Name: כימות dsDNA באמצעות ה-F-7000 Hitachi Fluorescence ספקטרופוטומטר ו PicoGreen דיי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: למד כיצד לכמת dsDNA באמצעות צבע PicoGreen וספקטרופוטומטר פלואורסצנטי Hitachi F-7000 עם קורא מיקרולוחות. השיטה מייצרת עקומת כיול ליניארית עם מקדם קביעה של 0.99993 לניתוח מדויק של DNA דו-גדילי בכמויות קטנות במחקר ביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. כלי ההתקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל spectrofluorometer ולאפשר להתחמם במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ב-Excel ליצור קובץ עם תקנים נתונים לדוגמה, כפי שמוצג באיור 1 ולשמור אותו סי.אס. "csv" פורמט. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig1.jpg" alt="איור 1"> באיור 1. לתקנים נתוני דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת fluorometer כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon1.jpg" alt="סמל 1"> כפתור זה ייפתח חלון שיטת ניתוח, באיור 2. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig2.jpg" alt="איור 2"> איור 2. שיטת ניתוח חלון, הכרטיסייה כללי. בצע את הבחירות הבאות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה "מדידה", בחר photometry מ למשוך למטה בתפריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה "מפעיל", להזין את שם המפעיל המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין צורך להזין מידע בשדה "כלי". זו נבחרת באופן אוטומטי על ידי התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השדה "דגימה" אינו פעיל בעת שימוש בקורא microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן הערות אשר ייתכן שתרצה לכלול בדוח בשדה "הערות". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה "אביזרים", להזין מידע הקשור האביזרים המשמשים לבדיקה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה הכפתורים בצד ימין של החלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפתור "טען" מאפשר טעינה שיטות ניתוח שנשמרו בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> "שמור" כפתור המאפשר עדכון סדרה של פרמטרים מבחן או שיטת ניתוח הציל בעבר נטען, תוך שימוש באותו שם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> "שמור בשם" כפתור מאפשר חיסכון קבוצה חדשה של פרמטרים מבחן או שיטת ניתוח בשם הרצוי. </li></ul> כעת לחץ על הלשונית "quantitation", ראה איור 3 ולעשות את הבחירות הבאות. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig3.jpg" alt="איור 3"> איור 3. שיטת ניתוח חלון, לשונית quantitation. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה "סוג quantitation", בחר אורך גל. זה מצביע על קריאה הקרינה ייעשה באמצעות הגל הנבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה "סוג כיול", בחר 1 כדי st. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה "מספר אורכי גל", בחר 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה "יחידת ריכוז", הזן ng / mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את תיבות נבחר עבור "כיול ידני" ו "עקומת כוח דרך אפס". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב "ספרות אחרי הנקודה העשרונית" שדה, בחר 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב "הגבלהתחתונה ריכוז" שדה, הזן 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה "ריכוז גבול עליון, הזן 10000. </li></ul> כעת לחץ על הלשונית "כלי" ולעשות את הבחירות הבאות. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig4.jpg" alt="איור 4"> איור 4. שיטת ניתוח חלון, בכרטיסיה כלי <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב "מצב נתונים:" את השדה, בחר פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> "מהירות קיצוץ" השדה אינו פעיל בשלב זה, הוא משמש רק עבור מדידות זרחני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה מצב "אורך גל", בחר גם קבוע WL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה "EX / WL1" להיכנס 480nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב "EM / WL1" שדה להיכנס 520nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל השדות האחרים תחת EX ו EM אינם פעילים בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה "EX סדק" לבחור 5.0nm מ למשוך למטה בתפריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה "א.מ. סדק" לבחור 5.0nm מ למשוך למטה בתפריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו נבחר בתיבת מול "מתח PMT 1-1000V" את השדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה "PMT מתח", בחר 700V מ למשוך למטה בתפריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב "calc סטטיסטי אוטומטי. מספר" בשדה לבחור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה "משכפל" לבחור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה "זמן אינטגרציה", בחר 0.1s. &lt;/ Li&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה "עיכוב" הזן או בחר 0s. </li></ul> לחץ על לשונית "צג". <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig5.jpg" alt="איור 5"> איור 5. שיטת ניתוח חלון, הכרטיסיה צג. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב "ציר Y", "מקס:" שדה, בחר 10000 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב "ציר Y", "מינימום:" שדה, בחר 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בתיבה משמאל את "פתח עיבוד נתונים לאחר רכישת נתונים". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו נבחר את תיבת משמאל "הדו"ח הדפסת לאחר רכישת נתונים", אלא אם כן אתה רוצה לדווח תודפס באופן אוטומטי לאחר קריאות הושלמו. </li></ul> לחץ על הכרטיסייה "הדוח", ראה איור 6. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig6.jpg" alt="איור 6"> איור 6. שיטת ניתוח חלון, Tab דוח. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה "פלט", בחר דוח הדפסה מתוך למשוך למטה בתפריט. אתה יכול גם לבחור "השתמש ב-Microsoft Excel" אם אתה רוצה לייצא את הנתונים ל-Excel, או "הדפסה השתמש מחולל גיליון" אם באמצעות להוסיף אופציונלית על מחולל דוחות תוכנית אשר תאפשר הפקת דוחות בהתאמה אישית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על תיבות עבור הפריטים שברצונך לכלול בדוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור את כל הפרמטרים שנבחרו בכרטיסיות שונות של החלון "שיטת ניתוח", לחץ שוב על הכרטיסייה "כללי" ולשמור אותם תחת שם הקובץ במיקום שבו אתה יכול למצוא אותם לשימוש עתידי, ולחץ על " אישור "כדי לסגור את החלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה משלים את הגדרת פרמטרים של מכשיר הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת נוכל להגדיר את הקורא microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon2.jpg" alt="סמל 2"> כפתור, אשר יביא את חלון ההתקנה MPR על העליונה. </li></ul> בחר בארות עבור התקנים דוגמאות בכרטיסייה חלון / פלייט ההתקנה MPR, כפי שמוצג באיור 7. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig7.jpg" alt="איור 7"> איור 7. MPR חלון ההתקנה, הכרטיסייה פלייט. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על המיקום A1 ו לגרור את העכבר כדי E1, ואז ללחוץ על <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon3.jpg" alt="סמל 3"> כפתור. זה יבחר את העמדות לשמש הסטנדרטים. עמדות אלו יודגשו בצבע ירוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו אנחנו צריכים לבחור F1 עמדות H3 עבור הדגימות. לחץ וגרור את העכבר החל F1 עמדה, לעמדה H3 ולאחר מכן לחץ על <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon4.jpg" alt="סמל 4"> כפתור, זה ידגיש את עמדות בצבע צהוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז לחזור על הפעולה זהה עבור עמדות A2 ל-E3, כדי לבחור אותן עמדות למדידות המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו, בואו לטעון את הקובץ מופרדים בפסיקים הקובץ משתנה (CSV) שהוכן מראש עם לתקנים מידע לדוגמא. </li></ul> לחץ על הכרטיסייה "ובכן מידע" של "חלון MPR ההתקנה", כפי שמוצג באיור 8. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig8.jpg" alt="איור 8"> איור 8. MPR חלון ההתקנה, הכרטיסיה פרטי טוב. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן לחץ על <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon5.jpg" alt="סמל 5"> כפתור. חלון Windows Explorer יפתח אשר כפי שמוצג באיור 9, אשר יאפשר איתור "ובכן information.csv" קובץ וטעינה בו. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig9.jpg" alt="איור 9"> איור 9. טעינת מידע מדגם היטב. לאחר טעינת הקובץ "ובכן מידע", "מידע טוב" ייראה כפי שמוצג באיור 10 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig10.jpg" alt="איור 10"> איור 10. מידע טעון מדגם היטב. </li></ul></li></ol></li></ol> 2. לדוגמה Picogreen Assay הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1X TE חוצץ (10 mM טריס-HCl, 1 mM EDTA) על ידי הוספת 1 מ"ל של 20 X TE הצפתעד 19 מ"ל di H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון PicoGreen מגיב על ידי הוספת 50 μL 200 X מגיב PicoGreen עד 9.95 הצפת מ"ל 1 X TE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תקנים (Lambda dsDNA) על ידי ביצוע דילולים הסידורי של המניות dsDNA (100 מיקרוגרם / מ"ל). ראשית להכין תמיסה של 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​dsDNA ידי הוספת 25 μL של המניה dsDNA (100 מיקרוגרם / מ"ל) ו -25 הצפת μL 1 x TE. ואז להכין את פתרונות סטנדרטיים על ידי הוספת כמויות המצוין של dsDNA ו חיץ כמפורט בטבלה שלהלן: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריכוז dsDNA </td><td> נפח dsDNA </td><td> נפח של הצפת </td></tr><tr><td> 1 מיקרוגרם / מ"ל </td><td> 20 μL של 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​dsDNA </td><td> 980 μL 1 X TE הצפת </td></tr><tr><td> 0.1 מיקרוגרם / מ"ל </td><td> 100 μL של 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​dsDNA </td><td> 900 μL 1 X TE הצפת </td></tr><tr><td> 0.01 מיקרוגרם / מ"ל </td><td> 100 μL של 0.1 מיקרוגרם / מ"ל ​​dsDNA </td><td> 900 μL 1 X TE הצפת </td></tr><tr><td> 0.001 מיקרוגרם / מ"ל </td><td> 100 μL של 0.01 מיקרוגרם / מ"ל ​​dsDNA </td><td> 900 μL 1 X TE הצפת </td></tr></tbody></table></li></ol> 3. מדידה לתקנים Fluorescence לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 150 μL של תקן זה לתוך בארות A1-E1 של צלחת 96 היטב, לכל איור 7, ועל פי הטבלה הבאה: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> טוב </td><td> תקן </td></tr><tr><td> A1 </td><td> 1 מיקרוגרם / מ"ל </td></tr><tr><td> B1 </td><td> 0.1 מיקרוגרם / מ"ל </td></tr><tr><td> C1 </td><td> 0.01 מיקרוגרם / מ"ל </td></tr><tr><td> D1 </td><td> 0.001 מיקרוגרם / מ"ל </td></tr><tr><td> E1 </td><td> 1 X TE הצפת </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 150 דגימות ידוע μL לתוך בארות F1 כדי H3, שמוצג באיור 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים פתרון PicoGreen מוכן בשלב 1.2 לתוך שוקת מיועד לשימוש רב ערוצי פיפטה. השתמש פיפטה רב ערוצי לספק 150 μL פתרון PicoGreen לבארות A1-H3. מערבבים פתרון תקני בעדינות עם פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת באזור חשוך להמתין 2-5 דקות תגובה לפתח. </li></ol> 4. נציג תוצאות עקומת כיול טוב מוערך באמצעות פרמטרים שונים הניתנים על ידי תוכנת ה-F-7000 על מדידה של סטנדרטים החישוב של עקומת הכיול על ידי התוכנה. מקדם נחישות מציין את מטיב ההתאמה של הסטנדרטים נמדד עקומת כיול מחושב. ככל ערך זה היא "1", טוב יותר את ההתאמה של הערך הנמדד ואת עקומת כיול. אם הערך הוא רחוק מלהיות "1", סטנדרטים חייבים להיות נמדד מחדש, מוכן שוב, או הכושר של עקומת הכיול השתנה. איור 11 מציג דוגמה של עקומת כיול עם מקדם נחישות מחושב = 0.99993, השיג עבור כימות dsDNA PicoGreen באמצעות צבע. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig11.jpg" alt="איור 11"> איור 11. דוגמה של עקומת כיול dsDNA.

<ol><li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).</li>
</ol>

לואיס מורנו א ו ל קנדרה קוקס מועסקים על ידי Hitachi גבוהה טכנולוגיות אמריקה המייצרת את המכשיר משמש במאמר זה.

Pipetting זהירות במהלך הכנת המדגם, וכן באמצעות ספקטרופוטומטר הקרינה יציבה רגיש חיונית להשגת תוצאות טובות לשחזור. במקרה של ספקטרופוטומטר את הקרינה משמשים מבחן זה, הוא הציע להשתמש מדגם 300 μL נפח הסופי הקורא microplate. נפח נמוך מקטין את רגישות, נפח גדול יותר עלול לגרום לזיהום הכלאה בין בארות.

<table><tbody><tr><td>מים מזוקקים&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>ריאגנט</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת Quant-iT Picogreen dsDNA Assay מבית Invitrogen</td><td>ריאגנט</td><td></td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>פלטה מיקרו-פלואורסצנטית Nalge Nunc p/n 237108</td><td>אספקה</td><td></td><td>237108</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפט Eppendorf בעל 12 ערוצים</td><td>אספקה</td><td></td><td>3516677</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;פיפטת Eppendorf L</td><td>אספקה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;פיפטת Eppendorf </td><td>אספקה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל</td><td>אספקה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נייר אלומיניום</td><td>אספקה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>טיפי פפטה</td><td>אספקה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר פלואורסצנציה Hitachi F-7000 עם תוכנת FL Solutions 2.1</td><td>ציוד</td><td></td><td>5J1-0003</td><td></td></tr><tr><td>אביזר קורא מיקרו-פלייטים עבור F-7000</td><td>ציוד</td><td></td><td>5J0-0139</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות dsdna באמצעות ה-f-7000 hitachi fluorescence ספקטרופוטומטר ו picogreen דיי

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

כימות של ה-DNA, בעיקר בריכוזים קטנים, היא משימה חשובה עם מגוון רחב של יישומים ביולוגיים כולל תקן מבחני ביולוגיה מולקולרית כגון סינתזה וטיהור של ה-DNA, אבחון יישומים כגון כימות של מוצרי הגברה DNA, גילוי של מולקולות דנ&quot;א סמים ההכנות. במהלך וידיאו זה נדגים את היכולת של ספקטרופוטומטר Hitachi F-7000 Fluorescence מצויד אביזר Micro Reader פלייט לבצע כימות dsDNA באמצעות בדיקות מולקולריות קוואנט, זה PicoGreen ערכת צבע מגיב. ספקטרופוטומטר F-7000 Fluorescence מציעה רגישות גבוהה מדידות מהירות גבוהה. זוהי מערכת גמישה המסוגלת מדידת הקרינה, הארה, זרחני. מספר מצבי מדידה זמינים, כולל גל סריקה, סריקה בזמן, photometry ו 3-D מדידה סריקה. ספקטרופוטומטר יש רגישות בטווח של 50 picomoles של והעמסת בעת שימוש בנפח 300 מדגם μL ב microplate, והוא מסוגל למדוד מהירות סריקה של 60,000 ננומטר / דקה. כמו כן, יש טווח דינמי רחב של עד 5 סדרי גודל המאפשר שימוש של עקומות כיול על פני טווח רחב של ריכוזים. מערכת אופטית משתמשת בכל אופטיקה רעיוני לאנרגיה רגישות מקסימלית. טווח אורך הגל הסטנדרטי הוא 200-750 ננומטר, ניתן להרחיב 900 ננומטר, כאשר באחת photomultipliers אופציונלי אינפרא אדום הקרוב. המערכת מאפשרת בקרת טמפרטורה אופציונלי עבור הקורא צלחת 5-60 מעלות צלזיוס בטמפרטורה באמצעות אופציונלי חיצוני מבוקר circulator נוזלי. הקורא microplate מאפשר שימוש של 96 microplates היטב, את מהירות המדידה עבור 96 בארות הוא פחות מ 60 שניות בעת שימוש במצב קינטיקה. שולטת תוכנה עבור ה-F-7000 ו microplate Reader הם גם גמישה. דוגמאות ניתן להגדיר פורמטים או עמודה או שורה, וכן כל שילוב של בארות עשוי להיבחר מדידות מדגם. זה מאפשר ניצול אופטימלי של microplate. בנוסף, התוכנה מאפשרת ייבוא ​​מיקרו מדגם צלחת תצורות שנוצרו ב-Excel שנשמרו ערכים מופרדים בפסיקים, או &quot;csv&quot; פורמט. תצורות microplate מדידה ניתן לשמור נזכר על ידי התוכנה לנוחות ויעילות מוגברת. תוצאות הנתונים יכול להיות פלט דיווח סטנדרטי, ל-Excel, או תוכנית דווח אופציונלי גנרטור.

הפגנה של כימות dsDNA באמצעות מולקולרית בדיקות PicoGreen לצבוע Hitachi ו-F-7000 ספקטרופוטומטר Fluorescence מצויד אביזר microplate הקורא.

כימות dsDNA באמצעות ה-F-7000 Hitachi Fluorescence ספקטרופוטומטר ו PicoGreen דיי

כימות של DNA, ובמיוחד בריכוזים נמוכים, הוא משימה חשובה בעלת מגוון רחב של יישומים ביולוגיים, כולל מולקולרי סטנדרטי...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים את היכולת של הספקטרופוטומטר הפלואורסצנטי F 7, 000 עם קורא מיקרופלייטים לבצע כימות של DNA דו-גדילי באמצעות צבע Pico green. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת הדגימות והריאגנטים. השלב השני של הפרוצדורה הוא הגדרת המכשיר.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא טעינת הדגימות לקורא המיקרופלטה. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ביצוע המדידה של התמיסות הסטנדרטיות והדגימות. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות עקומת כיול ליניארית, שניתן להשתמש בה לצורך כימות DNA דו-גדילי של דגימות לא ידועות.הפעילו את ה-Hitachi F 7, 000 Spectra Fluorimeter כדי לאפשר למנורת ה-Xenon להתחמם במשך שעה אחת ב-Excel. צרו קובץ הכולל את הסטנדרטים ונתוני הדגימות ושמרו אותו בפורמט של ערכים מופרדים בפסיקים או CSV. כדי להגדיר את הפלואורימטר, לחצו תחילה על כפתור ה-method הפותח את חלון שיטת האנליזה.בשדה המדידה, בחרו photometry מהתפריט הגלילה. כעת לחצו על לשונית quantitation. בשדה סוג הכמות (quantitation type), בחרו wavelength כדי לציין כי קריאת הפלואורסצנציה תבוצע באמצעות אורך גל ספציפי.עבור סוג הכיול, בחרו בסדר ראשון (first order), ועבור מספר אורכי הגל, בחרו באחד. הזינו nanograms per milliliter כיחידת ריכוז. ודאו שהתיבות של כיול ידני (manual calibration) והעברת העקומה דרך אפס (force curve through zero) אינן מסומנות. עבור מספר הספרות לאחר הנקודה העשרונית, בחרו בשתיים; הזינו אפס עבור הגבלה תחתונה של הריכוז, ו-10,000 עבור שדה הגבלה עליונה של הריכוז.בשלב הבא, לחצו על לשונית instrument ובשדה data mode בחרו fluorescence. ודאו ששדה chopping speed אינו פעיל, שכן הוא משמש למדידות phosphorescence בלבד. בשדה wavelength mode, בחרו ב-WL fixed עבור שדה ex WL, והזינו 480 nanometers בשדה EM WL.הזינו 520 nanometers. השאירו את כל שאר השדות תחת EX ו-EM כלא פעילים. הגדירו הן את ex slit והן את EM slit ל-5.0 nanometers.באמצעות התפריטים הנפתחים, השאירו ללא סימון את התיבה שלפני השדה PMT voltage one to 1000 volts. עבור PMT voltage, בחרו 700 volts מהתפריט הנפתח. כמו כן, בחרו שתיים עבור auto statistic calc number, אחת עבור replicates, 0.1 seconds עבור integration time ואפס עבור delay.כעת פתחו את לשונית הניטור (monitor) והגדירו את השדה של המקסימום בציר ה-y ל-10,000 ואת המינימום בציר ה-y לאפס. לאחר מכן, סמנו את התיבה משמאל לאפשרות עיבוד נתונים לאחר רכישת נתונים (open data processing after data acquisition), ובמידת הצורך, את התיבה משמאל לאפשרות הדפסת דוח לאחר רכישת נתונים (print report after data acquisition) עבור דוח שיודפס באופן אוטומטי עם סיום הקריאות. לבסוף, כדי לשמור את כל הפרמטרים שנבחרו בלשוניות השונות של חלון שיטת הניתוח, לחצו על לשונית כללי (general) ושמרו תחת שם קובץ חדש במיקום מוגדר.לחצו על כפתור האישור (okay) כדי לסגור חלון זה. בכך הושלמה הגדרת פרמטרי הבדיקה של המכשיר. כדי להגדיר את קורא המיקרופלייטים, לחצו על כפתור ה-MPR כדי להבאי את חלון הגדרות ה-MPR לקדמת המסך.ראשית, בחרו את הבארות עבור התקנים. לדוגמה, לחצו על מיקום A1 וגררו את העכבר עד ל-E1. לאחר מכן, לחצו על כפתור הגדרת התקנים (standard set).פעולה זו תבחר את המיקומים שישמשו עבור התמיסות הסטנדרטיות, כפי שמודגש בצבע ירוק. לאחר מכן, בחרו את המיקומים עבור הדגימות. באופן דומה, לחצו וגררו את העכבר מעל המיקומים המתאימים בלוחית, ואז לחצו על כפתור סט הדגימות, שיסמן באופן אוטומטי את המיקומים הנבחרים בצבע צהוב.המשיכו לחזור על אותה פעולה עבור המיקומים של מדידות הדגימה הרצויות. כדי להטעין את מידע התקנים והדגימות אל קובץ ה-CSV (ערכים מופרדים בפסיקים) שהוכן קודם לכן, לחצו על לשונית מידע הבארים (well information) בחלון הגדרות ה-MPR.לחצו על כפתור טעינת מידע על הבארים (load well information) וייפתח חלון Windows Explorer לצורך זיהוי קובץ ה-csv עם מידע על הבארים. לאחר טעינת המידע, החלון אמור להופיע כטבלה. כדי להכין תמיסת עבודה של ריאגנט Pico green, הוסיפו 50 µL של ריאגנט pico green בריכוז 200 X ל-9.95 mL של באפר TE.עבור עקומת הסטנדרט, הכינו דילולים סדרתיים של DNA דו-גלימי מסוג Lambda בבופר TE לריכוזים סופיים הנעים בין 1 ל-100 nanograms per milliliter. טפטפו 150 µL מכל סטנדרט לבארות ייעודיות בלוח 96 בארות. לאחר מכן, טפטפו 150 µL מכל דגימת בדיקה לבארות הייעודיות המתאימות בלוח. כעת, באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסיפו 150 µL של תמיסת Pico green לכל בארה וערבבו את התמיסה עם דגימות ה-DNA.דגרו בעדינות את הפלטה באזור חשוך למשך שתי עד חמש דקות כדי לאפשר לתגובה להתפתח. לחצו על כפתור מסך התצוגה של ה-MPR כדי להעלות את חלון ההגדרות של ה-MPR לקדמת המסך, ולחצו על כפתור מיקום ההחלפה. פלטפורמת ההחזקה של המיקרופלטה תזוז לכיוון קדמת המכשיר; פתחו את דלת קורא המיקרופלטות, הניחו את פלטת 96 הבארים על פלטפורמת ההחזקה כאשר באר A1 פונה קדימה, וסגרו את דלת קורא המיקרופלטות.לחצו על כפתור מיקום ההתחלה (initial position) כדי להציב את מיקום A של אחת המיקרופלטות במיקום המדידה. לחצו על כפתור תצוגת המסך כדי להעלות את חלון המדידה לקדמת התצוגה. לחצו על כפתור המדידה כדי להתחיל במדידת התמיסות הסטנדרטיות והדגימות הבלתי ידועות.עקומת כיול טובה מוערכת באמצעות הפרמטרים השונים המסופקים על ידי תוכנת ה-F 7,000. לדוגמה, לעקומת כיול אידיאלית זו, שהתקבלה לצורך כימות של DNA דו-גדילי באמצעות צבע Pico green, מקדם דטרמינציה מחושב של 0.99993. המערכת בעלת הסבירה הגבוהה המתוארת היא הרכבה סדרתית של טכנולוגיות הכוללת את צבע Pico Green, ספקטרופוטומטר פלואורסצנציה מדגם Hitachi F 7,000, המצויד בקורא פלטות (Microplate reader) ותוכנה לאוטומציה של איסוף נתונים, אחסון, ניתוחים והצגה.שילוב של טכנולוגיות עוצמתיות יכול לתת מענה לצורך הגובר בניתוח מדויק של כמויות קטנות של DNA דו-גדילי.

quantification-dsdna-using-hitachi-f-7000-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

השימוש במערכות NanoDrop microvolume כחלופות מעשי ויעיל המסורתית מתודולוגיה חומצות גרעין quantitation מתוארת באמצעות הדגמה של שני פרוטוקולים microvolume quantitation חומצת גרעין.

NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

אנו מתארים בדיקה דיגיטלית של נקודת קצה לכימות חומצות גרעין עם קריאה פשוטה (אנלוגית). אנו מודדים פלואורסצנטיות בתפזורת של בדיקות דיגיטליות מבוססות טיפות באמצעות מכונת qPCR סטנדרטית במקום מכשור מיוחד ומאשרים את התוצאות שלנו במיקרוסקופיה.

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

כתב יד זה מתאר assay PCR דיגיטלית דופלקס, שניתן להשתמש בהם כדי לכמת spp אנטרוקוקוס זמנית. ואת סמנים גנטיים HF183 כאינדיקטורים לזיהום צואתי כללית אדם הקשורים במים פנאי.

Assay PCR דיגיטלי דופלקס כימות סימולטני של<em&gt; Spp אנטרוקוקוס.</em&gt; ואת מרקר HF183 הקשורים צואת האדם ווטרס

שיטה זו מאפשרת מכתים סלקטיבית, כימות של ה-DNA של ג'לים למסמס את הג'ל ירוקה SYBR אני / ניטרו Tetrazolium כחול פתרון וחשיפת אז זה אור שמש או מקור אור כחול. זה מייצר את התמיסה גלוי ודורשת כמעט ללא ציוד, שהופך אותו אידיאלי לשימוש שדה.

DNA מכתים שיטה המבוססת על משקעים Formazan הנגרם על ידי חשיפה אור כחול

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א על ידי מיקרוסקופ פלורסצנטיות גמורה (TIRFM) באמצעות מצע DNA λ ששונה site-specifically נקודה קוונטית הנקרא חלבון.

להמחיש את האינטראקציה בין התווית על-ידי Qdot חלבונים ו- DNA λ ששונה Site-specifically ברמת מולקולה בודדת

אנו מציגים כאן הליך למדידת אוליגומרים של חלבונים וצבירה בתאים ליזלתיים ותאים חיים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטיות.

איתור צבירת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי

פרוטוקול זה מתאר שיטה ייחודית לזיהוי הקישור בין תרכובות ומולקולות חלבון, ומציע את היתרונות של אובדן דגימת חלבון מינימלי ודיוק נתונים גבוה.

זיהוי אינטראקציה של חלבון-אומבליפרון CD40 באמצעות פלואורסצנטיות סריקה דיפרנציאלית

מחקר זה מציג בדיקת FRET רציומטרית פשוטה וידידותית למשתמש לאיתור והערכה כמותית של פעילות DNase, ומדגים את יישומו בניתוח נוקלאז חלש.

הערכת פעילות DNase על ידי העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית רציומטרית

פרוטוקול זה מתאר את התכנון של בדיקות הכלאה מפוצלות תוך שימוש באפטמר מואר פלואורסצנטי DAP-10-42 כמדווח אותות ויישומם לזיהוי חומצות גרעין והבחנה בין מטרות עם החלפות נוקלאוטידים בודדים.

בדיקת הכלאה מפוצלת המשתמשת באפטמר אור פלואורסצנטי של DNA כמדווח אותות לניתוח חומצות גרעין ספציפיות לרצף

פרוטוקול זה מספק פעולות מפורטות על הכנת דגימות, איסוף נתונים וניתוח ספקטרום פלואורסצנציה פנימי של DNA.

הדמיה סופר-רזולוציה ספקטרוסקופית של מולקולות DNA באמצעות ניגוד פנימי

למד כיצד לכמת dsDNA באמצעות צבע PicoGreen וספקטרופוטומטר פלואורסצנטי Hitachi F-7000 עם קורא מיקרולוחות. השיטה מייצרת עקומת כיול ליניארית עם מקדם קביעה של 0.99993 לניתוח מדויק של DNA דו-גדילי בכמויות קטנות במחקר ביולוגי.

כימות dsDNA באמצעות ה-F-7000 Hitachi Fluorescence ספקטרופוטומטר ו PicoGreen דיי

גלה סרטונים נוספים