיגוקסיגנין, ואחריו הגברת אות אנזימטית להגברת הרגישות. הקרינה המתקבלת מאפשרת ניתוח לוקליזציה משותפת של רנ"א המטרה בתוך הרקמה.

 ביצוע הכלאה של פלואורסצנציה כפולה באתרה לאיתור ביטוי גנים במקטעי מוח של עכבר

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

אנו מתארים הליך רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-תרצה) בעוברים שלמים תסיסנית מאפשרים זיהוי סימולטני וספציפי של שלושה דפוסי הפצת mRNA שונים על ידי מנוגד משקעים צבע.

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

לוקליזציה של ביטוי גנים לסוגי תאים ספציפיים יכולה להיות מאתגרת בשל היעדר נוגדנים ספציפיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי משולש בו זמנית של ביטוי גנים על ידי שילוב של RNA פלואורסצנטי כפול הכלאה באתרו עם צביעה חיסונית.

שילוב קרינה זוגית<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה עם Immunolabelling עבור איתור של הביטוי של שלושה גנים בסעיפי מוח עכבר

המתואר RNA בחיי עיר הכלאה פרוטוקול מאפשרת הגילוי של RNA כל עוברי דרוזופילה או רקמות גזור. באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter tyramide אות הגברה, תעתיקים שניתן לאתר ברזולוציה גבוהה, רגישות, ואת התפוקה, בעלות נמוכה יחסית.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

כאן נתאר פרוטוקול עבור מולטיפלקס immunohistochemical פלורסנט מכתים והדמיה עבור ההתאמה סימולטני של אנטיגנים מרובים הקשורים לסרטן ב לימפומה. פרוטוקול זה ניתן להרחיב את הניתוח colocalization של סמנים ביולוגיים בתוך כל מקטעי רקמת.

מרובבת פלורסנט נוגדן, הדמיה, וניתוח בדגימות היסטולוגית של לימפומה

אנו מתארים שיטת הצביעה מהירה לביצוע הדמיה רב ספקטראלית על רקמות קפואות.

שיטה מהירה לדימות מרובה ספקטרלי של רקמות קפואות

פרוטוקול זה מתאר שיטה לשילוב הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) ואימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית (IHC) באזורי מוח עכבר טריים קפואים וקבועים, במטרה להשיג FISH רב-תוויות ואות IHC פלואורסצנטי. IHC התמקד בחלבונים ציטופלזמיים וחלבונים המחוברים לממברנה.

שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים

פרוטוקול זה מתאר את השלבים המפורטים של הטמעה מראש של מיקרוסקופ אימונואלקטרונים, תוך התמקדות בחקר מעגלים סינפטיים ולוקליזציה של חלבונים ברשתית.

חקירת מעגלי רשתית ולוקליזציה מולקולרית על ידי הטבעה מראש של מיקרוסקופ אימונואלקטרונים

חקור שילוב של צבע lipophilic, הכלאה באתרו, אימונוהיסטוכימיה והיסטולוגיה לניתוח רקמת עכבר. שיטה זו מאפשרת מתאם בין מוטציות גנטיות לפרופילים מורפולוגיים וביטוי גנים בדגימה בודדת.

שילוב של צבע lipophilic, באתרו, אימונוהיסטוכימיה ו היסטולוגיה

גלה סרטונים נוספים