הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של המוציטים נגועים בפתוגנים של דרוזופילה

הנח שקף המכיל המוציטים קבועים על שלב המיקרוסקופ הקונפוקלי.

המוציטים אלו מופקים מזחלי Drosophila melanogaster ונדבקו בפתוגן חיידקי.

ההמוציטים מסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק, הגרעינים שלהם מוצבעים בצבע כחול, והחיידקים מבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום לצורך הדמיה.

הגדר את המיקרוסקופ כך שיזהה את שלושת הפלואורופורים כדי לעקוב אחר תאים ופתוגנים בו-זמנית.

באמצעות מטרה ברזולוציה גבוהה, התמקד בהמוציט היעד כדי ללכוד פרטים תת-תאיים.

כוון את עוצמת הלייזר ואת הרווחים של הגלאי כדי להשיג חשיפה מתאימה לדגימה ולייעל את בהירות האות.

סרוק מספר מישורי Z כדי לוודא שרמת החשיפה מתאימה.

הגדר את מיקום ה-Z העליון והתחתון כדי לצלם את כל ההמוציט.

השתמש בזום סריקה כדי לבודד את ההמוציט המעניין ולקבל תמונה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה.

שיטה זו מאפשרת המחשה של מיקום הפתוגן בתוך ההמוציט.

הגדר את המיקרוסקופ הקונפוקלי להדמיה תלת-צבעונית של DAPI, EGFP ו-mCherry.

הנח את הדגימה על המיקרוסקופ והתמקד בדגימה באמצעות מטרה נומרית של 63X/1.4. אתר את ההמוציטים הרצויים בשדה הראייה להדמיה. לאחר מכן, כוונו את עוצמת הלייזר ואת הרווחים של הגלאי כדי להשיג את החשיפה המתאימה של הדגימה.

בדוק כמה מישורי Z כדי לוודא שרמת החשיפה מתאימה לכל עובי הדגימה. לאחר מכן, מצא את המיקום העליון והתחתון על ציר Z של המוציט שלם. הגדר את המיקומים הללו כנקודות התחלה וסיום לחתך Z.

השתמש בזום סריקה כדי לצלם את האזור שבו נמצא ההמוציטים. אספו את סדרת התמונות ברזולוציה המתאימה, כמו 1024 על 1024 פיקסלים במישור X-Y, ומרחק של 0.3 מיקרומטר בממד Z.