Name: בידוד של הדנא הגנומי של זנבות עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: למדו כיצד לבודד DNA גנומי מזנבות עכברים בני 10 ימים באמצעות ביופסיית זנב. השיטה מדגימה טכניקות למניעת זיהום וזיהוי פרטנים בצאצאים לניתוח גנטי מדויק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol style="margin-top: 0in;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים חתיכות הזנב (3mm) והאוזניים סימן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 720 מ &#39;אני STE ו 30 מ&#39; אני proteinase K (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל המלאי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 55 מעלות צלזיוס על בלוק חימום מערבולת כל שעה במשך 3 שעות במהירות שיא עבור 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית proteinase K ב 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דובדבני על הקרח במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה DNA הזנב במשך 10 דקות בשיא המהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג לתוך שפופרת חדשה המכילה 720 מ &#39;אני Isopropanol. &nbsp; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משקע ה-DNA על ידי צינור vortexing או היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה DNA במשך 5 דקות במהירות מלאה. הסר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף גלולה עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה הדנ&quot;א הגנומי 5 דקות במלוא המהירות. הסר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר DNA להתייבש במשך 1-2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend דנ&quot;א l מ 100-200 תלוי בגודל של גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור מקום ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי להקל על פירוק של דנ&quot;א. &nbsp; </li></ol>

בידוד של הדנ&quot;א הגנומי של זנבות עכבר

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

זהו גור חולדה בן 10 ימים, ואני הולך לבצע ביופסיית זנב ולאחר מכן להפיק DNA גנומי מהזנב שלו. מה שאעשה הוא לגזור חתיכה קטנה מהזנב, בערך 3 מילימטרים, ואז אכניס את חתיכת הזנב לשפרובית אפנדורף ואניח את השפרובית על קרח יבש. כדי למנוע זיהום מצומת עכבר אחד למשנהו, אני בדרך כלל מסמן את להב התער על הנקודה שבה ביצעתי את החיתוך האחרון.בדרך זו, עבור העכבר הבא, אדגים שימוש בחלק נקי של להב תערור לצורך ביצוע הביופסיה הבאה מהזנב. כדי להבחין בין העכברים השונים בשגרייה, תזדקקו לדרך לזיהוי העכברים. דרך אחת לעשות זאת היא על ידי ניקוב חור באוזניהם באמצעות מחורר אוזניים, המוצג כאן.אחזו בעדינות את העכבר בעורף, הפכו אותו ותפסו את זנבו בין אצבעותיכם. קחו את מחורר האוזן ביד השנייה ובצעו חיתוך מהיר באוזנו של העכבר. ראו כמה זה היה חסר כאב?טוב, כעת ניתן לראות שיש לי חתיכות של זנב בתוך פקוettes אלו, וכעת אוסיף את התמיסות שיסייעו בעיכולן. ראשית, אוסיף 720 µL של תמיסת STE, ולאחר מכן אוסיף 30 µL של Proteinase K. להלן מבט על חתיכת הזנב שחתכנו לפני העיכול.כעת אעביר את חלקי הזנב לבלוק חימום בטמפרטורה של 55 מעלות. פרוטוקולים רבים דורשים תנועת נדנוד רציפה ב-55 מעלות, אך למטרותיי הדבר לא יהיה נחוץ מכיוון שאבצע ערבוב בורטקס (vortexing) לחלקי הזנב. כעת אערבב בורטקס את חלק הזנב למשך שתי שניות.אחת, שתיים. לאחר הערבול ב-vortex, הנה מבט על מה נשאר בתוך מבחנת ה-eppendorf כאן, וניתן לראות שפיסת הזנב התמוססה לחלוטין; הפעילו את ה-proteinase K ב-70 °C למשך חמש דקות. בצעו כיבוי (quench) על קרח למשך חמש דקות.סבב את חלקי הזנב במיקרו-צנטריפוגה למשך 10 דקות במהירות מקסימלית. במיקרו-צנטריפוגה זו, המהירות המקסימלית היא 13,000 RPMs. בזמן שחלקי הזנב העיכולים מסובבים, סמן מספר מבחנות epinephrine ומלא אותן ב-750 µL של איזופרופנול.לאחר סבב צנטריפוגה של הזנבות שעברו עיכול, השיער והחומר שלא עוכַּל ייצטברו כמשקע בתחתית המבנה. העבירו את התמיסה המכילה את החומר המעוכַּל, STE ו-proteinase K למבנה המכיל isopropanol. ה-DNA יתחיל לשקע מהתמיסה, וייראה כדמוי רפאים או כנוצות; בתוך הבועה השוהה שם נמצא ה-DNA הגנומי שבודד מזנב העכבר. לאחר ערבוב ה-isopropanol ותמיסות ה-STE, ה-DNA הגנומי ישקע מהתמיסה ויופיע ככדור קטן, כפי שרואים כאן; סובבו את ה-DNA הגנומי המשקע במשך חמש דקות במהירות מרבית במיקרו-צנטריפוגה.בתחתית המבחנה ניתן לראות את ה-DNA הגנומי שהשקיענו. כעת אשאב החוצה את התמיסה שבתוך המבחנה, כך שיישאר רק המשקע של ה-DNA הגנומי. בכל פעם שאשאב תמיסה ממבחנה נוספת, אחליף את הטיפ.הניחו את קצה השואב על השקיעה. לאחר שאיבת ה-STE והאיזופרופנול, אוסיף מיליליטר אחד של 70% ethanol כדי לשטוף את משקע ה-DNA הגנומי. מכיוון שמשקע ה-DNA הגנומי נצמד בדרך כלל לדופן של מבחנת מיקרו-צנטריפוגה וקשה להסיר אותו כדי לשטוף אותו ביסודיות ב-70% ethanol, תצטרכו לגרד אותו בעזרת מעמד מבחנות המיקרו-צנטריפוגה שנמצא כאן.ניתן לעשות זאת באופן הבא. הנה מבט על ה-genomic DNA לאחר שהושקע ונשטף ב-70% ethanol. אני אסובב זאת שוב במהירות מלאה למשך חמש דקות ולאחר מכן אשאב את ה-70% ethanol, כדי להשקיע את כדוריות ה-genomic DNA לאחר ששטפו אותן.סבב של 70% ethanol במשך חמש דקות במהירות מרבית, לאחר מכן אשאב את ה-70% ethanol ואניח ל-DNA להתייבש במשך חמש דקות. ניתן לראות את משקע ה-genomic DNA בתחתית המבחנה, וזהו בדיוק רמת הייבוש הרצויה. כעת, לאחר שייבשתי את משקעי ה-genomic DNA מזנבות העכברים, אוסיף 100 µL של 40 mM tris ב-pH 8.אני מחזיק את ה-DNA הגנומי בטמפרטורה של 50 °C, שבה הוא ימוס למסלול תמיסה במהירות רבה יותר מאשר בטמפרטורת החדר. לאחר כשעה ב-50 °C, אני אקפיא אותו או אשמור אותו בטמפרטורה של 4 °C עד שאבצע את תגובות ה-PCR כדי לקבוע אילו עכברים הם חיוביים לטרנסגן שלי.

isolation-of-genomic-dna-from-mouse-tails

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Genotyping המלא של מדגם זנב עכבר, כולל עיכול רקמות readout PCR, נעשה באחת וחצי שעות באמצעות SYBR Sigma גרין חלץ-N-Amp רקמות PCR הערכה.

Genotyping מהיר של רקמות באמצעות עכבר חלץ-N-Amp רקמות סיגמא של ערכת ה-PCR

אנו מדגימים immunoprecipitation הכרומטין (שבב) שיטה לזהות אינטראקציות גורם ספציפי על רקמות גנים במהלך או לאחר הופעת ביטוי גנים ברקמות ספציפיות ברקמות עובריים בעכבר. פרוטוקול זה צריך להיות רלוונטי נרחב לחקר ההפעלה רקמות ספציפיות גן כפי שהיא מתרחשת במהלך ההתפתחות העוברית נורמלי.

הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים

אנו מציגים גישה דגימה פולשנית ביעילות לאסוף דגימות שיער של יונקים קטנים חמקמק, כפי שמוצג על pika האמריקאי. אנו מדגימים את השירות של שיטה זו על ידי מיצוי דנ"א של השיער שנדגמו הגברה מספר סוגים של סמנים מולקולריים נפוץ לימודי האקולוגיה ושימור חיות בר.

שיער פולשנית דגימה טכניקה לקבל DNA באיכות גבוהה מ יונקים קטנים החמקמק

בסרטון זה אנו מדגימים הליך חיתוך זנב במודל עכבר לאיסוף דם היקפי. הדם שנאסף נתון לאחר מכן לצנטריפוגה לפלזמה נפרדת, אשר יכולה לשמש לניסויים נוספים.

הליך חיתוך זנב עכבר לאיסוף דם היקפי ובידוד פלזמה

אנו מתארים הליך ניסוי פשוט ומהיר ליצירת fibroblasts העיקרי מהאוזניים והזנבות של עכברים. ההליך אינו דורש הכשרה מיוחדת ובעלי חיים יכול לשמש לדור של תרבויות פיברובלסטים מאוזניים מאוחסנות על RT עד 10 ימים.

תרבויות יצירה ראשיות פיברובלסטים מרקמות אוזן וזנב עכבר

Microinjection של ביציות העכבר משמש בדרך כלל עבור transgenesis קלאסי ( כלומר, שילוב אקראי של transgenes) ו CRISPR בתיווך גישור המיקוד. פרוטוקול זה סוקר את ההתפתחויות האחרונות microinjection, עם דגש מיוחד על בקרת איכות אסטרטגיות genotyping.

הדור של עכברים השתנה גנטית דרך Microinjection של ביציות

אנו מתארים פרוטוקול מפורט את assay מוטציה cII למדא בחר בתאים בתרבית של מכרסמים הטרנסגניים או החיות המקביל שטופלו עם סוכן כימי/פיזי של עניין. גישה זו כבר בשימוש נרחב לניסויים המוטגניות של חומרים מסרטנים בתאי יונקים.

למדא בחר cII מערכת איתור מוטציה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד במהירות את הגרעינים באיכות גבוהה מן הרקמה טרי או קפוא עבור רצפי RNA בנפט מקבילים במורד הזרם. אנו כוללים רקמת חומרי ניקוי-מכניים, היפוטוניק-מכניים הפרעה ותא פירוק אפשרויות, אשר שניהם יכול לשמש עבור בידוד של גרעין האטום.

בידוד של חוט השדרה למבוגרים גרעינים עבור רצפי RNA חד-גרעין בנפט מקבילים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מוטציה אחת M213L ב- Gja1 השומרת על דור Connexin43 באורך מלא אך מונעת תרגום של איזופורם קטן יותר של GJA1-20k שתורגם באופן פנימי.

הסרת אתר התחלה תרגומי פנימי מ- mRNA תוך שמירה על הביטוי של חלבון באורך מלא

פרוטוקול זה מספק שיטת בידוד דנ"א פשוטה וחסכונית לניתוח שינויים במיקרוביוטה של מורין במעיים במהלך התפתחות מחלות אוטואימוניות.

ניתוח הדינמיקה של מיקרוביוטה בצואה בעכברים המועדים לזאבת באמצעות שיטת בידוד דנ"א פשוטה וחסכונית

פיתחנו גישה אונקוגנומית השוואתית חוצת מינים המשתמשת בניתוחים גנומיים ובמסכים גנומיים פונקציונליים כדי לזהות ולהשוות מטרות טיפוליות בגידולים הנובעים ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית וסוג הגידול האנושי המתאים.

פרופיילינג גנטי וסינון נשירה בקנה מידה גנומי לזיהוי מטרות טיפוליות במודלים עכבריים של גידול ממאיר במעטפת עצב היקפית

למדו כיצד לבודד DNA גנומי מזנבות עכברים בני 10 ימים באמצעות ביופסיית זנב. השיטה מדגימה טכניקות למניעת זיהום וזיהוי פרטנים בצאצאים לניתוח גנטי מדויק.

בידוד של הדנ"א הגנומי של זנבות עכבר

גלה סרטונים נוספים