Name: טיהור אבות מן שרירי השלד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: למדו לבודד תאי אב מיוגניים ואדיפוגניים משרירי שלד בעכברים באמצעות עיכול אנזימטי ומיון תאים זרימתי. שיטה זו מאפשרת ניתוח אינטראקציות תאיות בזמן התחדשות רקמה בחי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. אוסף רקמות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בעכברים בין 7 ל 12 שבועות. בדרך כלל, לפחות שני בעלי חיים משמשים: האחד הוא להגדיר את FACS צבע שולט יחיד נדרש פיצוי עבור הקרינה מינוס אחד דגימות בקרה אלוטיפ. השני הוא מדגם בפועל למיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים משאיפת CO 2 או לפי פרוטוקול אתיקה של בחירה. עכברים מניחים על מגבת נייר, פונה כלפי מעלה, ולרסס עם אתנול 70% ביסודיות על מנת למנוע זיהום עם פרווה העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את העור באזור הבטן עם מלקחיים, ולאחר מכן לבצע חתך אורכי קטן במספריים חדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קולפים את שני קפלי עור בכיוונים מנוגדים (למעלה ולמטה) כדי לחשוף לגמרי את שרירי הגפיים האחוריות מתחתיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת השריר והבלו ידי הוספת והארכת מספריים לאורך שני הצדדים של השוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך זהה עבור עצם הירך כדי לחלץ את רקמת השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמים את כל רקמת שריר נכרת ב-60mm פטרי מנות, באמצעות צלחת אחת עבור הרקמה מהעכבר כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הנ"ל עבור כל העכברים. </li></ol> 2. לנתק את רקמות לתוך התאים על ידי יחיד עיכול אנזימטי: לאורך קטע זה של הפרוטוקול, להשתמש ריאגנטים סטרילית כלים לעבודה בתנאים סטריליים. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ"ל של collagenase II (Sigma, חתול # 6885, 500u / mL) ו - 20 μL של המניה 250mm CaCl 2 אל צלחת פטרי כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרוע את רקמת השריר לחתיכות קטנות (כ 1 מ"מ 3) עם שני מלקחיים (אחד משונן, אחת מתוך כלים מדע טוב, עם 2 שיניים, חתול # 11051-10, 11154-10), לשים לב להסיר ולסלק כמה מזוהם ללא רקמות השריר ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את פטרי, כלים דגירה אותם 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר את פטרי, כלים להשתמש הבוכנה 3 מ"ל המזרק ביסודיות מחית החלקים רקמות. השתמש באחת הבוכנה עבור כל דגימה, כדי למנוע זיהומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף קצת (~ 5 מ"ל) סטרילי קר PBS על צלחת פטרי כל העברת הבוצה רקמה לתוך צינור פלקון 50 מ"ל (לשטוף את צלחת פטרי, אם יש צורך לשחזר את כל הרקמה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער את הצינורית פלקון במרץ, למלא את הצינור עם PBS, צנטריפוגה @ 800rpm x 5 דקות (דגם Eppendorf הספסל העליון: 5810R), וכן לשאוב supernatant (חוזר 3 פעמים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים תערובת של 1mL collagenase ד '(רוש, חתול # 11088882001, 1.5u / mL) / Dispase II (רוש, חתול #: 04942078001, 2.4u / mL) ו 10μL של CaCl 2 (250mm) כדי צינור אחד, דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם רוטציה למשך שעה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5-10 מ"ל של מערבולת קר, סטרילי, PBS ו פיפטה ביסודיות כדי homogenize הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את צינורות עם PBS ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הנוזל מסננת תא 40μm מונח על גבי צינור פלקון 50 מ"ל לסנן את חתיכות גדולות של רקמה הנותרים. מחלקים כל דגימה שווה לשלוש מבחנות פלקון 50 מ"ל. מלאו את כל הצינורות עם PBS אז צנטריפוגות @ 1600rpm במשך 5 דקות על 8 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant לאסוף תאים מכתים. </li></ol> 3. נוגדן מכתים ומיון: לאורך קטע זה של הפרוטוקול, להשתמש FACS סטרילית מאגרים לאיסוף ולעבוד בתנאים סטריליים. נוגדנים מסחרי נחשבים בדרך כלל סטרילי אם ינוהלו כהלכה. <ol start="20" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת צבע יחיד ושליטה דגימות אלוטיפ, resuspend המדגם במאגר FACS 1mL ולחלק את התאים מושעה בתשע 1.5mL מראש שכותרתו צינורות Eppendorf (100 μL כל שפופרת). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מכתים צבע יחיד מערבב על פי הטבלה הבאה: שים לב: הריכוז הסופי של נוגדנים לשלוט אלוטיפ את הכתם צריך להתאים לזה של נוגדן הראשוני הם הבקרה. לדוגמה, אם אנטי SCA-1 משמש 1 μg/10 6 תאים, אלוטיפ המתאים יש להשתמש בריכוז זהה. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Tube # </td><td> שם שפופרת </td><td> חברה </td><td> חתול # </td><td> שיבוט </td><td> אלוטיפ </td><td> מהילה </td></tr><tr><td> 1 </td><td> ללא כתם </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> Hoechst33342 </td><td> סיגמא </td><td> B2261 </td><td></td><td></td><td> 2-5ug/ml </td></tr><tr><td> 3 </td><td> PI </td><td> סיגמא </td><td> P4864 </td><td></td><td></td><td> 1ug/ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> 4 </td><td rowspan="2"> CD31-FITC CD45-FITC </td><td> ebioscience </td><td> 11-0311-85 </td><td> 390 </td><td> עכברוש IgG2a </td><td> 500 </td></tr><tr><td> בית עשה </td><td></td><td> I3 / 2 </td><td> עכברוש IgG2b </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Sca1-PECY7 </td><td> ebioscience </td><td> 25-5981-82 </td><td> D7 </td><td> עכברוש IgG2a </td><td> 5000 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> α-7 APC </td><td> בית עשה </td><td></td><td> R2F2 </td><td> עכברוש IgG2b </td><td> 1000 </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מכתים אלוטיפ לשלוט מתערבב באמצעות הטבלה הבאה: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Tube # </td><td> שם של הצינור </td><td> Hoechst </td><td> PI </td><td> CD31- FITC </td><td> CD45- FITC </td><td> Scal- PE-CY7 </td><td> -7- APC </td><td> Rat- IgG2b- APC </td><td> Rat- IgG2a- pecy7 </td><td> Rat- IgG2a- FITC </td><td> Rat- IgG2b- FITC </td></tr><tr><td> 7 </td><td> שוה CD31 / CD45 </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> 8 </td><td> שוה Scal- pecy7 </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 9 </td><td> שוה α-7-APC </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet יחיד צבע איזוטופ מכתים לשלוט מתערבב (אנחנו בדרך כלל להתאים את הריכוז של נוגדנים כך בין 5 ל 10 μL של מכתים לערבב מתווספים כל דגימה) לתוך הצינור Eppendorf המתאים שלב 20. מערבבים היטב לדגור על הקרח במשך שעה 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם תאים העכבר מדגם 800μL עם קוקטייל של נוגדנים (להלן) למיון תא FACS. מערבבים היטב לדגור על הקרח במשך שעה 1. קוקטייל נוגדנים: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, Sca1-PECY7, α-7 APC שים לב: יחס אופטימלי של נוגדנים לתאי צריכות להיקבע על ידי כל אחד בנפרד titrating נוגדנים, כמו הבדלים משמעותיים עשויים להתקיים בין קבוצות. כמות אופטימלית של נוגדנים כדי לשמש צריך לבוא לידי ביטוי μgs של נוגדנים לכל 10 6 תאים היעד והמשיך קבוע בעת השימוש אצווה אותו נוגדן. ברור שאם את מספר התאים היעד אינו משתנה משמעותית בין ניסויים, או אם נפח מכתים ישתנה עם מספר תאים, דילול קבוע של נוגדן זה יכול לשמש גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי: הוסף 1mL של כ חיץ FACS לכל אחד 9 צינורות שליטה; להוסיף 20mL של כ חיץ FACS אל הצינור המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות Eppendorf @ 3000rpm במשך 5 דקות (Eppendorf צנטריפוגות גבי ספסל, דגם: 5417C). צנטריפוגה צינור דגימה @ 1600rpm במשך 5 דקות (למעלה Eppendorf ספסל צנטריפוגות, דגם: 5810R). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק supernatant מכל הצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend במאגר FACS (1mL עבור כל אחד שולט, 4mL למדגם מיון), תאים פיפטה לתוך "צינורות FACS" דרך מסננת תא כובע (חתול פלקון BD # 352235, 40μm גודל הנקבוביות) כדי להסיר גושים שנותרו שעשויים להשפיע על cytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת סדרן FACS עם צבע שולט יחיד ושולט אלוטיפ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים ממוינים על פי הטבלה הבאה חיץ mL 3.5 אוסף (95% DMEM, 5% FBS) בנפרד. בדרך כלל, כאשר קצירת הן הגפיים האחוריות, עכבר אחת סוג בר יכולה להניב כ 150,000 ובתאים myogenic או 100,000 ובתאים adipogenic, עם הכדאיות מעל 95%, דהיינו על ידי FACS ידי תאים ממוינים reanalyzing בסוף ההליך (איור 1 ) הגדרה של אבות myogenic ו adipogenic מבוסס על משטח מכתים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן / כתם </td><td> אבי Myogenic (MP) </td><td> אבי Adipogenic (AP) </td></tr><tr><td> Hoechst </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> PI </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD31-FITC </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD45-FITC </td><td>- </td><td> - </td></tr><tr><td> Sca1-PECY7 </td><td> - </td><td> + </td></tr><tr><td> α-7 APC </td><td> + </td><td> - </td></tr></tbody></table></li></ol> 4. השתלה: <ol start="28" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים ממוינים @ 1500rpm במשך 5 דקות, להסיר את התאים supernatant ולהעביר autoclaved Eppendorf צינורות (1.5 מ"ל), לשטוף עם תאים μL של 500 סטרילי PBS (נסיוב בחינם!), ואז צנטריפוגות @ 3000rpm במשך 5 דקות. שמירה על כל ריאגנטים בתנאים סטריליים ולעבוד במנדף בתרבית רקמה, resuspend אבות myogenic ב-PBS, או אבי adipogenic ב Matrigel (חתול BD # 354234) על כ 10 6 תאים / מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתלות או אבי אבות myogenic adipogenic לעכברים הנמען. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את העכבר עם isoflouran פי מדיניות המוסד שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את השיער סביב איזור ההזרקה, ולאחר מכן לחטא את העור על ידי שפשוף עם אתנול 70% </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 20μL של אבות myogenic או אבות adipogenic (= 20k תאים) באמצעות 3 / 10 מזרק אינסולין CC (חתול BD # 309300). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן מתאים (שלושה שבועות עובד היטב, אבל הבעת myofibers התורם הנגזרות סמנים מהונדס הם בדרך כלל מאליה בתוך שבוע לאחר ההשתלה), לטשטש את העכברים הנמען משלב 29 בזריקה intraperitoneal של 400 Avertin μL (חתול Sigma # T04840-2, 25 מ"ג / מ"ל), אנקב transcardially עם 50 מ"ל PBS (מכיל 10 מיקרומטר של EDTA) הראשון, ואחריו 15 מ"ל של PFA 4%. איסוף רקמות היעד, שלאחר לתקן עם PFA 4% בין לילה, אם נדרש, ואז להעביר סוכרוז 20% בין לילה. שבץ להקפיא, אוקטובר ו cryosection. </li></ol> 5. נציג תוצאות: כאשר חבר פרלמנט מושתלים לתוך השריר שלד העכבר, הם בקלות עם הפתיל קיימים myofibers. לכן כל תווית גנטי הנוכחית בתאי התורם יהיה להבחין בקלות הסיבים כי קיבל אותם. תרשים 2 מציג דוגמה שבה הביע את התאים המושתלים phostphatase אלקליין בני האדם, גילו histochemically. כאשר AP מושתלים התוצאה היא תלויה מאוד בסביבה של אתר ההשתלה: כאשר המושתלים מתחת לעור תאים אלו כדי לתת מקורות adipocytes ו myofibroblasts (ראה איור 2). באתרים רבים אחרים, כולל שרירים, הם אינם שורדים אלא ניוון שומן כבר המושרה 3. <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. מיון אסטרטגיה לבידוד של אוכלוסיות אבי מן שרירי השלד (א) אסטרטגיה מיון:. תאים חיים זוהו המבוססת על פיזור קדימה פיזור לוואי. מכתים Hoechst שימש להוציא פסולת anuclear ו יודיד propidium (PI) מכתים להוציא תאים מתים. Hematopoietic (CD45) לבין האנדותל (CD31) תאים הוצאו משערי מיון. Α7 Hoechst + + PI - CD45 - CD31 - Scal - משנה זה מכיל את כל אבות myogenic (MP). + + Scal Hoechst לצרכן - CD45 - CD31 - α7 - האוכלוסייה כוללת אבות adipogenic (AP). (ב) Fluorescence מינוס אחד (FMO) שולטת אלוטיפ לאשר את הספציפיות של הכתם. (ג) טוהר בדיקות של תת MP ו AP לאחר מיון. <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. תוצאות נציג הבאים MP ו AP השתלה. AP הושתלו תת עורי (פאנל עליון) MP לתוך שריר (הפאנל התחתון). בשני המקרים, תאים התורם שמקורה עכבר מהונדס המבטא phosphatase אלקליין אדם, שזוהה על ידי מכתימה את החום.

<ol><li>Buckingham, M., Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle stem cells.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 330-336 (2008).</li>
<li>Relaix, F., Marcelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 21, 748-753 (2009).</li>
<li>Joe, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).</li>
<li>Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro%2Fadipogenic+progenitors%3A+A+double-edged+sword+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Cycle. 9, (2010).</li>
<li>Sherwood, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors%3A+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119, 543-554 (2004).</li>
<li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. , (2008).</li>
<li>Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309, 2064-2067 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מטרת פרוטוקול זה היא איזון סביר בין תשואות גבוהות כדאיות גבוהה של תאים מטוהרים. השלב הקריטי ביותר להבטיח כי תאים בריאים הם התאוששו הוא, כצפוי, ניתוק האנזימטית של רקמת המוצא. הטיפול של הרקמה צריך להיות עדין במיוחד, אשר קשה להוכיח או להעריך אפילו בפורמט אורקולי. גורם המפתח הוא אורך ההליך. ככל שנדרש כדי לצאת מן התורם אל החיה הנמען, התחתון את הכדאיות, ולכן את היעילות engraftment. אם יש איזו שאלה לגבי כדאיות שלא ענה מיד על ידי הסתכלות תדירות האירוע לצרכן חיובי דגימות תאים מטוהרים לאחר מיון, אנו ממליצים כי assay דילול הגבלת למדוד clonogenicity מבוצעת 3. מיני טיפוסיות מן השריר ניזוק באופן שגרתי התשואה על 1 ב 15-20 תאים המסוגלים ליזום מושבות myogenic או fibro / adipogenic במבחנה. בעוד למעשה 100% במושבות יזם של חברי פרלמנט להכיל myotubes הבדיל, רק כשליש מושבות המתקבל FAPs מכילים adipocytes בנוסף חלקה אקטין myofibroblasts שריר חיובית.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Collagenase II </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C-6885, </td><td> 500 u / ml </td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> רוש </td><td> 11088882001 </td><td> 1.5 u / ml </td></tr><tr><td> לעקור II </td><td> רוש </td><td> 04942078001 </td><td> 2.4 u / ml </td></tr><tr><td> תא מסננת </td><td> BD </td><td> 352340 </td><td> 40 מיקרומטר </td></tr><tr><td> Tube עם מסננת תא </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> 40 מיקרומטר </td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> B2261 </td><td> 2-5 UG / ml </td></tr><tr><td> CD31-FITC </td><td> Ebiosciences </td><td> 11-0311-85 </td><td> Clone 390 </td></tr><tr><td> CD45-FITC </td><td> תוצרת בית </td><td></td><td> Clone I3 / 2 </td></tr><tr><td> Sca1-PECY7 </td><td> Ebiosciences </td><td> 25-5981-82 </td><td> Clone D7 </td></tr><tr><td> α-7 integrin APC </td><td> תוצרת בית </td><td> תחקור עם רוסי מעבדה </td><td> R2F2 </td></tr></tbody></table>

טיהור אבות מן שרירי השלד

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

שריר השלד מכיל אוכלוסיות מרובות אבי ממוצא עובריים ברורים הפוטנציאל ההתפתחותי. אבות Myogenic, בדרך כלל תושבי &quot;העמדה תא הלוויין&quot; בין הממברנה myofiber פלזמה הממברנה laminin עשיר במרתף ensheaths זה, הן עצמית חידוש התאים מחויבים אך ורק 1,2 את השושלת myogenic. תיארנו לאחרונה מדרגה שנייה של אבות כלי קשורה כי ניתן להפיק myofibroblasts ו adipocytes לבן, אשר מגיב נזק על ידי הפצת ביעילות הכניסה ומספקת תמיכה trophic לתאי myogenic במהלך התחדשות רקמות 3,4. אחת מבחני האמינים ביותר לקבוע את הפוטנציאל ההתפתחותי ועל ההתחדשות של האוכלוסייה תא נתון מסתמך על הבידוד שלהם השתלת 5-7. לשם כך יש לנו אופטימיזציה פרוטוקולים לטיהור שלהם על ידי cytometry לזרום שריר ניתק enzymatically, אשר נתאר במאמר זה. האוכלוסיות שהושגו בשיטה זו תכלול גם תאים המושבה myogenic או fibro / adipogenic יוצרים: אין סוגי תאים אחרים ומסוגלים להרחיב במבחנה או לשרוד במשלוח vivo. עם זאת, כאשר אוכלוסיות אלו משמשים מיד לאחר למיין את ניתוח מולקולרי (למשל qRT-PCR) יש לזכור כי תת מיון טרי עשוי להכיל תאים מזהמים אחרים כי חוסר היכולת של יוצרים מושבות או engrafting הנמענים.

שיטת ניתוק האנזימטית, תיוג משטח וטיהור על ידי cytometry זרימה של fibro / adipogenic ואת אבות myogenic מן שרירי השלד Murine.

שריר שלד מכיל מספר אוכלוסיות של תאי פרוגניטור בעלי מקורים עובריים שונים ופוטנציאל התפתחותי שונה. פרוגניטורים מיוגניים, השוכנים בדרך כלל...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבודד תאי אב מיוגניים ואדיפוגניים חיוניים משריר שלד תואם. דבר זה מושג תחילה על ידי קצירת רקמת שריר מעכברים שהורדמו. כשלב שני, הדגימה עוברת עיכול אנזימטי, המפרק את הרקמה לתאים בודדים.בשלב הבא, נעשה שימוש במיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) כדי לבודד את תאי הפרוגניטור. התוצאות המתקבלות מראות חיוניות ודיפרנציאציה של התאים המבודדים כאשר הם מושתלים בעכברי מקבל, בהתבסס על צביעה היסטוכימית עבור הסימון הגנטי, שבמקרה זה הוא alkaline phosphatase אנושי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות כמו prepl הוא שניתן לבודד את התאים ישירות מהחיה בנקודות זמן שונות.לדוגמה, לאחר השראת נזק לרקמה, שמשמעותה היא שאין ברירה של אוכלוסיית התאים, ניתן לנתח את אוכלוסיית התאים ברמה המולקולרית כדי לבחון את השלבים השונים שבהם עוברים התאים במהלך תהליך של רגנרציה in vivo. לפיכך, טכניקה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלה קריטית בתחום רגנרציית הרקמות, ובמיוחד, איזה תפקיד ממלא כל סוג תא במהלך רגנרציה in vivo וכיצד סוגי תאים אלה מקיימים אינטראקציה זה עם זה כדי לבנות מחדש רקמה בריאה? המשמעות של טכניקה זו משתרעת עד לטיפול במחלות כגון דיסטרופיה שרירית.מכיוון שחקר תאי מקור אלו עשוי לאפשר בסופו של דבר אסטרטגיות רגנרטיביות לסוג זה של מחלות. בנוסף, ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על מספר רקמות אחרות, מהלב ועד לרקמת שומן, שכן תאי מקור פיברו-אדיפוגניים נמצאו לפחות בכל רקמה שבדקנו עד כה. באופן כללי, מי שאינו בקי בטכניקה זו עלול להיתקל בקושי, מכיוון ששיטות דיסוציאציה אגרסיביות יפחיתו את חיוניות התאים וייצרו עודף של פסולת תאית (debris), אשר תפריע להמשך הפרדה נקייה של התאים.הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר החלטנו להחיל את הציטומטריה הזרימה, המשמשת בדרך כלל עבור תאי APOE, על חקר של תאי גזע ברקמות מוצקות. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא חשובה, שכן את שלבי פירוק הרקמה קשה ללמוד מכיוון שקושי רב לתאר אותם כראוי. את הטכניקה ידגים היום לינקי, עוזר מחקר במעבדה שלי, אשר פיתח ואופטימיז את השיטה לראשונה. לצורך הליך זה, נדרשים לפחות שני עכברים.עכבר אחד משמש להפקת תאים כדי לספק את בקרות הצבע הבודד ובקרות האיזוטייפ של הנוגדנים הנחוצות לעובדות, והשני יספק את הדגימה למיון. כדי להתחיל, השג עכברים בני שבע עד 12 שבועות שהורגו קודם לכן במנדף מעבדה סטרילי. הנח את העכבר ההרוג על נייר סופג סטרילי, כשהוא פונה כלפי מעלה, ורסס את הפרווה ביסודיות ב-70% ethanol כדי למנוע זיהום, כאשר ביד אחת פינצטה וביד השנייה מספריים חדים.הרימו את העור באזור הבטן ובצעו חתך אורכי קטן. אחזו בעור משני צידי החתך וקלפו אותו לאחור כדי לחשוף לחלוטין את שרירי הגפה האחורית. לאחר מכן, הסִירו את רקמת השריר על ידי הכנסת המספריים במצב סגור מתחת לשריר ומעל ל-tibia, ולאחר מכן פתיחת המספריים.הקצה האחורי של הלהבים יכריח בעדינות את הפרדת השריר מהטיביה. חזור על הפעולה עבור שני צדי הטיביה והנח את הרקמה בצלחת פטרי בנפח 60 millimeter. כעת הסר את רקמת השריר מהפמור באופן דומה והוסף את הרקמה לצלחת הפטרי.חזרו על הפעולה עבור כל עכבר תוך שימוש בצלחת פטרי אחת לכל עכבר. לאחר מכן, בצעו דיסוציאציה לרקמה לתאים בודדים. הוסיפו שתי מיליליטר או 1000 units של collagenase, ו-20 µL של תמיסת סטוק של calcium chloride בריכוז 250 mM לכל צלחת פטרי של רקמת שריר.לאחר מכן, בעבודה מהירה ומדויקת, השתמשו בשתי פינצטות אפורות, אחת משננת ואחת עם שתי שיניים, כדי לקרוע את הרקמה לחתיכות של מילימטר מעוקב אחד. הסירו והשליכו כמה שיותר רקמה שאינה רקמת שריר.כסו את צלחות הפטרי והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. לאחר ההדגרה, הוציאו את הצלחות והחזירו אותן למנדף המעבדה הסטרילי. הסירו את הבוכנה ממזרק של 3 mL והשתמשו בה כדי למעוך את הרקמה.השתמשו בבוכנה אחת לכל צלחת כדי למנוע זיהום צולב. הוסיפו כ-5 ml של PBS סטרילי קר לכל צלחת פטרי והעבירו את תכולת הצלחת לשפופרת קונית של 50 ml. שטפו עם 5 ml נוספים של PBS כדי לאסוף את כל הרקמה והוסיפו אותה לשפופרת הקונית.שטפו וסבבו את הדגימות בצנטריפוגה שלוש פעמים בהתאם לפרוטוקול. לאחר מכן, הוסיפו לכל מבחנה 1 mL של תמיסה המורכבת מ-collagenase D dys space two ו-calcium chloride, והדגירו ב-37 °C תוך סיבוב למשך שעה אחת. לאחר ההדגרה, הוסיפו למבחנות 5 mL של PBS סטרילי קר, ערבבו קצרות במכשיר וורטקס (vortex) ובצעו טריטורציה (tritration) מספר פעמים כדי לפרק גושים.מלאו את המבחנות ב-PBS, ערבבו היטב והניחו על קרח. כדי להסיר שאריות של חתיכות רקמה גדולות, הניחו מסננת תאים של 40 מיקרון מעל מבחנה קונית של 50 מיליליטר על קרח וסננו את תרחיף התאים. חלקו את הנוזל שעבר סינון באופן שווה לשלוש מבחנות קוניות של 50 מיליליטר המלאות ב-PBS קר וסטרילי, וסבבו בצנטריפוגה במהירות של 1600 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורה של שמונה מעלות צלזיוס. לאחר הסבוב בצנטריפוגה, הסירו בזהירות את ה-S והניחו את התאים על קרח לצורך צביעה ומיון של תאי אב מיוגניים ואדיפוגניים.ראשית, הכינו את ששת הביקרות המעורבבות לצביעה בצבע בודד בהתאם לפרוטוקול הכתוב המצורף. ביקרות אלו כוללות דגימה ללא צביעה, צביעת hulk, propidium iodide, נוגדנים המסומנים ב-FSE עבור CD 31 ו-CD 45, נוגדן המסומן ב-SC one P size seven ונוגדן המסומן ב-alpha seven A PC. לאחר מכן, הכינו את שלוש תערובות הצביעה לביקורת איזוטיפ של הנוגדנים בהתאם לפרוטוקול הכתוב.לאחר הכנת תערובות הצביעה, סמנו תשעה מבחנות Eppendorf בנפח 1.5 מיליליטר עבור דגימות הצבע הבודד ובקרת האיזוטייפ. השביו ואיחדו את התאים משלוש המבחנות הקוניות לנפח כולל של 1 מיליליטר של FACS buffer. לאחר מכן, העבירו 100 מיקרוליטר של תאים לכל מבחנת בקרת Eppendorf מסומנת, וטפטפו בעזרת פיפטה בין 5 ל-10 מיקרוליטר מתערובות הצביעה למבחנות הבקרה המתאימות, בהתאם לריכוז הנוגדנים.יש להשהות מחדש את התאים מהעכבר מהמדגם ב-200 µL של בופר FACS ולהעביר לאחד מהמבחנות הקוניות בנפח 50 mL. לאחר מכן, יש להוסיף 800 µL מתערובת הנוגדנים. ערבב כל אחת מהמבחנות הביקורת וממבחנות המדגם.דגרו אותם על קרח למשך שעה אחת. לאחר הדגירה, שטפו את התאים על ידי הוספת 1 mL של FACS buffer לכל אחת מתשעת מבחנות הביקורת וכ-20 mL של FACS buffer למבחנת הדגימה. סובבו את מבחנות הביקורת בצנטריפוגה במהירות של 3000 RPM למשך חמש דקות.סבב את מבחנת הקונוס עם הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 1600 RPM למשך חמש דקות. לאחר מכן, שאב והשלך את הנוזל שמעל המשקע לאחר הצנטריפוגה. השהה מחדש את תאי הביקורת בכל מבחנה במיליליטר אחד של fax buffer, והשהה מחדש את תאי הדגימה בארבעה מיליליטר של fax buffer.הוסף propidium iodide לתאי הדגימה ולביקרי האיזוטייפ, וכן למבחנת הבקרה של צבע בודד (pi). העבר את התאים למבחנות fax באמצעות מכסה עם מסנן תאים כדי להסיר גושים שנותרו שעלולים להשפיע על הציטומטר.הגדירו את מכשיר ה-fax עם צבע בודד ובקרות איזוטייפ. מיינו את תאי הדגימה בהתאם לפרוטוקול הכתוב המצורף ואספו כל אוכלוסייה בנפרד לתוך מבחנת איסוף של 3.5 milliliter. פרוגניטורים מיוגניים חיוניים הם האוכלוסייה שהיא hulked ו-alpha seven a PC positive ו-PI CD 31 FE CD 45 FE ו-ska.תאי אב אדיפוגניים חיוניים שליליים ל-One PE size seven הם hulked, בעוד ש-ska one PE size seven חיוביים ו-pi CD 31 FE CD 45 FE ו-alpha seven a PC שליליים. עכבר wild type בודד עשוי להניב כ-1×10⁵ תאי אב אדיפוגניים, ו-1.5 עד 2×10⁵ תאי אב מיוגניים עם חיוניות של מעל 95%.כדי להכין את התאים להשתלה בעכברים מארחים, יש לשטוף את התאים. ראשית, סבבו במערבל צנטריפוגה את התאים המעוותים במהירות של 1500 RPM למשך חמש דקות. הסירו את הנוזל העליון (supernatant), השהו שוב את התאים ב-500 microliters של PBS והעבירו אותם למבחנות einor.סבבו את המבחנות בצנטריפוגה במהירות של 3000 RPM למשך חמש דקות והסירו את הנוזל העליון (supernatant). לאחר מכן, השהו מחדש תאי אב מיוגניים ב-PBS או תאי אב אדיפוגניים ב-matrigel בריכוז של כ-10⁶ תאים למיליליטר. לאחר הכנת העכברים המארחים המורדמים עבור כל סוג של תאי תורם, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמשו במזרק אינסולין של 0.3 סמ"ק כדי להזריק 20 µL המכילים כ-20,000 תאי אב מיוגניים או אדיפוגניים.המתינו את פרק הזמן המתאים להבחנה של התאים המושתלים, בדרך כלל כשלושה שבועות. לאחר מכן, בודדו את רקמת המטרה והכינו אותה לחיתוך קריוגני (cryosectioning) כפי שמתואר בפרוטוקול בדמות זו. אסטרטגיית המיון מוצגת לצורך בידוד פרוגניטורים אדיפוגניים ומיוגניים; תאים חיוניים זוהו על בסיס פיזור קדימה (forward scatter) ופיזור צידי (side scatter). צביעת Hoechst שימשה להדרה של פסולת גרעינית, וצביעה ב-propidium iodide או PI שימשה להדרה של תאים מתים. תאים המטופויטיים ואנדותליאליים, או תאי CD 45 ו-CD 31 בהתאמה, הודרו לאחר מכן משערי המיון. לבסוף, נבחרה תת-האוכלוסייה החיובית ל-alpha seven.תאי SKA one שליליים כוללים את כל התאים הקדמונתיים המיוגניים ואת האוכלוסייה שהיא alpha seven שלילית. תאי SKA one חיוביים כוללים את כל התאים הקדמונתיים האדיפוגניים. בקרות איזוטיפ של פלואורסצנציה מינוס אחת מאשרות את ספציפיות הצביעה. בנוסף, בוצעו בדיקות טוהר של תתי-האוכלוסיות האדיפוגניות והמיוגניות.לאחר מיון בדוגמה מייצגת זו, ניתן לזהות ברקמת המאחס, באמצעות היסטוכימיה, תאי תורם של פרוגניטורים אדיפוגניים המבטאים פוספטאזה 알קלית אנושית טרנסגנית שהוזרקו תת-עורית, כפי שמעיד הצביעה החומה. תאי תורם של פרוגניטורים מיוגניים המבטאים פוספטאזה אלקלית אנושית טרנסגנית שהוזרקו תוך-שרירית זוהו בחתך רקמה זה, כפי שמוצג בצבע חום.שימוש בהיסטוכימיה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בחמישה שעות אם היא מבוצעת כראוי. אם מעבדים מספר רב יותר של דגימות, הזמן יעלה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעבוד במהירות ובעדינות.לפיכך, יש להימנע מעיבוד של מספר רב מדי של דגימות בו-זמנית. הארכת זמן העיבוד תפחית באופן משמעותי את השונות התאית בעקבות הליך זה. ניתן לבצע גם שיטות אחרות, כגון ניתוח ביטוי של colono SC OG באמצעות quantitative R-T-P-C-R, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון: כיצד תאים פרוגניטורים אלו מגיבים לנזק in vivo לאחר התפתחותם?טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים אחרים בתחום רגנרציה של רקמות לבחון את התקשורת בין התאים הפרו-גניטוריים ברקמה פגועה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע דיסוציאציה של רקמות אלו ללא נזק. התאים הפרו-גניטוריים מזוהים על סמך סממנים שירותיים, ופוטנציאל הפיתוח שלהם ננתח in vivo.תודה שצפיתם. בהצלחה בניסוי שלכם.

purification-of-progenitors-from-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הבידוד והתרבות של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין שקטים, אוכלוסיית תאי גזע שריר, הוא חיוני להבנה של ביולוגיה שרירים תאי גזע והתחדשות, כמו גם בתאי גזע להשתלה עבור טיפולים בניוון שרירים ומחלות ניווניות אחרות.

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

כלי דם בתוך אוכלוסיות אנושיות נמל שריר שלד כמה רבת שושלת המבשרת כי הם אידיאליים עבור יישומי משובי. שיטת בידוד זה מאפשרת טיהור בו זמני של שלוש אוכלוסיות תאי מבשר multipotent בהתאמה משלוש שכבות מבניות של כלי דם: תאי myogenic אנדותל מאינטימה, pericytes מתקשורת, ותאי adventitial מadventitia.

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

כאן אנו מתארים פרוטוקול המבוסס על תכנות מחדש אפיגנטיים של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לכיוון יצירת אוכלוסייה הומוגנית של אבות שלד שריר כי בתנאי תרבות המתירנית יצירת צבירים תלת ממדיים של myofibers ההתכווצות (myospheres), אשר מסכמים תכונות ביולוגיות של אדם שרירי שלד.

דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

בתרבות חוץ גופית מערכות הוכיחו הכרחיות להבנה של myogenesis חוליות שלנו. עם זאת, הרבה עדיין לא למד על פיתוח שרירי שלד nonmammalian וצמיחה, במיוחד במינים הבזליים. פרוטוקול יעיל וחזק לבידוד בתאי גזע בוגרים של רקמה זו, התאים המבשר myogenic (MPCs), ושמירה על ההתחדשות העצמית שלהם, שגשוג, ובידול בהגדרת תרבות העיקרית מאפשר זיהוי של מנגנוני פיקוח שימור ומסתעפים לאורך שושלות חוליות.

הכנת תא / תרבויות והיצמדות למנגנון הראשי myogenic מבשר משושלות חוליות בסל

סוגי התאים הדבקים העיקריים שמקורם בשריר אנושי הם תאים מיוגניים ופיברובלסטים. כאן, אוכלוסיות התאים מועשרות באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי המבוסס על אנטיגן CD56. תיוג חיסוני לאחר מכן עם נוגדנים ספציפיים ושימוש בטכניקות ניתוח תמונה מאפשר כימות של מאפיינים ציטופלזמיים וגרעיניים בתאים בודדים.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה, לשחזור ופשוטה של ​​בידוד והתרבות של ובתאים myoblast מן שרירי השלד של מבוגרים וישישים. השרירים המשמשים כאן כוללים שרירי כף הרגל והרגל. גישה זו מאפשרת הבידוד של אוכלוסייה מועשרת של myoblasts העיקרי ללימודים תפקודיים.

הכנה והתרבות של תאים מבשר myogenic / ראשי myoblasts מן שרירי השלד של מבוגר ובני אדם בני

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה כדי להשיג אוכלוסייה טהורה של myoblasts האדם מן רקמת שריר בוגר. תאים אלה משמשים ללמוד בידול שריר השלד במבחנה , בפרט, ללמוד חלבונים המעורבים Ca 2 + איתות.

בידוד של Myoblasts האדם, הערכה של בידול Myogenic, ו-מופעלות סידן מופעל מדידה

אנו מציגים טכניקות עבור בידוד, culturing, אפיון, וההבחנה תאים האדם העיקרי שריר השריר (hMPCs) המתקבל רקמת שריר השלד ביופסיה.  hmpcs התקבל ומאופיין באמצעות שיטות אלה ניתן להשתמש לאחר מכן לכתובת מחקר שאלות הקשורות מיוגנזה האדם התחדשות השלד שריר.

בידוד, תרבות, אפיון, והבידול של תאים האדם שריר ביופסיה של השלד שרירי השגרה נוהל

הזיהוי המדויק של תאי אב פיברו-אדיפוגניים (FAPs) ותאי גזע של שרירים (MuSCs) הוא קריטי לחקר תפקודם הביולוגי בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. פרוטוקול זה מספק הנחיות לבידוד, לטיהור ולתרבות של FAPs ו-MuSCs משרירי עכברים בוגרים.

בידוד ותרבית FACS של אבות פיברו-אדיפוגניים ותאי גזע של שרירים משרירי שלד עכברים לא מופרעות ופצועים

פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאי גזע שריריים ואבות פיברו-אדיפוגניים משרירי שלד בודדים בעכברים. הפרוטוקול כולל דיסקציה של שריר יחיד, בידוד תאי גזע על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי, הערכת טוהר על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית, ומדידה כמותית של כניסה לשלב S על ידי בדיקת שילוב 5-ethynyl-2'-deoxyuridine.

בידוד אוכלוסיות תאי גזע שקטים משרירי שלד בודדים

פרוטוקול זה מספק שיטה סטנדרטית לבידוד והעשרת מיובלסטים ראשוניים משרירי השלד של עכברים בוגרים ויילודים באמצעות ניתוק רקמות, סינון רציף, ציפוי מוקדם ותנאי תרבית מוגדרים, המאפשר הקמה ותחזוקה של תרביות מיובלסטים שמקורן בתאי לוויין ליישומים ניסיוניים במורד הזרם.

בידוד תאי לוויין שריר השלד למחקרי מיוגנזה במבחנה

למדו לבודד תאי אב מיוגניים ואדיפוגניים משרירי שלד בעכברים באמצעות עיכול אנזימטי ומיון תאים זרימתי. שיטה זו מאפשרת ניתוח אינטראקציות תאיות בזמן התחדשות רקמה בחי.

טיהור אבות מן שרירי השלד

גלה סרטונים נוספים