Name: משלוח ישיר של MIF Morpholinos Into Otocyst דג הזברה על ידי הזרקת electroporation משפיעה על פיתוח האוזן הפנימית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: למד שיטה למשלוח מורפולינו ישירות לשק האוזן ב-Danio rerio באמצעות מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה. טכניקה זו מאפשרת חקר ממוקד של התפתחות האוזן הפנימית והשפעות גנים על מערכת השמיעה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן המחקר לחירשות כדי Yc S ו-NSF (IOS 0930096) כדי KFB. KFB: NIH / NINDCD 2 RO1 DC04184, <a href="https://commons.era.nih.gov/commons/genericStatus.do?actionRole=nonPI&amp;applID=7854446&amp;uhf-token=Ugf7JvudZTCbTUW9jSAR1snMUgg%3D">3R01DC004184-08W1</a> , NSF DBI 0832862, 0930096 NSF IOS

1. ביצוע אלקטרודות עבור electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור בקוטר 75 מיקרומטר תיל טונגסטן (AM Systems, Inc Carlsborg, WA) באורך המתאים (כ 3-5 ס"מ) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימי חוט טונגסטן באמצעות Molex מחבר כבל (נחושת חותמת פינים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טונגסטן גלישת חוטים כבל Molex עם צינורות להתכווץ (SPC וטכנולוגיה, שיקגו, אילינוי) ולהחיל חום עם מבער בונזן או אקדח חום לאטום את צינורות מתכווץ לחוט </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחדד את קצה חוט טונגסטן, לטבול את החוט לתוך סודיום הידרוקסיד N 1.0 (קונרד et al. 1993), באמצעות מהדק נייר כמו אלקטרודה שני, electrolyze את החוט עם Electroporator גל סקוור. התנאים בהם אנו משתמשים הם 5 50 וולט פולסים לאורך כל 100 מילישניות עם 50 ms בין פולסים. אלקטרודות צריך להיות מחודד בקוטר של 15-20 מיקרומטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את החוטים מגש בתוך חריצים דחוק פלסטלינה לפני השימוש ב electroporation </li></ol> 2. הגדרת תחנה electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tape חידד 75μm אלקטרודות טונגסטן עד micromanipulators (Precision מכשירים העולמי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום micromanipulators משני צדי הבמה מיקרוסקופ לנתח (לייקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור אלקטרודות Electroporator CUY-21 הגן ערוך גל ריבועי (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל electroporator ולהקים פרמטרים electroporation, כולל מתח, משך הדופק, ומספר פולסים. הפרמטרים היעיל ביותר בניסוי זה נמצאו להיות שלושה 13 וולט פולסים אשר כל אחד נמשך 5.0ms, עם 100ms בין הדופק בכל. אם electroporation יוצר בועות אוויר בעובר, להפחית את אורך הפולס. </li></ol> 3. Microinjection של Morpholinos לתוך שלפוחיות Otic דג הזברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דג הזברה קציר עוברים מטנק הרבייה. דגירה עוברים בעובר העלאת בינוני עם 0.3 PPM מתילן כחול (Westerfield, 2005) על 28.5 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך מחטים זכוכית עם חולץ סאטר P-97 אלקטרודה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חימום ג'ל agarose הבסיס (1% agarose במים דגים צלחת פטרי 10 מ"מ) עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים 1% נמוך נקודת התכה agarose (LMPA) דג במים עד נמס לשמור אותו חם האמבטיה במים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מחט זכוכית עם פתרון morpholino (GeneTools, Corvallis, OR) וחתך את קצה לקוטר המתאים. הר את המזרק על micromanipulator (קון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים קצה המחט כ 10 מיקרומטר ו להזריק לתוך שמן מינרלי על מנת להבטיח כי קצה מאפשרת העברת מספקת פתרון morpholino. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorinate עוברים על postfertilization שעות 24 (hpf) ו להרדים אותם עם MS222 (tricaine, Sigma) ב 0.3 מתילן מים PPM דגים כחולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר 3-5 עוברים בהרדמה על בסיס ג'ל agarose עם בצד ימין למעלה לניתוח אחיד ונוח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימי 1-2 טיפות LMPA 1% מעל כל העובר ולתת לחזק לתקן את העובר במקום </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את צלחת פטרי כך שלפוחית ​​otic הוא בצד ימין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המחט לתוך לומן של שלפוחית ​​otic ו להזריק את הפתרון morpholino עם PV820 פניאומטיים PicoPump (מכשירים העולם Precision) עם מיכל חנקן המצורפת (איור 2) </li></ol> 4. Electroporation נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את העוברים רכוב לתחנת electroporation מיד לאחר ההזרקה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האלקטרודה החיובית על רקמות האחורי רק כדי שלפוחית ​​otic, אבל לא לחדור; להכניס את האלקטרודה השלילית אל המוח הקדמי רק כדי שלפוחית ​​otic </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל הנוכחי באמצעות דוושת רגל או על ידי לחיצה על מתג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים מים ודגים על agarose ולהסיר עוברים מן agarose עם מתערבלים פיפטה מזכוכית. היזהר לא לפגוע בעוברים. עבור עוברי שקשה להסיר להשתמש מחט בעדינות להתנתק כל LMPA המקיפים את העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום עוברים בצלחת עם מים מתילן כחול דגים להעלות את העוברים לשלבים הרצוי לניתוח (מורפולוגיים, immunohistochemical, באתרו anlaysis, הכלאה וכו מיקרוסקופיים). </li></ol> 5. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. לתחנת electroporation. אלקטרודות נעשו באמצעות חידד חוטי טונגסטן 75μm ומחובר על ידי מוביל Electroporator CUY-21 הגן על גל כיכר עריכה. אלקטרודות אלה היו מודבק micromanipulators. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. לתחנת הזרקה. עוברים כל הוזרקו האוזן הימנית למטרות תקינה. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> 3. איור Phalloidin מכתים של סיבי אקטין עם 3 עוברים DPF. (א) העובר injecte 3 DPFד עם שליטה MO יש כתמים חזקים של phalloidin ב המקולה האחורי (PM). (ב) העובר אשר מוזרק עם שליטה MO ואז electroporated היו רמות דומות של מכתים phalloidin ב pm ב עוברים בהזרקה בלבד. (ג) הזרקה עם MIF MOS לתוך שלפוחית ​​otic לבד לא גרם לירידה של מכתים phalloidin, תוך הזרקה של MIF MOS יחד עם electroporation גרם לירידה דרמטית של מכתים phalloidin ב pm (ד '). בבוקר, קדמית המקולה. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. מכתים Phalloidin של סיבי אקטין עם זחלים 5 DPF. לא היה הבדל בין זריקה בלבד (A) עם הזרקת electroporation כאשר רמת השליטה morpholino שימש (B). עם זאת, הזחלים 5 DPF כי הוזרקו MIF morpholinos ו electroporated הראה מופחת מכתים phalloidin ב המקולה האחורי (pm) (ד), אם כי פחות דרמטית DPF 3, בהשוואה לעובר כי הזריקו MIF morpholinos בלבד (C ). בבוקר, קדמית המקולה. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. מכתים טובולין Acetylated של עוברים ב DPF 3. העובר ב (א) לא קיבלו שום זריקה או electroporation. העובר ב (ב) היה electroporated אבל לא קיבל זריקה. שניהם עוברים קבלת הזריקה electroporation (C, D) עם MIF morpholinos היה בעליל מכתים טובולין פחתה בהשוואה לקבוצת הביקורת. (המקולה pm האחורי). <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig6.jpg" alt="איור 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 6"> איור 6. מכתים טובולין Acetylated של עוברים ב DPF 3 עם שליטה morpholino. (א) העובר ללא כל טיפול הראו טובולין חזקה מכתים acetylated ב המקולה האחורי (PM) וכן עצבוב רב. (ב) העובר מוזרק עם שליטה morpholino. (ג) העובר שטופלו electroporation בלבד. (ד) העובר בקרה עם שליטה morpholino הזריק electroporated יש רמות דומות של טובולין acetylated ב המקולה העצבוב האחורי והשווה לשלוט ללא טיפול.

<ol><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).</li>
<li>Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+essential+for+axis+formation+and+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development.</a> J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).</li>
<li>Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+placode+to+polarization%3A+new+tunes+in+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">From placode to polarization: new tunes in inner ear development.</a> Development. 131, 4119-4135 (2004).</li>
</ol>

ההפקה של המאמר נערך בחסות כלי ג&#39;ין, LLC המייצרים חומרים כימיים המוזכרים וידאו וטקסט.

יש לנו הציג בהצלחה oligonucleotide MOS antisense לתוך האוזן של העובר hpf 24 דג הזברה. עוברים שהועלו לאחר ההזרקה ואת electroporation היו קיימא. אם העוברים שרדו את electroporation, הם גדלו בקצב נורמלי לעומת עוברי כי לא קיבל שום טיפול, כמו גם העוברים שהיו רק מוזרק ועוברים שהיו רק electroporated. ראינו את ההשפעות של MIF ו-MIF כמו חודש לאחר ההזרקה האוזן electroporation באמצעות תיוג עם phalloidin ו טובולין acetylated. מכתים Phalloidin של סיבי אקטין בתאי השיער חושית של המקולה האחורי עולה כי electroporation של MIF ו-MIF כמו MO בשלב 24-hpf גרמה לשינויים בתא שיער ו / או מספרי stereocilia בהשוואה עוברי כי הוזרקו רק עם MOS (איור 3). ירידה זו במספר התא שיער עולה בקנה אחד עם הממצאים של שן et al. (שהוגשו) כי MOS כדי MIF ו-MIF כמו גרם לירידה במספר התאים שיער המקולה saccular. הירידה במספרים תא שיער עוברי כי הוזרקו MOS ו electroporated להוכיח כי electroporation עשוי לסייע בהעברת MOS על פני קרום התא, ובכך להגדיל את היקף ההשפעה המורפולוגית בהשוואה עוברים בו שלפוחית ​​otic שהוזרק בלבד. שינויים במורפולוגיה של הגנגליון statoacoustic נצפו באמצעות מכתים טובולין acetylated. מידת העצבוב של הגנגליון statoacoustic הושפע, כמו עוברי כי הוזרקו ו electroporated להראות ירידה הסתעפות של neurites (איור 5). כמו כן יכול להיות ירידה התעבות של תאים ganglionic ו / או מספר קטן של תאים הגנגליון, כי מכתים טובולין acetylated היא ירדה משמעותית עוברים כי היו שניהם הזריק electroporated. מכיוון MIF הוכח להיות קריטי להתפתחות מערכת העצבים (סוזוקי et al. 2004), ראו את השינויים לאחר electroporation עשוי להיות תוצאה של transfection מוגברת של MIF ו-MIF כמו פתרון MO לתוך התאים neuroblast. Electroporation של antisense אוליגו morpholinos ישירות לתוך רקמות מתפתחת הוא כלי שימושי לבקרת ביטוי של גנים במהלך ההתפתחות זה רקמות, הן במרחב ובזמן, בעובר. Electroporation של MIF ו-MIF כמו Mos לתוך הרקמות של האוזן הפנימית הביא מורפולוגיה תקינה של המקולה הן האחורי ואת הגנגליון statoacoustic. היתה ירידה במספר התאים שיער חושית המקולה האחורי בעוברים שהיו מזריקים ו electroporated בהשוואה עוברי כי לא קיבל שום טיפול או עם עוברים אשר גם היה מוזרק רק או electroporated בלבד. הייתה גם ירידה במידת העצבוב התיקון חושית האחורי של הגנגליון statoacoustic וגודל SAG. Electroporation היא שיטה ערך עבור transfecting מקרומולקולות לתוך רקמות ספציפיות, עם יתרון של התבוננות ההשפעות העיקריות של ה-DNA מסוים, RNA, או MO ברקמות הרצוי להפלות בין אלה השפעות משניות על ברקמות אחרות, כולל המוח, ציצה עצביים mesenchyme periotic על התפתחות האוזן הפנימית (Barald וקלי, 2004).

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MOS: 0.3 מ&quot;מ עבור שילוב של MIF, MIF כמו MO1, ו-MIF כמו MO2 היה בשימוש. MIF MO הוא משלים קודון ההתחלה של mRNA MIF דג הזברה: 5&#39;-acatcggcatgactgcgacagagat-3 &quot;. שני MOS שימשו MIF כמו MIF כמו MO1 היא חינם לאתר להתחיל translational:. 5&#39;-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3 &#39;, בעוד MIF כמו MO2 נגזר כרצף בגבול intron1/exon 2: 5&#39;-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC -3 &quot;. בקרת MO היה רצף נוקליאוטידים מקושקשות מתוך כלים ג&#39;ין: 5&#39;-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3 &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתילן כחול (0.3 ppm) מים ודגים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MS222 (tricaine, Sigma, 0.64 מ&quot;מ מים דגים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקודת התכה נמוכה agarose (LMPA; רוש) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנול אדום (Sigma) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Anti-acetylated טובולין (Sigma) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקסה פלואוריד ® 488 אנטי עכבר עז הנוגדן השני (בדיקות מולקולרית) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טקסס אדום phalloidin (בדיקות מולקולרית) </li></ol>

משלוח ישיר של mif morpholinos into otocyst דג הזברה על ידי הזרקת electroporation משפיעה על פיתוח האוזן הפנימית

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

בשנים האחרונות, electroporation הפך טכניקה פופולרית ב transfection vivo של DNA, RNA, ו morpholinos לתוך רקמות שונות, כולל העין, המוח, somites של דג הזברה. היתרון של electroporation על פני שיטות אחרות של מניפולציה גנטית היא כי רקמות ספציפיות יכול להיות ממוקד, הן במרחב ובזמן, המבוא של מקרומולקולות על ידי יישום של זרם חשמלי. כאן אנו מתארים את השימוש electroporation עבור transfecting MIF ו-MIF כמו morpholinos לתוך הרקמות של האוזן הפנימית בפיתוח של דג הזברה. במחקרים שנעשו בעבר, MIF morpholino מוזרק עוברים על 1 - לשלב 8-cell הביא שינויים מורפולוגיים נרחבת במערכת העצבים העין, כמו גם את האוזן. על ידי מיקוד הרקמות של האוזן הפנימית בשלבים מאוחרים יותר בהתפתחות, אנו יכולים לקבוע את ההשפעות העיקריות של MIF באוזן הפנימית מתפתחות, לעומת השפעות משניות שעלולים לנבוע להשפיע על רקמות אחרות. באמצעות טובולין phalloidin ו acetylated מכתים ללמוד את המורפולוגיה של נוירונים, תהליכים עצביים, ותאי השיער הקשורים המקולה האחורי, היינו מסוגלים להעריך את היעילות של electroporation כשיטה transfection ממוקד באוזן הפנימית דג הזברה. שלפוחית ​​otic עוברים 24hpf הוזרקו morpholinos ו electroporated ו הושוו העוברים כי לא קיבל שום טיפול או היה מוזרק רק או electroporated. עוברים כי הוזרקו ו electroporated נרשמה ירידה במספר התאים שיער, ירידה העצבוב של הגנגליון statoacoustic (SAG) ו נוירונים SAG פחות בהשוואה לקבוצות הבקרה. התוצאות שלנו הראו כי משלוח ישיר של morpholinos לתוך otocysts בשלבים מאוחרים יותר ימנע את המערכת הלא ספציפית העצבים ואת ההשפעות של הרכס העצבי morpholinos נמסר בשלב 1-8 התא. זה גם מאפשר בדיקה של השפעות מכוונות לאוזן הפנימית ולא השפעות משניות על האוזן מפני ההשפעות העיקרית על המוח, רכס עצבי או mesenchyme periotic.

שיטה כדי לספק morpholinos ישירות otocyst דג הזברה ב 24hpf פותחה. שימוש microinjection של morpholinos לתוך לומן של שלפוחית ​​otic ו electroporation אפקט חדירה, הצלחנו לעקוף את ההשפעה של morpholinos על המוח ולקבל השפעות ספציפיות באוזן הפנימית.

משלוח ישיר של MIF Morpholinos Into Otocyst דג הזברה על ידי הזרקת electroporation משפיעה על פיתוח האוזן הפנימית

בשנים האחרונות, הפכה אלקטרופורציה לטכניקה נפוצה לטרנספקציה in vivo של DNA, RNA ומורפולינוס לרקמות שונות, כולל ה...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להחדיר antisense, oligonucleotides, morpholinos או מולקולות אחרות המשבשות התפתחות ישירות אל תוך האוטיקה (otic) של דג הזברה בשלב של יום אחד או 24 שעות לאחר ההפריה. בדוגמה זו, אנו משתמשים במורפולינוס נגד ה-neurotrophin המוקדם ביותר האחראי על התפתחות הגנגליון האקוסטי סטטי, ציטוקין של מערכת החיסון הנקרא macrophage migration inhibitory factor, או MIF, כדי לקבוע אם השבתקת מולקולה זו משפיעה על התפתחות האוזן הפנימית או על נוירוגנזה. דבר זה מושג תחילה על ידי החדרת המורפולינוס אל חלל (lumen) השקיק האוטי באמצעות מיקרו-הזרקה, ולאחר מכן מבוצעת אלקטרופורציה, המקלה על חדירת המורפולינוס מהחלל אל תוך תאי האוטיקה.בשלב הבא, העוברים גדלים בטמפרטורה של 28.5 °C כדי לבחון את השפעות ה-morphos על התפתחות האוזן הפנימית ועל הנוירוגנזה. במהלך הימים הבאים, מתקבלות תוצאות המראות ירידה בתאי השיער החושיים של האוזן הפנימית, וכן ירידה באינרווציה על ידי ה-stato acoustic ganglion, בהתבסס על אימונוהיסטוכימיה וצביעה, המסמנות בהתאמה את ה-acetylated tubulin ב-Kinocilia ואת ה-actin ב-Stereocilia על פני תאי השיער. פיתחנו במקור את שיטת ההזרקה והאלקטרופורציה של morphos בעובר אפרוח יחד עם סטודנט לתואר ראשון מוכשר מאוד במעבדה. Кейטי הולמס הצליחה להתאים את הפרוטוקול לממדים של דגי זברה. צוות המחקר הנוכחי, הכולל את יוצ'י, פוסט-דוקטורנטית, ואת מאט וייאט, סטודנט לתואר מתקדם, יחד עם דב תומפסון, פוסט-דוקטורנטית לשעבר במעבדה, שכללו טכניקה זו עבור דגי זברה. שיטה זו עשויה, בתקווה, לספק תשובות לשאלות מפתח בתחומי הביולוגיה ההתפתחותית ומחקרי השמיעה, כולל השאלה האם ניתן להבחין בין השפעות של מורפוגנים ספציפיים על מערכת איברים כמו האוזן, לבין השפעות התפתחותיות כלליות המשפיעות על מערכות איברים רבות ומהוות השפעה משנית על האוזן, כגון השפעות על המוח המשפיעות באופן משני על האוזן.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הזרקות מיקרוסקופיות בשלבי תא אחד עד ארבעה תאים, הוא ששיטה זו מחדירה מורפוגנים ישירות לאוזן בשלבים מאוחרים יותר. כך, ניתן להימנע מהשפעות משניות על המוח ולבחון את ההשפעות הישירות של המורפוגנים על המותג. להכנת האלקטרודות, התחילו בחיתוך חוט טונגסטן בקוטר 75 µm ובאורך של כ-3 עד 5 ס"מ. השהילו את חוט הטונגסטן דרך מחבר כבל Molex.בשלב הבא, עטפו את חוטי הטונגסטן ואת מחבר כבל ה-Molex בבידוד מקבל (shrink tubing) והפעילו חום באמצעות מבער בנזן או אקדח חום כדי לאטום את הבידוד לחוט. לאחר מכן, כדי להשחיז את קצה חוט הטונגסטן, טבלו את החוט בנתרן הידרוקסיד רגיל, ובאמצעות מהדק נייר כאלקטרודה השנייה, בצעו אלקטרוליזה של החוט באמצעות גנרטור פולסים של גל מרובע. התנאים שבהם אנו משתמשים הם חמישה פולסים של 50 volt, כאשר כל פולס נמשך 100 milliseconds עם מרווח של 50 milliseconds בין הפולסים.בצעו שלוש חזרות כאשר קצה האלקטרודה טבול בנתרן הידרוקסיד נורמלי אחד. הכניסו את האלקטרודה מעט עמוק יותר לתוך נתרן הידרוקסיד ובצעו חזרה אחת נוספת. הכניסו את האלקטרודה עמוק יותר, תוך קידום האלקטרודה בערך באותו מרחק בשני המקרים, ובצעו חזרה אחרונה.שיוף מדורג זה יוצר חוד דק מאוד באלקטרודה, המאפשר החדרה מדויקת יותר ופחות פוגענית של האלקטרודות לתוך עובר של zebrafish בשלבי התפתחות. שמרו את החוטים לחוצים בתוך חימר פיסולי במגש לפני השימוש באלקטרופורציה להזרקה מיקרוסקופית של morphos לשקיות האוזן (otic vesicles) של zebrafish. ראשית, הכינו מיכלי רבייה עם מחיצה מפלסטיק כדי להפריד בין הזכרים לנקבות בשעות הערב.הכניסו ארבעה זכרים וארבע נקבות למכל והשאירו את המכל בחדר דגירה עם מחזור אור-חושך של 14 עד 10 שעות למשך הלילה. למחרת בבוקר, לאחר הדלקת האורות, הוציאו את המחיצה והשאירו את הדגים ללא הפרעה למשך כ-20 עד 30 דקות. הפרידו את הזכרים מהנקבות והוציאו את דגי הרבייה ממכל הרבייה.העבירו אותם למכלי דגים המכילים מי דגים טריים. אספו את העובריים ממכל הרבייה על ידי שפיכת המים המכילים את הביצים דרך מסננת. שטפו את הביצים שבמסננת מספר פעמים במי ביצים טריים לפני ניקוזן אל צלחת פטרי.הסר ביצים לא מופרות או עכורות והדגר את העוברים בתווך גידול עוברים עם 0.3 PP m methylene blue בטמפרטורה של 28.5 degrees Celsius למשך הלילה בזמן שהעוברים עוברים הדגרה. משוך מחטי זכוכית באמצעות Sutter P 97 electrode puller רגע לפני ההזרקה. חמם בסיס ג'ל AROS המורכב מ-1%agros במי דגים בצלחת פטרי של 10 millimeter לטמפרטורה של 37 degrees Celsius באמבט מים, וחמם 1%low melting point AGROS או LMPA במי דגים עד להמסה ושמור אותו חם באמבט המים של 37 degrees Celsius.מלאו מחט זכוכית בתמיסת morpho וגזרו את הקצה לקוטר המתאים, בערך 10 עד 15 microns. חברו את מחט ההזרקה למיקרו-מניפולטור המחובר למשאבת פניומטית PV eight 20 עם מיכל חנקן. בצעו dec coate לעובריים 24 שעות לאחר ההפריה והרדימו אותם עם trica במי דגים המכילים 0.3 PPM methylene blue.בשלב הבא, יישרו שלושה עד חמישה עוברי הרדמה על בסיס ג'ל AROS כאשר הצד הימני פונה כלפי מעלה לצורך ניתוח אחיד ונוח, טפטפו טיפה אחת עד שתיים של 1%LMPA על כל עובר והמתינו להת굳דותו כדי לקבע את העובר במקומו. סובבו את צלחת הפטרי כך שהשלפוחית האוזנית (otic vesicle) תהיה בצד ימין. לאחר מכן, הכניסו את המחט לתוך חלל השלפוחית האוזנית והזריקו את תמיסת המורפו באמצעות דוושת הרגל.מיד לאחר ההזרקה המיקרוסקופית, העבירו את העוברים המקובעים לתחנת האלקטרופורציה כדי להכין אותה לפעולה. ראשית, הדביקו בעזרת סרט דביק את אלקטרודות הטונגסטן המחודדות בקוטר של 75 micrometer למניפולטורים המיקרוסקופיים. לאחר מכן, מקמו את המניפולטורים המיקרוסקופיים משני צדי בסיס מיקרוסקופ הדיסקציה.הפעילו את מכשיר האלקטרופורציה והגדירו את הפרמטרים לאלקטרופורציה. הפרמטרים היעילים ביותר עבור ניסוי זה נמצאו כ שלושה פולסים של 13 volt למשך two milliseconds, כאשר בין כל פולס קיים מרווח של 100 milliseconds.החדירו את האלקטרודות כך שהשלפוחית האוטית (otic vesicle) תהיה מוקפת באופן שווה, כאשר אלקטרודה אחת נמצאת מעל השלפוחית האוטית והשנייה מתחתיה. לאחר מכן, העבירו זרם באמצעות דוושה או על ידי לחיצה על מפסק כאשר האלקטרופורציה מסתיימת. שפכו מי דגים על ה-agros והוציאו את העוברים באמצעות פיפטת זכוכית ועל ידי סיבוב עדין של הפלטה.יש לנהוג בזהירות כדי לא לפגוע בעוברים שקשה להוציא. השתמשו במחט כדי להסיר בעדינות כל LMPA המקיפה אותם. העבירו את העוברים לצלחת המכילה מי דגים עם methylene blue והגיעו בשלבי ההתפתחות הרצויים עבור צביעה אימונוהיסטוכימית מורפולוגית.בניתוח היברידיזציה כפולה ומיקרוסקופיה, מוצגים כאן תוצאות מייצגות של הזרקה לאוזן ואלקטרופורציה של מורפוסים. המקולה האחורית או השמיעתית, המסומנת כ-PM, היא אחד מאיברי השמיעה בדג כאשר היא מסומנת ב-Phin red. בתצלום זה, צמורי האקטין בסטריאוציליה של תאי השערה החושיים מופיעים כנקודות אדומות על הרקע.מקולה בצורת משוט כפי שנצפתה באמצעות סימון פלואורסצנטי עם Phalloidin בעוברים שלושה ימים לאחר ההפריה שהוזרקו עם MIF morphs בלבד, מראה מספר רב יותר של סיבי אקטין בתוך הסטראוציליים של תאי השערה בהשוואה לעוברים בני אותו גיל שעברו גם אלקטרופורציה וגם הזרקה. עם זאת, הזרקה ואלקטרופורציה עם morpho ביקורת סטנדרטי לא גרמו להפחתה ב-F-actin ובצביעה בהשוואה להזרקה של ה-morpho בלבד. התוצאות דומות במקולה האחורית, אם כי פחות דרמטיות לאחר חמישה ימים בזחלים שהוזרקו ועברו אלקטרופורציה בהשוואה לעוברי הזרקה של MIF Morphoses בלבד.לא היה הבדל בין הזרקה בלבד לבין הזרקה עם אלקטרופורציה כאשר נעשה שימוש ב-morph בקרה סטנדרטי. עובר זה, הצבוע בנוגדן נגד acetylated tubulin, לא קיבל הזרקה או אלקטרופורציה של MIF Morphoses. עובר זה עבר אלקטרופורציה אך לא קיבל הזרקה.שני העוברים מראים צביעה תקינה של tubulin אצטילט. שני עוברים אלו עברו הזרקה ואלקטרופורציה. הם הראו צביעת tubulin מופחתת באופן ניכר בהשוואה לבקרות, ומספר קטן בהרבה של שלוחות עצביות הקשורות לאוזן וכן לגנגליונים שסביבה.כאשר נעשה שימוש ב-morpho בקרה להזרקה ולאלקטרופורציה, לא ראינו הפחתה בהיקף הצביעה של acetylated tubulin, ולא ירידה באינרובציה על ידי הגנגליון האקוסטי בהשוואה להזרקת morpho בלבד. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בכשעתיים אם היא מבוצעת כראוי. החלק הקשה ביותר לשליטה בטכניקה הוא האלקטרופורציה; יש להקפיד במיוחד שלא לפגוע במוח, ואלקטרודות מחודדות יעזרו להקל על בעיה זו.

direct-delivery-mif-morpholinos-into-zebrafish-otocyst-injection

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Microinjection היא שיטה מבוססת ויעילה החדרת חומרים זרים לתוך עוברי דג הזברה מופרית. כאן, אנו להפגין טכניקה microinjection חזקים לביצוע overexpression mRNA, ואת הגן morpholino oligonucleotide מציאה מחקרים דג הזברה.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

וידאו זה מראה כיצד morpholino או mRNA יהיה ניתן להזריק לתוך עוברי דג הזברה בשלב אחד התא כדי להגדיל או להקטין את רמת המוצרים גן מסוים במהלך ההתפתחות הבאים.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

שיטה א 'תנאי מציאה ביטוי חלבון המטרה ברשתית דג הזברה מבוגר מתואר, הכוללת הזרקת intravitreally morpholinos antisense ו electroporating אותם לתוך הרשתית. החלבון המתקבל הוא הפיל במשך כמה ימים, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של החלבון או התחדשות הרשתית ללא פגע.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

אנו מתארים שיטה תנאי מציאה ביטוי של חלבון המטרה במהלך רגנרציה דג הזברה למבוגרים סנפיר. טכניקה זו כוללת מיקרו הזרקה ו electroporating oligonucleotide morpholinos antisense לרקמת סנפיר, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של חלבון בשלבים שונים של התחדשות סנפיר, כולל ריפוי פצעים, יצירת blastema, ואת תוצאה רגנרטיבית.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך למבוגרים התחדשות זנב סנפיר דג הזברה

האוזן הפנימית העכבר הוא איבר placode הנגזרות חושית אשר התפתחותית תוכנית מפורטת במהלך ההריון. אנו...

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation

הפרוטוקול מתאר הפלה ממוקדת של ביטוי גנים בדגי זברה על ידי הזרקת מורפולינו בזנב.

הזרקת מורפולינו: שיטה להפיל ביטוי גנים במטרה לחקור תפקוד בדגי זברה

במאמר זה, אנו מדגימים שיטה למניפולציה של ביטוי גנים בתאי חדריות של telencephalon דג הזברה המבוגר באמצעות oligonucleotides morpholino antisense. אנו מציגים שיטה זו כפרוטוקול יעיל ומהיר שיכול לשמש למחקרים תפקודיים במוח החולייתנים המבוגר.

מיקרומניפולציה של ביטוי גנים במוח דג הזברה למבוגר באמצעות Microinjection Cerebroventricular של oligonucleotides morpholino

שיטה להתאמה הפוכה גנטית לדג זברה כדי להעריך את תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות והומאוסטזיס פיסיולוגי כגון התחדשות רקמות באמצעות זריקות תוך חדרי של morpholinos גן ספציפי.

הפוך גישת morpholino גנטית באמצעות הזרקת לב חדרית לtransfect רקמות קשה ליעד מרובים בזחל דג הזברה

תוך שימוש באלקטרופורציה של ovo , פיתחנו שיטה לטרנספציה סלקטיבית של האוזן הפנימית השמיעתית וגרעין השבלול בעוברי עוף כדי להשיג פגיעה ספציפית לקבוצת התאים של חלבון פיגור שכלי X שביר במהלך תקופות בדידות של הרכבת מעגלים.

ניתוח תפקוד אוטונומי של תאים של חלבון פיגור שכלי X שביר במעגל שמיעתי על ידי אלקטרופורציה של In Ovo

בשנת הזרקה תוך חדרי ברחם ו electroporation של E16 עוברים עכברוש

למד שיטה למשלוח מורפולינו ישירות לשק האוזן ב-Danio rerio באמצעות מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה. טכניקה זו מאפשרת חקר ממוקד של התפתחות האוזן הפנימית והשפעות גנים על מערכת השמיעה.

משלוח ישיר של MIF Morpholinos Into Otocyst דג הזברה על ידי הזרקת electroporation משפיעה על פיתוח האוזן הפנימית

גלה סרטונים נוספים