טיהור אבות מן שרירי השלד

שיטת ניתוק האנזימטית, תיוג משטח וטיהור על ידי cytometry זרימה של fibro / adipogenic ואת אבות myogenic מן שרירי השלד Murine.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבודד תאי אב מיוגניים ואדיפוגניים ברי קיימא משיקוף שרירי השלד. זה מושג על ידי קצירת רקמת שריר מעכברים שהורדמו. כשלב שני, הדגימה מתעכלת אנזימטית, מה שמפרק את הרקמה לתאים בודדים.

לאחר מכן נעשה שימוש במיון תאים או עובדות מופעלות פלואורסצנטיות על מנת לבודד את תאי האב. מתקבלות תוצאות המראות כדאיות והתמיינות של התאים המבודדים בעת השתלה בעכברים מושתלים על סמך צביעה היסטוכימית לתווית הגנטית, שבדוגמה זו היא פוספטאז אלקליין אנושי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות כמו prepl הוא שניתן לבודד את התאים ישירות מהחיה בנקודות זמן שונות.

לדוגמא, לאחר גרימת נזק לרקמות, כלומר אין ברירה על אוכלוסיית התאים וניתן לנתח את אוכלוסיית התאים ברמה המולקולרית כדי להסתכל על השלבים השונים שהתאים עוברים בתהליך ההתחדשות in vivo. אז הטכניקה הזו יכולה לעזור לענות על שאלה קריטית בתחום התחדשות הרקמות, ובמיוחד, איזה תפקיד ממלא כל סוג תא במהלך התחדשות in vivo וכיצד סוגי התאים האלה מתקשרים זה עם זה כדי לבנות מחדש רקמה בריאה? ההשלכה של טכניקה זו משתרעת על טיפול במחלות כמו ניוון שרירים.

מכיוון שחקר אבות אלה יכול בסופו של דבר לאפשר אסטרטגיות התחדשות לסוג זה של מחלות. בנוסף, ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על מספר רקמות אחרות החל מלב ועד שומן מכיוון שלפחות האבות הפיברו-אדיפוגניים נמצאו בכל רקמה בודדת שבדקנו עד כה. בדרך כלל, מצטרפים חדשים לטכניקה זו יתקשו מכיוון שטכניקות דיסוציאציה קשות יפחיתו את כדאיות התאים ויצרו יותר מדי פסולת, אשר לאחר מכן תפריע להפרדה הנקייה של התאים מאוחר יותר.

הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר החלטנו ליישם ציטומטריית זרימה, המשמשת בדרך כלל לתאי APOE לחקר תאי גזע ברקמות מוצקות. הדגמה חזותית של טכניקה זו חשובה מכיוון שקשה ללמוד את שלבי דיסוציאציה של רקמות מכיוון שקשה מאוד לתאר אותם כראוי. מי שידגים את הטכניקה הזו היום יהיה לינקי, עוזר מחקר במעבדה שלי שפיתח וייעל לראשונה את הטכניקה להליך זה, נדרשים לפחות שני עכברים.

עכבר אחד משמש לתאים כדי לספק את בקרות האיזוטיפ של צבע יחיד ונוגדנים הדרושים לעובדות, והשני יספק את הדגימה למיון. כדי להתחיל, השיגו עכברים בגילאי שבעה עד 12 שבועות שעברו המתת חסד בעבר במכסה מעבדה סטרילי. הניחו את העכבר המומת על מגבת נייר סטרילית, עם הפנים כלפי מעלה ורססו את הפרווה היטב באתנול 70% כדי למנוע זיהום עם מלקחיים ביד אחת ומספריים חדים ביד השנייה.

הרם את העור באזור הבטן ובצע חתך אורכי קטן. אחוז בעור מכל צד של החתך וקילף את העור לאחור כדי לחשוף לחלוטין את שרירי הגפיים האחוריות. לאחר מכן, כרתו את רקמת השריר על ידי החדרת המספריים הסגורים מתחת לשריר ומעל השוקה ואז פתיחת המספריים.

הקצה האחורי של הלהבים יאלץ בעדינות את הפרדת השריר מהשוקה. חזור על שני צידי השוקה והניח את הרקמה בצלחת פטרי בגודל 60 מילימטר. כעת הוציאו את רקמת השריר מעצם הירך באותו אופן והוסיפו את הרקמה לצלחת הפטרי.

חזור על הפעולה עבור כל עכבר באמצעות צלחת פטרי אחת לכל עכבר. לאחר מכן, לפרק את הרקמה לתאים בודדים. הוסף שני מיליליטר או 1000 יחידות קולגנאז, שניים ו -20 מיקרוליטר של תמיסת מלאי סידן כלוריד 250 מילי-מולרית לכל צלחת פטרי של רקמת שריר.

ואז לעבוד במהירות ובזהירות. השתמש בשני מלקחיים אפורים, אחד משונן, ואחד עם שתי שיניים כדי לקרוע את הרקמה לחתיכות מילימטר מעוקב אחד. הסר והשליך כמה שיותר רקמה שאינה שריר.

מכסים את צלחות הפטרי ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה יש להוציא את הכלים ולהחזירם למכסה המנוע הסטרילי של המעבדה. הסר את הבוכנה ממזרק של שלושה מיליליטר והשתמש בו כדי לרסק את הרקמה.

השתמש בבוכנה אחת לכל צלחת כדי למנוע זיהום צולב. הוסף כחמישה מיליליטר PBS סטרילי קר לכל צלחת פטרי והעביר את תכולת המנה לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. יש לשטוף עם חמישה מיליליטר נוספים של PBS כדי לשחזר את כל הרקמה ולהוסיף אותה לצינור החרוטי.

שטפו וצנטריפוגה את הדגימות שלוש פעמים על פי הפרוטוקול. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של תמיסה המורכבת מקולגנאז D דיס חלל שתיים וסידן כלורי לכל צינור ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם סיבוב למשך שעה. לאחר הדגירה, הוסף חמישה מיליליטר PBS סטרילי קר לצינורות, מערבל את הצינורות לזמן קצר וטרטר מספר פעמים כדי לנתק גושים.

מלאו את הצינורות בתערובת PBS היטב והניחו על קרח כדי להסיר את כל פיסות הרקמה הגדולות שנותרו, הניחו מסננת תאים של 40 מיקרון מעל צינור חרוטי של 50 מיליליטר על קרח וסננו את מתלה התאים. חלקו את הזרימה באופן שווה לשלושה צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר מלאים ב-PBS קר וסטרילי וצנטריפוגה ב-1600 סל"ד למשך חמש דקות בשמונה מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את ה-S והנח את התאים על קרח לצביעה ומיון של תאי אב מיוגניים ואדיפוגניים.

ראשית, הגדר את ששת הבקרות המעורבות של צביעה בצבע יחיד בהתאם לפרוטוקול הכתוב הנלווה. בקרות אלה כוללות ללא כתם גוף כתם, פרופידיום יודיד, נוגדנים עם תווית CD 31 ו-CD 45 FSE, נוגדן SC אחד P בגודל שבע ונוגדנים עם תווית אלפא 7 A PC. לאחר מכן, הגדר את שלושת תערובות הצביעה לבקרת איזוטיפים של נוגדנים בהתאם לפרוטוקול הכתוב.

לאחר הכנת תערובות הצביעה, סומנו תשע שפופרות איינור של 1.5 מיליליטר עבור דגימות בקרת הצבע היחיד והאיזוטייפ. Resus משהה ומשלב את התאים משלושת הצינורות החרוטיים בנפח כולל של מיליליטר אחד של מאגר פקס. לאחר מכן, חלקו 100 מיקרוליטר מהתאים לכל צינור בקרה einor מסומן ופיפטה בין 5 ל-10 מיקרוליטר מתערובות הצביעה בהתאם לריכוז הנוגדנים לצינורות הבקרה המתאימים.

השעו מחדש את התאים מעכבר הדגימה ב-200 מיקרוליטר של מאגר פקס ושלבו באחד מהצינורות החרוטיים של 50 מיליליטר. לאחר מכן מוסיפים 800 מיקרוליטר מקוקטייל הנוגדנים. מערבבים כל אחד מצינורות הבקרה וצינורות הדגימה.

ובכן דגרו אותם על קרח למשך שעה. לאחר הדגירה, שטפו את התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של מאגר פקס לכל אחד מתשעת צינורות הבקרה וכ-20 מיליליטר של מאגר פקס לצינור הדגימה. צנטריפוגה את צינורות הבקרה ב-3000 סל"ד למשך חמש דקות.

צנטריפוגה את הצינור החרוטי של הדגימה ב-1600 סל"ד למשך חמש דקות. לאחר מכן שאפו והשליכו את החטף לאחר צנטריפוגה. השעו מחדש את תאי הבקרה בכל צינור אורף עם מיליליטר אחד של מאגר פקס והשעו מחדש את תאי הדגימה בארבעה מיליליטר של מאגר פקס.

הוסף פרופידיום יודיד לתאי הדגימה ובקרות האיזוטיפ כמו גם ל-pi. צינור בקרה בצבע יחיד. הכניסו את התאים לצינורות פקס דרך מכסה מסננת התאים כדי להסיר גושים שנותרו שעלולים להשפיע על הציטומטר.

הגדר את מכשיר הפקס עם פקדי צבע ואיזוטיפ יחידים. מיון תאי הדגימה לפי הפרוטוקול הכתוב הנלווה ואיסוף כל אוכלוסייה בנפרד. וצינור איסוף של 3.5 מיליליטר אבות מיוגניים ברי קיימא הם האוכלוסייה המגושמת ואלפא שבע, חיובי למחשב ו-PI, CD 31, FE, CD 45, FE ו-ska.

שבעה אבות אדיפוגניים שליליים בגודל PE הם מגושמים ו-ska אחד בגודל PE שבע חיובי ו-pi CD 31 FE CD 45 FE ואלפא שבע שלילי למחשב. עכבר יחיד מסוג בר עשוי להניב בערך פי 10 לאבות האדיפוגניים החמישיים, ו-1.5 עד פעמיים פי 10 לאב החמישי. אבות מיוגניים עם יותר מ-95% כדאיות.

כדי להכין תאים להשתלה בעכברים מארחים, התאים נשטפים. צנטריפוגה ראשונה עיוותה תאים ב-1500 סל"ד למשך חמש דקות. הסר את ה-supernatant, השהה מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר PBS והעביר אותם לצינורות einor.

צנטריפוגה את הצינורות ב-3000 סל"ד למשך חמש דקות והסר את הסופרנטנט. לאחר מכן החייאת אבות מיוגניים ב-PBS או אבות אדיפוגניים במטריג'ל מאטרי בערך 10 עד שישה תאים למיליליטר. לאחר הכנת העכברים המארחים המורדמים לכל סוג תא תורם, על פי הפרוטוקול הכתוב, השתמש במזרק אינסולין של שלוש עשיריות הסנטימטר מעוקב כדי להזריק 20 מיקרוליטר כ-20,000 תאים של אבות מיוגניים או אדיפוגניים.

אפשר את פרק הזמן המתאים לתאים המושתלים להתמיין, בדרך כלל כשלושה שבועות. לאחר מכן בודדו את רקמת המטרה והכינו אותה להקפאה כמתואר בפרוטוקול באיור זה, אסטרטגיית המיון מודגמת לבודד את האבות האדיפוגניים והמיוגניים תאים ברי קיימא זוהו על סמך פיזור קדימה ופיזור צד נעשה שימוש בצביעת נץ כדי להוציא פסולת גרעינית וצביעת פרופידיום יודיד או PI שימשה כדי להוציא תאים מתים, תאים המטופויאטיים ואנדותליים, או תאי CD 45 ו-CD 31 בהתאמה לא נכללו בשערי המיון. לבסוף, תת-הקבוצה שהיא אלפא שבע חיובית.

SKA שלילי אחד מכיל את כל האבות המיוגניים ואת האוכלוסייה שהיא אלפא שבע שלילית. SKA חיובי אחד מכיל את כל האבות האדיפוגניים פלואורסצנטיים מינוס איזוטיפ אחד בקרות מאשרות את הספציפיות של הכתם. בנוסף, בוצעו בדיקות טוהר של תת-הקבוצות האדיפוגניות והמיוגניות.

לאחר מיון בדוגמה מייצגת זו, ניתן לזהות תאי תורם אב אדיפוגני המבטאים פוספטאז אלקליין טרנסגני, אנושי המוזרק תת עורי ברקמת המארח על ידי היסטוכימיה כפי שמצוין על ידי צביעה חומה. תאי תורם אב מיוגניים המבטאים טרנסגניים. פוספטאז אלקליין אנושי שהוזרק תוך שרירי זוהה בקטע רקמה זה כפי שמוצג בחום.

שימוש בהיסטוכימיה לאחר מאסטר, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך חמש שעות אם היא מבוצעת כראוי. אם מעבדים דגימות נוספות, הזמן יגדל. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד במהירות ובעדינות.

לכן, הימנע מעיבוד יותר מדי דגימות בכל פעם. הארכת זמן העיבוד תפחית מאוד את שונות התאים בעקבות הליך זה. שיטות אחרות כמו ניתוח ביטוי קולונו SC OG על ידי R-T-P-C-R כמותי יכולות גם הן לבצע על מנת לענות על שאלות נוספות כמו, כיצד תאי פרו אלה מגיבים לנזק in vivo לאחר התפתחותו?

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים אחרים בתחום התחדשות הרקמות לחקור את הדיבור בין תאי הפרו ברקמה פגועה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לפרק את הרקמות הללו ללא נזק. תאי האב מזהים את תאי האב על סמך סמני השירות שלהם ומנתחים את הפוטנציאל ההתפתחותי שלהם in vivo.

תודה שצפית. בהצלחה בניסוי שלך.