בידוד של הדנ"א הגנומי של זנבות עכבר

אז זה גור עכבר בן 10 ימים ואני הולך לקחת ביופסיית זנב ואז אני הולך לחלץ DNA גנומי מהזנב שלו. אז מה שאני הולך לעשות זה לחתוך קצת מהזנב שלו, בערך שלושה מילימטרים, ואז אני מניח את חתיכת הזנב בצינור איינור ואני מניח את צינור האיינור על קרח יבש. כעת, כדי למנוע זיהום מעכבר אחד למשנהו, אני בדרך כלל מסמן את סכין הגילוח בחלק בו ביצעתי את החיתוך האחרון.

כך עבור העכבר הבא, אני אדאג להשתמש בחתיכת סכין גילוח נקייה כדי לקחת את ביופסיית הזנב הבאה. על מנת להבחין בין העכברים השונים בהמלטה שלכם, תצטרכו דרך לזהות את העכברים. אחת הדרכים לעשות זאת היא על ידי ניקוב חור באוזניים שלהם באמצעות מנקב חור אוזניים שמוצג כאן.

קח בעדינות את העכבר בעורפו ככה, הפוך אותו וצבט את זנבו בין האצבעות. קח את ניקוב חור האוזן ביד השנייה ובצע חיתוך מהיר באוזן העכבר שם. אתה רואה כמה זה היה לא כואב?

אוקיי, אז עכשיו אתם יכולים לראות שיש לי כמה חתיכות זנב בצינורות האיינור האלה ועכשיו אני הולך להוסיף את הפתרונות שיעזרו להם לעכל. ראשית אני הולך להוסיף 720 מיקרוליטר של תמיסת STE, ואז אני הולך להוסיף 30 מיקרוליטר חלבון. אייס K.So הנה מבט על חתיכת הזנב שחתכנו לפני העיכול.

עכשיו אני הולך להניח את חלקי הזנב על בלוק חימום של 55 מעלות. פרוטוקולים רבים קוראים להתנדנדות בתנועה מתמשכת ב-55 מעלות, אבל למטרותיי זה לא יהיה הכרחי מכיוון שאני אעשה מערבולת של חלקי הזנב. עכשיו אני הולך לסובב את חתיכת הזנב למשך שתי שניות.

אחת, שתיים. אז אחרי המערבולת, הנה מבט על מה שנשאר בתוך צינור האיינור כאן, ואתם יכולים לראות שחתיכת הזנב נמסה לחלוטין ולהפעיל את הפרוטאינאז K ב-70 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. להרוות על קרח במשך חמש דקות.

סובב את חלקי הזנב במיקרו צנטריפוגה למשך 10 דקות במלוא המהירות. במיקרו צנטריפוגה זו, המהירות המלאה היא 13,000 סל"ד. בזמן שזנבות העיכול מסתובבים מטה, כמה צינורות עינור ממלאים את צינורות האיינור ב-750 מיקרוליטר של איזופרופנול.

לאחר סיבוב הזנבות המעוכלים, השיער והחומר הלא מעוכל ייצרו כדור בתחתית שפופרת. התמיסה המכילה את החומר המעוכל, STE ופרוטאינאז K לתוך צינור האיינור המכיל את הדנ"א של האיזופרופנול תתחיל לצאת מהתמיסה, תיראה כמו רוח רפאים ונוצה, ובדיוק שם שוחה סביב הבועה הזו דנ"א גנומי שבודד מזנב העכבר. לאחר ערבוב תמיסת האיזופרופנול וה-STE, ה-DNA הגנומי ייצא מהתמיסה והוא נראה כמו הכדור הקטן הזה ממש כאן, מסובב את ה-DNA הגנומי המשקע במשך חמש דקות במלוא המהירות במיקרו-צנטריפוגה.

שם בתחתית הצינור יש מבט על הדנ"א הגנומי שלנו. עכשיו אני הולך לשאוב החוצה את התמיסה בתוך הצינור, ולהשאיר מאחור רק את גלולת הדנ"א הגנומי. בכל פעם שאני שואף צינור נוסף, אני מחליף את הצינור.

טיפ לחיות מחמד בקצה השואב הזה. לאחר שאיפת ה-STE והאיזופרופנול, אוסיף מיליליטר אחד של 70% אתנול כדי לשטוף את כדור ה-DNA הגנומי. מכיוון שכדור ה-DNA הגנומי נדבק בדרך כלל לצד של צינור מיקרו-פוגה וקשה להוריד אותו כדי לשטוף אותו היטב באתנול של 70%, תצטרך לגרוף אותו על פני מתלה צינורות המיקרו-פוגה שיש לי כאן.

אתה יכול לעשות את זה כך. אז הנה מבט על ה-DNA הגנומי לאחר שהוא נשטף ב-70% אתנול. אני הולך לסובב את זה שוב במלוא המהירות במשך חמש דקות ואז לשאוב את 70% האתנול שמסתובב במורד כדורי ה-DNA הגנומיים לאחר שהם נשטפו.

ה-70% אתנול שלהם חמש דקות במלוא המהירות, הולכים לשאוב את ה-70% אתנול ולתת ל-DNA להתייבש במשך חמש דקות. יש מבט על כדור הדנ"א הגנומי בתחתית הצינור, וזה יבש בערך כמו שאתה רוצה להשיג אותו. אז ייבשתי את כדורי הדנ"א הגנומי מזנבות העכברים, ועכשיו אני הולך להוסיף מאה מיקרוליטרים של 40 מילי-מולרי טריס ב-pH שמונה.

אז יש לי את הדנ"א הגנומי ב-50 מעלות צלזיוס, שם הוא ייכנס לתמיסה מהר יותר מאשר להוסיף טמפרטורת החדר. לאחר כשעה בערך ב-50 מעלות, אני אקפיא אותו או אשים אותו בארבע מעלות עד שארצה להפעיל את תגובות ה-PCR שלי כדי להבין אילו עכברים חיוביים לטרנסגן שלי.