חילוץ DNA כולל מעלים לזיהוי זיהום חיידקי

התחל עם חתיכות קטנות של רקמת עלה מקוררת שבהן הפלומה נגועה בפתוגן חיידקי.

הניחו את החלקים במכתש עם חנקן נוזלי כדי לעכב את פעילות הנוקלאז המתפרק DNA.

לטחון כדי לשבש מכנית את התאים ולשחרר רכיבים תוך-תאיים.

השתמשו במרית מקוררת להעברת האבקה, הוסיפו בופר ליזיס, ומערבלים את המתלוי.

דוגר כדי לפרק גרעיני צמחים ותאי חיידקים, משחרר DNA ו-RNA תוך כדי דנטציה של חלבונים.

הוסף RNase ודוגר כדי לפרק את ה-RNA.

הוסיפו בופר לשקיעת חלבונים כדי לאגד חלבונים, ואז צנטריפוגה להפרדתם.

העבירו את ה-DNA העל-טבעי המכיל DNA צמחי וחיידקי לאיזופרופנול כדי להשקיע את ה-DNA כחוטים דמויי חוט.

צנטריפוגה לאיסוף DNA ולהשליכת הסופרנטנט.

שטוף באתנול, ואז בצנטריפוגה, והשליך את הסופרנטנט.

ייבשו באוויר את ה-DNA, ואז הוסיפו בופר להידרציה ודגרו כדי להמיס אותו.

דגימות ה-DNA מוכנות כעת לגילוי פתוגנים מבוססי PCR בהמשך.

השתמשו במספריים נקיים כדי לחתוך עלה טרי שלם מעץ הדר, והניחו בשקית סנדוויץ' פלסטיק נקייה. לאחר מכן, קרר את המלט והעלי על ידי הוספת כמות קטנה של חנקן נוזלי. לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לחתוך חתיכות קטנות של רקמת העלה, בגודל של כ-1 אינץ' רבוע.

הנח את חתיכות העלים במלט כדי להקפיא אותן מיד. התחל לטחון במהירות את רקמת העלה עם המלט עד שהחנקן הנוזלי מתאדה, ונשארת אבקה ירוקה דקה. לאחר מכן, קרר מרית מתכת בחנקן נוזלי למשך 10 עד 15 שניות. לאחר מכן השתמשו במרית הקרה כדי להוציא את רקמת הקרקע מהטיט בצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. השתמש בפיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי להוסיף 600 מיקרוליטר של תמיסת פירוק גרעינים לדגימה. לאחר מכן מערבל את הדגימה למשך שנייה עד שלוש. דגרו את הצינור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס, באמבט מים למשך 15 דקות.

לאחר סיום תקופת הדגירה, השתמשו בפיפטה של 10 מיקרוליטר כדי להוסיף 3 מיקרוליטר של תמיסת RNase לליזאט כדי להסיר RNA. לאחר מכן, ערבבו את תוכן הצינור על ידי הפיכתו פעמיים עד חמש פעמים. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בתנור ארון. לאחר 15 דקות, הוסיפו לדגימה 200 מיקרוליטר של תמיסת שקיעת חלבון. תפעיל את הצינור במהירות גבוהה למשך 20 שניות.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב-13000 גרם למשך 3 דקות. במהלך הצנטריפוגה, הוסף 600 מיקרוליטר איזופרופנול בטמפרטורת החדר לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליטר. לאחר סיום הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הסופרנטנט מצינור הצנטריפוגה אל הצינור המכיל איזופרופנול. זרוק את הכדור.

הפוך את הצינור כדי שה-DNA יהיה נראה כמו חוט חוט. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה בטמפרטורה של 13000 גרם למשך דקה בטמפרטורת החדר.

פרק את הסופרנטנט לאחר הצנטריפוגה. לאחר מכן, הוסיפו 600 מיקרוליטר של 70% אתנול לכדור. הפוך את הצינור מספר פעמים כדי לשטוף את הכדור. צנטריפוגה את הצינור ב-13000 גרם למשך דקה. לאחר סיום הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנטנט. לאחר מכן, הפכו את הצינור עם המכסה פתוח על נייר סופג לייבוש באוויר למשך 15 דקות. לאחר הייבוש, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת החזרת DNA לכדור. דגרו את תליית ה-DNA בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך שעה.