ניתוח ביטוי גנים בתא יחיד מפתוגנים שמופקים על ידי צמחים

קחו תלייה של חיידק פתוגני שבודד מצמח נגוע.

הגנום החיידקי מכיל מיזוג שעתוק, שבו המקדם של גן ויסות אלימות גם מניע ביטוי של גן חלבון פלואורסצנטי ללא פרומוטר במורד הזרם.

במהלך זיהום בצמחים, הפעלת הפרומוטר מפעילה את ייצור החלבונים הרגולטוריים והפלואורסצנטיים.

החלבון הרגולטורי מפעיל גני אלימות, בעוד שהפלואורסצנציה מספקת קריאה מדידה של הפעלת האלימות.

צנטריפוגות את התאים, משליכים את הסופרנטנט, ואז מחזירים את ההפעלה כדי לקבל תלייה מרוכזת.

הנח טיפה על כיסוי ושכב עם פד אגרוז כדי לפזר ולתקוע את התאים.

לצלם תמונת שדה בהיר לזיהוי כל תאי החיידקים, ואז תמונת פלואורסצנציה לזיהוי פלואורסצנציה של תא יחיד.

לשלב את שניהם כדי להמחיש הבדלי עוצמת פלואורסצנציה, החושפים תת-אוכלוסיות עם ביטוי גנטי גבוה, נמוך או ללא ביטוי של הגנ.

שונות פנוטיפית זו משקפת אסטרטגיה אדפטיבית שמגבירה את הישרדות החיידקים במהלך התיישבות הצמחים.

לניתוח תא יחיד, יש להכין תמיסה של 1.5% אגרוז במים מזוקקים. לאחר ההמכה, הוסף מספיק נפח כדי למלא את החלל בין שני שקופיות מיקרוסקופיות המונחות זו לצד זו ומניח שקופית נוספת מעל. תן להם לנהוג 15 דקות ותסיר בזהירות את המגלשה שמונחת למעלה.

באמצעות להב, חתכו את כרית האגרוז לחתיכות בגודל 5 מ"מ על 5 מילימטר לפני השימוש. במקביל, צנטריפוגה של 1 מיליליטר מהחיידק שמופק מאפופלסט. הסר בזהירות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה והחזיר את הכדור לתוך 20 מיקרוליטר מים כדי לרכז את התאים.

הנח טיפה של 2 מיקרוליטר של התאים המרוכזים על משטח כיסוי בקוטר 0.17 מ"מ וכסה את הטיפה בחתיכת פד אגרוזה. הצג את ההכנה החיידנית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לזהות חיידקים פלואורסצנטיים ירוקים באמצעות לייזרים ספציפיים. זהה את כל החיידקים בשדה הבהיר וממזג את שני השדות.