כימות dsDNA באמצעות ה-F-7000 Hitachi Fluorescence ספקטרופוטומטר ו PicoGreen דיי

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את היכולת של ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי F 7,000 עם קורא מיקרופלייט לבצע כימות DNA דו-גדילי באמצעות צבע ירוק פיקו. זה מושג על ידי הכנת הדגימות והריאגנטים תחילה. השלב השני של ההליך הוא הגדרת המכשיר.

השלב השלישי של ההליך הוא טעינת דגימות לקורא המיקרופלייט. השלב האחרון של ההליך הוא ביצוע מדידת תקנים ודגימות. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות עקומת כיול ליניארית, שיכולה לשמש לכימות DNA דו-גדילי של דגימות לא ידועות.

הפעל את היטאצ'י F 7, 000 Spectra Fluorimeter כדי לאפשר למנורת הקסנון להתחמם למשך שעה אחת ב- Excel. צור קובץ עם התקנים והנתונים לדוגמה ושמור אותו בערכים מופרדים באמצעות פסיקים או בתבנית CSV. כדי להגדיר תחילה את הפלואוריומטר, לחץ על כפתור השיטה שפותח את חלון שיטת הניתוח.

בשדה המדידה, בחר פוטומטריה מהתפריט הנפתח למטה. כעת לחץ על לשונית הכמות. בשדה סוג הכמות, בחר אורך גל כדי לציין שקריאת הקרינה תתבצע באמצעות אורך גל שצוין.

עבור סוג הכיול, בחר בסדר ראשון, ועבור מספר אורכי הגל, בחר אחד. הזן ננוגרם למיליליטר עבור יחידת הריכוז. ודא שהכיול הידני ועקומת הכוח דרך תיבות האפס אינם מסומנים עבור ספרה לאחר נקודה עשרונית, בחר שניים, הזן אפס עבור מגבלת ריכוז תחתונה ו-10,000 עבור שדה גבול ריכוז עליון.

לאחר מכן, לחץ על לשונית המכשיר ובשדה מצב הנתונים בחר פלואורסצנטיות. ודא ששדה מהירות הקיצוץ אינו פעיל מכיוון שהוא משמש רק למדידות זרחן. בשדה מצב אורך הגל, בחר את שני ה-WL הקבועים בשדה WL אחד, הזן 480 ננומטר בשדה EM WL אחד.

הזן 520 ננומטר. השאר את כל השדות האחרים תחת EX ו- EM כלא פעילים. הגדר גם את החריץ הקודם וגם את חריץ ה-EM ל-5.0 ננומטר.

באמצעות התפריטים הנשלפים, השאר את התיבה לפני שדה מתח PMT אחד עד 1000 וולט לא נבחר. עבור מתח PMT, בחר 700 וולט מהתפריט הנפתח. כמו כן, בחר שניים עבור חישוב סטטיסטי אוטומטי מספר אחד עבור שכפולים של 0.1 שניות עבור זמן אינטגרציה ואפס עבור עיכוב.

כעת פתח את לשונית הצג והגדר מדוע שדה ציר מקסימלי ל-10, 000 ומדוע ציר מינימום לאפס. לאחר מכן בחר את התיבה משמאל לעיבוד הנתונים הפתוח לאחר רכישת נתונים, ובמידת הצורך, את התיבה משמאל לדוח ההדפסה לאחר רכישת נתונים עבור דוח שיודפס אוטומטית עם השלמת הקריאות. לבסוף, כדי לשמור את כל הפרמטרים שנבחרו בכרטיסיות השונות של חלון שיטת הניתוח, לחץ על הכרטיסייה כללי ושמור תחת שם קובץ חדש במיקום שצוין.

לחץ על כפתור אישור כדי לסגור חלון זה. זה משלים את הגדרת פרמטרי בדיקת המכשיר. על מנת להגדיר את קורא המיקרו-פלטות, לחץ על כפתור MPR כדי להביא את חלון הגדרת ה-MPR לחזית.

ראשית בחר בארות לתקנים. לדוגמה, לחץ על מיקום A one וגרור את העכבר ל-E one. לאחר מכן לחץ על כפתור הסט הסטנדרטי.

פעולה זו תבחר את המיקומים שישמשו לתקנים כפי שמודגש בצבע ירוק. לאחר מכן בחר מיקומים עבור הדגימות. באופן דומה, לחץ וגרור את העכבר מעל המיקומים המתאימים בצלחת, ולאחר מכן לחץ על כפתור ערכת הדוגמה, שידגיש אוטומטית את המיקומים שנבחרו בצהוב.

המשך לחזור על אותה פעולה עבור מיקומים של מדידות מדגם רצויות. כדי לטעון את התקנים ומידע לדוגמה לקובץ המשתנה המופרד בפסיקים שהוכן קודם לכן. לחץ על כרטיסיית מידע הבאר של חלון הגדרת MPR.

בחר בלחצן טען מידע באר וחלון סייר Windows ייפתח כדי לזהות קובץ csv של נקודת מידע באר. לאחר טעינת המידע, החלון אמור להופיע כטבלה. על מנת להכין תמיסת עבודה של מגיב ירוק פיקו, הוסף 50 מיקרוליטר של מגיב ירוק 200 X פיקו ל-9.95 מיליליטר של מאגר TE.

עבור העקומה הסטנדרטית, הכינו דילולים סדרתיים של DNA דו-גדילי של Lambda במאגר TE לריכוזים סופיים, הנעים בין 1 ל-100 ננוגרם למיליליטר פיפטה 150 מיקרוליטר מכל תקן לבארות ייעודיות של צלחת צלחת 96 בארות. לאחר מכן פיפטה 150 מיקרוליטר מכל דגימת בדיקה לבארות ייעודיות מתאימות של הצלחת. כעת, בעזרת מולטי פיפטה, הוסף 150 מיקרוליטר של תמיסה ירוקה של פיקו לכל באר וערבב את התמיסה ודגימות ה-DNA.

דגרו בעדינות את הצלחת באזור חשוך למשך שתיים עד חמש דקות כדי שהתגובה תתפתח. לחץ על כפתור מסך התצוגה MPR כדי להביא את חלון הגדרת MPR על גבי התצוגה ולחץ על כפתור מיקום ההחלפה. פלטפורמת האחיזה של המיקרו-פלייט תנוע לכיוון החלק הקדמי של המכשיר, תפתח את הדלת של קורא המיקרו-פלטות ותניח את לוחית 96 הבאר על פלטפורמת האחיזה כשהבאר A פונה לחזית ותסגור את הדלת של קורא המיקרופלייט.

לחץ על כפתור המיקום ההתחלתי כדי למקם את מיקום A אחד מהמיקרו-פלטה במצב המדידה. לחץ על לחצן תצוגת הצג כדי להביא את חלון המדידה על גבי התצוגה. לחץ על כפתור המדידה כדי להתחיל למדוד את התקנים והדגימות הלא ידועות.

עקומת כיול טובה מוערכת באמצעות הפרמטרים השונים המסופקים על ידי תוכנת F 7, 000. לדוגמה, עקומת כיול אידיאלית זו המתקבלת לכימות של DNA דו-גדילי באמצעות צבע ירוק פיקו חישבה מקדם קביעה של 0.99993. מערכת התפוקה הגבוהה המתוארת היא מכלול סדרתי של טכנולוגיות כולל Pico Green Dye, ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי Hitachi F 7, 000, המצויד בקורא Microplate ותוכנה לאוטומציה של איסוף נתונים, ניתוחי אחסון והצגה.

השילוב של טכנולוגיות עוצמתיות יכול לענות על הצורך הגובר בניתוח מדויק של כמויות קטנות של גדיל כפול. דנ א.