שיטות פיתוח תובלה דם ברנה macrophage של תרופות תרופתי Nanoformulated

מטרת הליך זה היא לייצר ולבחון את הספיגה התאית, ההפרשה והתכונות האנטי-רטרו-ויראליות של ננו-חלקיקים אנטי-רטרו-ויראליים גבישיים, להם אנו קוראים nano art. דבר זה מושג תחילה על ידי עיבוד התרופות האנטי-רטרו-ויראליות באמצעות הומוגניזציה בסוניקציה או טחינה רטובה. השלב השני של ההליך הוא אפיון התכונות הפיזיקליות של חלקיקי ה-nano art לאחר בידוד מונוציטים ראשוניים באמצעות סנטריפוגציה נגדית.

הם נתרבים במשך שבעה ימים ב-DMEM המכיל גורם ממריץ מושבות של מקרופגים, או MCSF, המגורם להבחנתם למקרופגים המופקים ממונוציטים. השלב השלישי הוא בדיקת הספיגה, השמירה והשחרור של nano art במקרופגים אנושיים המופקים ממונוציטים. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא בדיקת היעילות האנטי-רטרו-ויראלית in vitro של nano art במקרופגים המופקים ממונוציטים.

בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות ספיחה מואצת ושחרור איטי של nano art מתאים ותקיפות אנטי-רטרו-ויראלית חזקה. אלו נקבעות על ידי מדידות של רמות התרופה, באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעוצמה גבוהה (HPLC), ועל ידי בדיקת חומרי על-נוזל (supernatant) של תרביות מזוהמות באמצעות מדידה של פעילות reverse transcriptase. שלום, אני Hanta Aldi ואני עמית פוסט-דוקטורט במעבדתו של ד"ר Howard Gelman במרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה.

השיטות שאנו מציגים יכולות לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בננו-רפואה, הכוללות כיצד ניתן להשתמש במערכות להעברת תרופות מבוססות תאים כדי לפתח פעילויות מחקר תרגומיות. ניתן להשיג זאת באמצעות שימוש בטיפול רטרו-ויראלי בפורמולציית ננו בעל זמני מחצית חיים ממושכים. המחקרים שלנו תומכים בשימוש פוטנציאלי ב-nano art לשימוש קליני.

שלום, שמי ארי נוש ואני סטודנט במסלול MD PhD במעבדת Carol Schwartz Emerging Neuroscience. תחת הדרחתו של ד"ר Gendelman, המשמעויות של הטכניקות שאנו מציגים כאן משתרעות על טיפול אנטי-רטרו-ויראלי, מכיוון שתרכובות בפורמולציה ננומטרית יכולות לשפר בו-זמנית את הזמינות הביולוגית ואת הפארמקוקינטיקה, ובמקביל להפחית תופעות לוואי הקשורות לתרופה. על ידי לקיחת תרופות אנטי-רטרו-ויראליות זמינות קלינית ואריזתן מחדש כננו-חלקיקים, עשויים להיות מסוגלים לשפר את ההיענות לטיפול ולהשפיע לחיוב על תוצאות המחלה.

שלום, אני ד"ר הווארד גנדלמן. אני קלינאי-מדען, פרופסור וראש המחלקה לפארמקולוגיה ומדעי העצבים הניסוייים כאן במרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה. מטרתנו הכללית היא לפשט את התרופות האנטי-רטרו-ויראליות כדי להפוך אותן לזמינות בקלות ולשפר את הפיזור הביולוגי והפרמקוקינטיקה.

כעת אני מעביר אתכם לארי ושון, שיובילו אתכם למעבדת המחקר וידגימו לכם כיצד מתבצעים הייצור והפיתוח של ננו-חלקיקים אלו. תועלת קלינית ופיתוח כאן במרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה לייצור ננו-חלקיקים באמצעות טחינה רטובה. ראשית, שקלו את גבישי התרופה וחומרים פעילי שטח שונים שבהם ישתמשו להכנת פורמולציות הננו, וערבבו אותם עם 10 millimolar heis buffer pH 7.8 באמצעות מיקסר T 18 ultra Turx עד לפיזור מלא; אחוז התרופה בפורמולציה צריך להיות בין 1% ל-2% עבור טחינה רציפה.

וודאו שהצ'ילר והמדחס פועלים ושלחץ המוצא הוא כ-100 PSI. כעת הגדירו את המערכת כך שניתן יהיה להטעין את מדי הטחינה לתוך המיכל, והוסיפו 50 milliliters של חרוצים לתא הטחינה. בעזרת משפך, וודאו שאין חרוצים על ההברגות או בכל מקום מחוץ לתא הטחינה כדי למנוע דליפות באטם המכני. כעת, וודאו שטבעת ה-O-ring נמצאת במקומה על תא הטחינה.

לאחר מכן, בחרו גודל רשת סינון מתאים והדקו את המכסים על ידי הידוק האומים. גודל רשת הסינון צריך להיות לפחות מחצית מגודל החרוצים. השתמשו ברשת סינון גדולה כדי למנוע מהמוצר לסתום את המסנן במהלך טחינה רציפה.

לאחר הורדת תא הטחינה, יש להוסיף לכניסת המוצר את תרחיף התרופה עם כמויות שונות של חומרים פעילי שטח. הנפח המינימלי של התרחיף צריך להיות 100 milliliters. דבר זה ימנע התחממות יתר של תא הטחינה וכן ימנע זיהום של חרוצים עקב בלאי מופחת של החלקים.

בשלב הבא, הפעילו את המשאבה. השתמשו ביחידת הבקרה כדי להגדיר את קצב הזרימה הנדרש עבור הפורמולציה שלכם. לאחר מכן, הפעילו את ערבוב (agitator) וכווןו את המהירות ביחידת הבקרה.

ניתן להעלות את המהירות מ-600 סיבובים לדקה ל-4,320 סיבובים לדקה. במיקרו-סור, עקבו אחר הטמפרטורה באמצעות מד הטמפרטורה המחובר בחלקו העליון של תא הטחינה כדי לוודא שלא מתרחשת התחממות יתר. כעת טחנו את הדגימה במהירויות וקצבי זרימה שונים, והוציאו אליקוטיות קטנות של כ-1 מיליליטר מהפורמולציה למדידות גודל ומטען באמצעות malvern zeta sizer לפיפיזור אור דינמי.

לאחר השגת הגודל הרצוי, הפסיקו את הטחינה באמצעות יחידת הבקרה ובזמן שהמשאבה עדיין פועלת, אספו את הדגימה לבקבוק, ואפשרו לתרופה להתנקז לחלוטין. זכרו לכבות את המשאבה בסיום ולהוציא ולנקות את כדוריות הטחינה. כעת העבירו את תרחיף הטחינה למבחנות צנטריפוגה של 50 milliliter והגדירו את הצנטריפוגה ל-10,000 rotations per minute למשך 30 דקות.

עם סיום מחזור הצנטריפוגה, מדדו את כמות הסופרנאט והחליפו אותה בכמות זהה של תמיסת סורפקטנט טרייה. לאחר השלמת הרספנסיה, העבירו את הת сусפנסיון לתא הטחינה וטחנו במשך 10 דקות. קחו אליקווט של כ-מיליליטר אחד ומדדו שוב את הגודל והמטען של הדגימה באמצעות ה-Zeta sizer.

לבסוף, מדוד את ריכוזן של פורמולציות ננו-האמנות באמצעות HBLC כדי לייצר ננו-אמנות באמצעות הומוגניזציה. באמצעות Avastin Emulex C five, הכן את גבישי התרופה וסורפקטנטים שונים כפי שתואר בעבר, והעבר את התוךית למכל ההומוגניזציה והתחל בסירקולציה. ודא שהצ'ילר פועל לפני תחילת הומוגניזציית הדגימה.

העלה את הלחץ בהדרגה עד שהמד יראה 20,000 פלוס או מינוס 2000 PSI והמשך בהומוגניזציה עד להגעה לגודל החלקיקים הרצוי. תהליך זה נמשך בדרך כלל בין 45 ל-60 דקות. קח באופן תקופתי אליקוטה של כמיליליטר אחד ומדוד את הגודל והמטען של הדגימה באמצעות zeta sizer centrifuge, עבור התוהה ההומוגנית כפי שתיארנו קודם לכן.

לאחר השעיית ה-Resus, העבירו את התמיה למסננת C five. הפעילו מחדש את הסירקולציה והחזירו את לחץ ההומוגניזציה ל-20,000 פלוס או מינוס 2000 PSI, ובצעו הומוגניזציה למשך 30 דקות לצורך ייצור באמצעות סוניקציה בעזרת מעבד אולטרסוני cold Palmer. שפכו את תמיסת ה-chloro methane PLGA והתרופה לתוך תמיסת חומר פעיל שטח 1%PVA והניחו באמבט קרח בתוך המכשיר האולטרסוני.

התחל את הסוניקציה ב-50% amplitude, אם כי ניתן להפחית את עוצמת הסוניקציה לכ-30% amplitude עבור מנות קטנות יותר של דגימות; בצע סוניקציה לדגימה למשך 10 דקות. קח אליקוט קטן לצורך ניתוח גודל חלקיקים. אם גודל החלקיקים גדול מ-1.5 microns, בצע סוניקציה לדגימות במרווחים של שתי דקות עד למקסימום של 16 דקות בסך הכל.

הבחינו בדגימות תחת המיקרוסקופ בהגדלה של 20 פעמים ותעדו את התצפיות. השתמשו בבוחש מגנטי כדי ליצור מערבולת נאותה עבור התרחוף והמשיכו בערבוב למשך הלילה בטמפרטורת החדר. אספו את התרחוף לאחר 24 שעות ומזגו אותו למבחנות צנטריפוגה של 50 milliliter.

סבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 8,000 סל"ד למשך 20 דקות בטמפרטורה של 5°C. נתקו את הנוזל העליון (supernatant) ותלה את מחצית אחת של הדגימה ב-75 milliliters של מים מסוננים ממערכת אוסמוזה הפוכה ואת המחצית השנייה ב-75 milliliters של 0.5% CTAB (trimethyl ammonium bromide) surfactant. סבבו את הדגימות שוב בצנטריפוגה במהירות של 8,000 סל"ד למשך 20 דקות בטמפרטורה של 5°C ותלה כל אחד מהמשקעים (pellets) בסך כולל של 20 milliliters של תמיסת מניטול. לבסוף, עבור חלקיקים שיוצרו באמצעות הומוגניזציה או סוניקציה, מדדו את גודל החלקיקים באמצעות Zeta Sizer ומדדו את ריכוז הדגימות באמצעות HPLC.

כדי להכין את הדגימות לצפייה במיקרוסקופ, קחו את תרחיפי ה-nano art שהוכנו והעבירו אותם סוניקציה למשך 10 שניות. בעוצמה של 20% עם פרוב סוניקציה, קחו כיסוי זכוכית (cover slip) של שקופית מיקרוסקופ והניחו אותו על מיקרוסקופ הפוך. על כיסוי הזכוכית.

ערבבו 15 µL של תמיחת ה-nano art עם 100 µL של phosphate buffered saline וערבבו באמצעות פיפוט מעלה ומטה מספר פעמים. לאחר מכן, הדמישו את הננו-חלקיקים באמצעות עדשה עם הגדלה של 20 פעמים כדי לבחון את המורפולוגיה. ניתן להכין את הדגימות גם לצפייה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM).

כאן אנו רואים תמונות שהתקבלו ממסרטון של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק עם פליטת שדה במתח נמוך מדגם A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F לאחר בידוד של מונוציטים מדם על ידי סנטריפוגה, כאשר המונוציטים המבודדים הגיעו לריכוז של 1×10⁶ תאים למילילטר ב-DMEM תומך בתוספים הבאים. לאחר מכן, זרקו 2×10⁶ תאים לבאר בלוחות בעלי 6 בארות בתוך אטמוספירה לחית, מועשרת ב-5% carbon dioxide, ותחילו תרבית למשך שבעה ימים כדי לאפשר למונוציטים להבדיל את עצמם למקרופאגים לצורך ניתוח ספיגת תאים ואיסופם. ערבבו nano art עם מדיה של תרביות לריכוז סופי של 100 µM והוסיפו 1 mL של מדיום טיפולי לכל באר בנקודת הזמן הרצויה או כאשר התאים מלאים לחלוטין ב-nano art.

הסיר את כל מצע הטיפול ושטוף את התאים שלוש פעמים עם 1 ml של PBS כדי להסיר חלקיקים שלא נקלטו על ידי התאים ב-1 ml של PBS. הסר תאים דבקים מהתחתית של הבאר באמצעות cell lifter והעבר אותם למבחנה למיקרו-צנטריפוגה של 1.7 ml. כעת, סובב את התאים בצנטריפוגה במהירות של 1000 RCF בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות.

הסיר את העלייה והוסף 200 µL של 100% Methanol כדי לליז את התאים. המיס את ה-nano art על ידי סוניקציה קצרה של המשקע באמצעות פרובה סונית ב-20% amplitude למשך שתיים עד חמש שניות. אחסן את הדגימות ב-80°C- עד למועד ניתוח תכולת התרופה. ניתן להדגים את השמירה התוך-תאית של nano art גם באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM) לאחר הכנת חתכים באמצעות מיקרוטום, כפי שניתן לראות כאן.

ראו את הטקסט הנלווה למאמר זה לפרטים על ניתוח שחרור nano arch והטיפול בתאים כפי שתואר בעבר עבור ניתוח ספיגה ואיסוף תאים. עם זאת, במקום לאסוף את התאים לאחר השטיפה, החליפו את ה-PBS בשני מיליליטרים של מצע תרבית תאים ללא MCSF וללא nano art בימים המצוינים, או כפי שיוסבר כאשר המצע הופך לצהוב; החליפו חצי מהמצע ביום הרצוי. אספו מיליליטר אחד של מצע התאים יחד עם תאים משכפלים ועבדו אותם לצורך ניתוח התרופה.

כדי להציג ויזואלית ספיגה בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה דו-מוקדית מסוג nano art, קחו תחילה צבע פלואורסצנטי (DRE) כגון vibrant והוסיפו אותו למצע. בהתאם להוראות היצרן, הוסיפו את המצע המכיל את הצבע למקרופאגים בוגרים המופקים ממונוציטים, ולאחר מכן שטפו את התאים שלוש פעמים באמצעות 1 mL של מצע תרבית כדי להסיר שאריות צבע. כעת ערבבו nano art עם מצע תרבית תוך שימוש ב-nano art המסומן פלואורסצנטית, והוסיפו מצע טיפול עם nano art המסומן. מיד לפני הדמיה במיקרוסקופ קונפוקאלי, צלמו תמונה בכל 30 שניות למשך ארבע שעות באמצעות עדשה עם הגדלה של 60x.

לבסוף, ניתן לבצע בדיקות זיהום ויכולת הדבקה של HIV-1. ראשית, יש לטפל בתאים כפי שתיאר עבור ויזואליזציה של שחרור art. לאחר מכן, בימים הרצויים, יש להסיר את כל המצע ולהחליפו במצע ללא MCSF המכיל HIV-1 a A בריבוי זיהום (multiplicity of infection) של 0.01 חלקיקים ויראליים לתא, ולדגור למשך 24 שעות.

לאחר מכן, הסירו את המדיום הויראלי והחליפו אותו בויראלי טרי, וגדלו את התרביות התאיים ללא וירוסים למשך 10 ימים, כאשר תחליפו חצי מהמדיום מדי יומיים או לפי הצורך כדי לשמור על חיויות התאים 10 ימים לאחר ההדבקה. אספו 10 µL של מדיום מכל באר והעבירו אותם לפלטה בעלת 96 בארות, ואחסנו בטמפרטורה של 80°C- עד לביצוע ניתוח reverse transcriptase. ניתן לבצע לאחר מכן גם זיהוי של HIV-1 p24.

כאן ניתן לראות בבירור את מורפולוגיית התאים שנחשפו לנגיף בריבוי זיהום (multiplicity of infection) של 0.011 יום לאחר טיפול ב-nano art. במקרופאגים אלו, שנגזרו ממונוציטים, אין עדות לזיהום נגיפי והננו-חלקיקים נראים בבירור בתוך ציטופלזמת התא. כאן, התאים נחשפו לנגיף 10 ימים לאחר טיפול ב-nano art.

חלק מתאים אלו היו מזוהמים כפי שמעיד צביעת P 24 והיווצרות תאים ענקיים רב-גרעיניים, אך עדיין נצפתה הגנה משמעותית בהשוואה לתאים שלא טופלו. שימו לב כי ננו-חלקיקים עדיין נראים בתוך הציטופלזמה של תאים ב-B, אך במידה פחותה מכפי שנראה ב-a; מבנים אלו אינם נוכחים בתאים שלא טופלו ב-nano art. בסרטוני הקונפוקל של תאים חיים אלו, אנו רואים מקרופאגים המסומנים בירוק ו-nano art המסומן באדום.

כאן ניתן לראות שהתאים צוברים מעט מאוד ננו-חלקיקים. כאן הם צוברים חלקיקים במהירות, כפי שמעידה פלואורסצנציה אדומה מוגברת. הבדלים אלו מקבילים לממצאים הנראים בעת ניתוח ספיגת התרופה באמצעות HPLC; בנוסף, ניתן לראות שהתאים סופגים את החלקיקים באופן פעיל.

ההבדל בין שיעורי הצטברות של ננו-אמנות תאית משקף את השפעותיהם של מאפיינים פיזיקליים כגון גודל, צורה ומטען על יכולתם של מקפאגים (macrophages) לספוג ולשמור ננו-אמנות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הייצור של ננו-אמנות באמצעות טכניקות של הומוגניזציה בטחנה רטובה וסוניקציה. אלו הן שיטות יעילות לייצור ננו-חלקיקים אנטי-רטרוויראליים.

טחינה רטובה והומוגניזציה משמשות לפיצול חלקיקי גבישי תרופה גדולים לננו-חלקיקים קטנים יותר בתוך חומרים פעילים שטחית שומניים (lipid surfactants), וטכניקת סוניקציה מייצרת טיפות תרופה בודדות בגודל ננו בתוך פולימר. כאן הדגמנו גם כיצד להשתמש במקרופאגים המופקים ממונוציטים אנושיים כפלטפורמת בדיקה להערכת הובלת ננו-חלקיקים. שיטת הבדיקה שלנו מאפשרת סינון פשוט מאוד של יכולתם של חלקיקים להיספג, להישמר ולהשתחרר על ידי תאים, כמו גם את יכולתם לעכב שכפול נגיפי.

דבר זה מאפשר לחוקר לזהות את הננו-אמנות שעשויה להיות בעלת הסיכוי הטוב ביותר להצליח in vivo ובסופו של דבר לשימוש בבני אדם נגועים. תוצאות מלאות של ניסויים אלו פורסמו במאמרנו Online Nano. המאמר שנקרא Nano Formulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics פורסם בכתב העת Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010.

תודה רבה.