שיטת Alternant את המודל המסורתי של נאס"א פריקה Hindlimb ב עכברים
10 במרץ 2011
פיתחנו hindlimb alternant פריקה מודל בעכברים. היתרון העיקרי של השיטה שלנו hindlimb זנב טבעת פריקה על הטכניקה המקובלת זנב המתיחה מורי-הולטון היא הליך פשוט פשוט זה ממזער הלחץ על החיה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע פריקה של הגפיים האחוריות (hind limb unloading או hu) בעכברים בשיטה פשוטה וישירה יותר, הממזערת את הלחץ על בעל החיים. שיטת קיבוע הזנב זו משרה בהצלחה אטרופיה של הגפיים האחוריות מבלי לפגוע בבריאות הכללית ובמשקל הגוף. השלב הראשון הוא השתלת טבעת זנב לעכבר בוגר.
חשוב לתעד את משקל הגוף ותצפיות בריאותיות לאורך כל המחקר. לאחר מכן, מרכיבים את מכשיר פריקת העומס מהגפיים האחוריות ומניחים אותו בתוך הכלוב שבו תתבצע הפריקה. ברגע שהבעל חיים התאושש, הוא ממוקם במכשיר לצורך הליך פריקת העומס.
בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות באמצעות מדידות של מסת הגוף ומסת השריר, שהראו אטרופיה שרירית בגפיים האחוריות של עכברים ללא עומס. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טכניקת ההדבקה של Maori Holton, הוא שעור הזנב נשאר גלוי תמיד. העכברים אינם מסוגלים להשתחרר ממכשיר התליה או לשחק עם הטבעת, והם מחלימים מהר יותר ושומרים על משקל גוף יציב.
שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחומי הפיזיולוגיה של השריר-שלד, וכן בביולוגיה של כבידה וחלל, כגון כיצד למנוע ניוון שרירי השלד ואובדן מסה גרמיים לאחר תקופות ממושכות של חוסר פעילות גופנית, מנוחה במיטה, קיבוע גפיים, מיקרו-כבידה, מחלות נוירומסקולריות ועם הגיל. רעיון זה עלה תחילה כאשר נתקלנו בסיבוכים בטכניקת הטייפינג של הזנב לפי Maury Holden. איבדנו באופן עקבי בעלי חיים ונתונים ניסיוניים עקב בריחתם של העכברים מהמכשיר לקיבוע הגפיים האחוריות בעת הדגמת טכניקה זו.
היום איתנו הם אנדרה פרארה, עמית מחקר בכיר מהמעבדה שלי. מסייעים לאנדרה הן ג'קלין קריסי, סטודנטית לדוקטורט במעבדה, ואנדרו דאן, סטודנט לתואר ראשון גם הוא מהמעבדה. התחילו בסטריליזציה של אזור הניתוח, הרדימו עכבר בוגר באמצעות isoflurine, ולאחר מכן רשמו את משקל העכבר והניחו אותו על פד חימום. הכינו את הזנב לניתוח על ידי קרצוף עם תמיסת chlorhexidine.
התחילו לספור מקצה שיער הגוף בבסיס הזנב כדי לאתר את הרווח הבין-חולייתי החמישי, השישי או השביעי בין שתי בליטות עצמיות בזנב. השתמשו בהמוסטט ובמחט 20 5G כדי ליצור חור פיילוט בין שתי חוליות לתוך הרווח הבין-חולייתי. הוציאו את המחט והכניסו תפר פלדה.
גזרו לאורך של 10 סנטימטרים דרך החור. 5 סנטימטרים של תפר צריכים לבלוט מכל צד של הזנב. הניחו את קצה האגודל על הזנב והשתמשו ביד החופשית כדי ללפוף את תפר הפלדה סביב האגודל.
סובבו את הקצוות כדי ליצור לולאה גדולה. החלק המגולגל או המעגלי צריך להיות באורך של פלוס או מינוס שלושה מילימטרים. קבעו גדיל אחד של התפר בעזרת המוסטט וכופפו אותו ללולאה קטנה יותר, שקציה המחוברת קרוב ככל האפשר לפיתול בלולאה הגדולה המקורית.
גזרו את עודפי התיל וכפפו את התיל המגולגל לאחור. עצרו דימומים עודפים באמצעות מקלו כסוף ניטראט (silver nitrate). אפשרו לבעל החיים להתאושש במשך חמישה עד שבעה ימים לפני פריקת הגפיים האחוריות או hu לאחר הניתוח.
הניחו את הבית בבודדות כדי למנוע מהטבעות הזנב להסתבך. הניחו מוט פלדה חרוץ ומצופה, בעובי 3/8 אינץ' וברוחב אינץ' אחד, מעל לכלוב והדביקו אותו בעזרת סרט דביק. הוסיפו דיסקיות ואום כנף נוספים, אך אל תהדקו אותם באופן מלא כדי לאפשר ביצוע התאמות מאוחר יותר.
החדירו את בורג המכונה דרך החור המרכזי של הסליל כדי למנוע ממנו ליפול. הברגו אום נעילה מניילון לקצה בורג המכונה. הסליל צריך להסתובב בחופשיות.
השחילו את סנאפ-הוק (snap hook) של מסובב דייג דרך החלק התחתון של הבובין. השתמשו בפלייר כדי לעצב וו בצורת S ממהדק נייר. השחילו קצה אחד של הוו בצורת S דרך החור של מסובב הדייג והדקו אותו בעזרת הפלייר.
מקמו תיל בצורת U במקביל לבורג המכונה בחלקו הפנימי של הכלוב וכופפו את הקצוות מעל הצד. כדי לתמוך בבקבוק מים מלא, הכניסו בקבוק מים לתוך התיל בצורת ה-U כאשר הברז פונה כלפי מטה, אך אינו נוגע בתחתית. אבטחו את בקבוק המים לכלוב בעזרת סרט דבק רב-שימושי (duct tape).
כופפו תפס בינדר בגודל שני אינץ' כך שיהיה פתוח, תוך השארת מתיחות מספיקה כדי להחזיק מספר חתיכות מזון מבלי למעוך את הגרגירים לפני הליך פריקת הגפיים האחוריות. רשמו את משקל העכבר לצורך השוואות. מאוחר יותר, הכניסו את הקצה הפתוח של וו ה-S דרך הטבעת הקטנה הבולטת מהזנב.
כוון את גובה העכבר על ידי הידוק או שחרור של בורג הכנף התחתון בבורג המכונה. הגפיים התחתונות לא צריכות לשאת משקל. לאחר הגעה לגובה האופטימלי, הדק את בורג הכנף העליון, ומקם מחדש את בקבוק המים באמצעות תיל מעוצב מחדש כך שהעכבר לא יוכל לטפס על הברז עם גפיו האחוריים.
כדי למדוד את צריכת המזון במהלך המחקר, שקלו את הכופתיות לפני הנחתן בתפסן הקיפוד (binder clamp). ספקו כ-8 עד 10 גרם כדי לאפשר צריכה של כ-5 עד 6 גרם מזון ליום. עבור כל מיקום של עכבר, הצמידו את תפסן הקיפוד עם המזון לתחתית הכלוב כך שהעכבר לא יוכל לטפס עליו, והדביקו אותו בעזרת סרט דביק חזק (duct tape).
השתמשו בשתי רצועות (Gores) בגודל שני על שני אינץ' באופן רפוי. לפפו את הזנב סביב הסיבוב של הדג. לפפו פיסה קטנה של זנב סביב הרצועות כדי להדק אותן לזנב.
שלב זה חשוב כדי למנוע מהזנב להשתהות כלפי מטה, דבר שיוביל למשיכת דם לקצה הזנב ולהפיכתו לנמקית. חזרו על אותו הליך עבור חיה נוספת בצד השני של הכלוב. כאשר משכנים שתי חיות בכלוב, מקמו אותן כך שהן כמעט יוכלו לגעת זו בזו.
במרכז הכלוב. אני מוסיף כמות קטנה של מצע תירס (cob bedding) לכלוב, תוך כדי וידוא שאין מספיק חומר כדי שהעכבר יוכל להשתמש בו ליצירת תלולית. לאחר הליך פריקת הגפיים האחוריות (hind limb unloading), הוצא את החיה מהמכשיר והסר את טבעת הזנב.
בעזרת קוצב חוטים, רשמו את משקל הגוף והחזירו את החיה לכלוב המגורים להחלמה. לאחר תקופת החלמה, ממתינים שוב ומודדים את השריר הסולאוס (soleus) ואת מסות בלוטות האדרנלין. משקלי הגוף לפני ניתוח הזינב לא היו שונים באופן מובהק מאלו של חמישה ימים לאחר הניתוח ולפני hu.
למרות שפריקה של הגפיים האחוריות למשך 14 ו-28 ימים הובילה לאובדן קטן אך לא מובהק במסת הגוף, העכברים התאוששו במלואם למשקל גופם שלפני ה-HU, לאחר שלושה ימי התאוששות. צריכת המזון עבור עכברי ביקורת ניידים ועכברי HU מוצגת כאן.
צריכת המזון היומית הממוצעת בעכברי HU לא הייתה שונה מזו של קבוצות הביקורת לאורך 28 ימים. נצפתה Atrophy משמעותית של שריר ה-soleus לאחר HU למשך 14 ו-28 ימים, מה שמעיד על הליך יעיל לאחר שלושה ימי התאוששות. מסת ה-soleus הייתה גדולה משמעותית משתי קבוצות ה-HU, אך עדיין קטנה משמעותית מזו של בעלי החיים בביקורת הניידת.
שתי בלוטות האדרנלין, השמאלית והימנית, הוצאו ונשקלו כדי לספק מדד לרמת הסטרס של החיה. כפי שניתן לראות כאן, המשקלים הממוצעים היו דומים בין עכברי הביקורת לעכברי HU. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים את ניתוח התפירה תוך חמש עד 10 דקות לכל עכבר, ואת סידור הכלוב תוך 15 דקות לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון Hein, limb reloading והשקמה מאטרופיה עקב חוסר שימוש, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האופן שבו מערכות השרירים והעצם יכולות להשתקם ולהגיב לתקופות ממושכות אלו של חוסר שימוש.
כעת, לאחר שצפיתם בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה כיצד לבצע פריקה של הגפיים האחוריות בעכברים. טכניקה זו מאפשרת לחקור רקמות ומערכות מרובות, כגון מערכות קרדיווסקולריות, שלד-שריר ומערכות פנימיות, תחת תנאים של פריקה וטעינה מחדש, ובשימוש במגוון מודלים של עכברים, כגון knockout או knockin.
סקירה כללית
מחקר זה מציג מודל חדש להסרת עומס מגפיים אחוריות בעכברים, המפשט את הפרוצדורה תוך מזעור השחיקה והסטרס של בעלי החיים. השיטה משרה ביעילות אטרופיה של הגפיים האחוריות מבלי לפגוע בבריאות הכללית ובמשקל הגוף.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום מדע
- פיזיולוגיה של מערכת השרירים והשלד
- ביולוגיה של כבידה וחלל
רקע
- שיטות קיימות, כגון טכניקת משיכת הזנב של Morey-Holton, עלולות לגרום לסיבוכים.
- טכניקות קודמות הובילו לאובדן בעלי חיים ולנתונים פגומים.
- קיים צורך בשיטות יעילות לחקר ניוון שרירים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה פשוטה יותר להסרת עומס מהגפיים האחוריות בעכברים.
- מזעור רמות הסטרס ושיפור זמן ההחלמה של בעלי החיים.
- הקלה על מחקרים למניעת ניוון שרירים ואובדן מסה גרמית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השתלה של טבעת זנב בעכברים בוגרים.
- ניטור משקל הגוף והמצב הבריאותי לאורך המחקר.
- הרכבת מכשיר להפחתת העמסה מהגפיים האחוריות.
- מדידת מסת הגוף ומסת השריר להערכת אטרופיה.
תוצאות עיקריות
- השיטה החדשה משרה בהצלחה ניוון של הגפה האחורית.
- בעלי החיים שומרים על משקל גוף יציב במהלך הפרוצדורה.
- נראות העור של הזנב מאפשרת ניטור טוב יותר.
מסקנות
- טכניקה זו מציעה חלופה מהימנה לשיטות קיימות.
- היא יכולה לסייע בהבנת ההשפעות של חוסר פעילות על בריאות השרירים.
- השיטה מועילה למחקר בתחומים פיזיולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
מודלים פרה-קליניים מהימנים של ניוון שרירים המושרה על ידי חוסר שימוש חיוניים לתיקוף מטרות (target validation) ולהפחתת סיכונים מכניסטיים בגילוי תרופות למערכת השלד והשרירים ולמטבוליזם. שיטה זו של פריקה לסירוגין של הגפיים האחוריות (HU) בעכברים מציעה רווחת בעלי חיים משופרת, הדירות ויעילות תפעולית בהשוואה למודלים המסורתיים של נאס"א (NASA). הפלטים הכמותיים החסונים שלה והפחתת הסיבוכים הפרוצדורליים תומכים בביטחון חיזוי בנקודות זמן מוקדמות של גילוי ובנקודות מפנה תרגומיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה קפדנית של נתיבים של ניוון שריר-שלד תחת תנאים מבוקרי חוסר שימוש.
- תומך בתיקוף של מטרות תפקודיות על ידי כימות תגובות שרירים ובלוטת העילוי לפריקה (unloading).
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מזעור גורמים מתקלים של סטרס בבעלי החיים וארטיפקטים פרוצדורליים.
- מספק נקודות סיום הניתנות לשחזור לצורך מיון פורטפוליו והחלטות מוקדמות של המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go).
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכות ביולוגיות מתוקפות וסטנדרטיות לסריקת תרכובות בשלבים הבאים.
- מבטיח שחזור ומדידה כמותית של ניוון שרירים והחלמה.
- מפחית שונות הנובעת מבריחת בעלי חיים או מפגיעה בזנב, ובכך משפר את מהימנות הבדיקה.
- מאפשר זרימות עבודה הניתנות להרחבה ומוכנות לפלטפורמה לצורך הערכת תרופות למערכת השריר-שלד.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלות של חוסר פעילות, קיבוע ומיקרו-כבידה.
- תומך ברצף מהשלבים המוקדמים של הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של התערבויות נגד ניוון שרירים (anti-atrophy).
- מספק נקודות סיום (endpoints) רלוונטיות תרגומית למחקרי ביומרקרים ויעילות.
- מפחית סיכונים בשלבי ההתקדמות על ידי שיקוף תרחישים קליניים של חוסר שימוש והחלמה.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
מודל HU זה משלב שלבי גילוי מוקדמים, זיהוי מובילים (lead identification) ותיקוף פרה-קליני, ובכך תומך בבדיקת היפותזות ובהערכה כמותית של מטרות שלד ושריר.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקה של השערת האפס עבור מנגנוני אטרופיה והשפעות של התערבות.
- סריקה: מספקת קריאות כמותיות הניתנות לשחזור של מסת השריר ומדדי מאמץ.
- אנליזה: תומכת בהשוואה סטטיסטית בין קבוצות התערבות לקבוצות בקרה באמצעות מדידות של מסת הגוף ומסת השריר.
- מחקר תרגומי: ממדלת תרחישים של חוסר שימוש בעלי רלוונטיות קלינית לצורך התאמת ביומארקרים והערכת יעילות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה סטנדרטית עם רמת סיבוך נמוכה, הניתנת להתאמה לגנוטיפים שונים של עכברים ולהתערבויות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי אטרופיה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, את השחזוריות ואת רווחת בעלי החיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות של go/no-go ואת היעילות ההונית על ידי הפחתת אובדן נתונים וכשלי פרוצדורה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון וקידום של תוכניות שריר-שלד ומטבוליות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות כירורגית להשתלת טבעת זנב ולניטור בעלי החיים.
- נדרש מי instrumentation מעבדתי סטנדרטי לניתוח בעלי חיים ולניתוח רקמות כמותי.
- דורש סטנדרטיזציה של שלבי הפרוצדורה ואיסוף הנתונים בין צוותים שונים.
- ניתן להתאמה למודלי עכברים שונים, כולל knockout וזנים רלוונטיים למחלה.
- מגבלות כוללות את הצורך בהחלמה לאחר הניתוח והשכנה קפדנית של בעלי החיים למניעת הסתבכות.
