Name: תא הקלטות שלמות של המוח של מבוגרים תסיסנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: למדו את שיטת הקלטות התא השלם במוחות בוגרים של Drosophila. הפרוטוקול מדגים בידוד מוח שלם, הכנת נוירונים מסומני GFP וטכניקות אלקטרופיזיולוגיות לניתוח פעילות עצבית בודדת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH NS27501 כדי DKOD. תמיכה נוספת עבור עבודה זו סופק על ידי גרנט HHMI תוכנית פרופסור כדי DKOD.

I. Dissection של המוח של הזבוב הבוגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום טיפה קטן (~ 100 μl) של ביתור פתרון במרכז של צלחת פטרי 35 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס נקבה בוגרת באמצעות aspirator. תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במזרק שתי מחטים לערוף את הזבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ראש טיפה קטנה של מלח לנתח (עם papain נוסף) בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמדה בראש עם עם חוטם מול התחתון של המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את הקוטיקולה המכסה את עין שמאל מתחם עם מחט 1. בצע חתך אלכסוני המשתרע מן הגב אל פני השטח הגחון עם 2 מחט, המדיאלי רק מחט 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את גפי עם מחט 1 ולהשתמש מחט 2 לעשות חתך אופקי המשתרע מפני השטח של הגחון בעין שמאל לעין ימין, ברמת הבסיס של חוטם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את הקוטיקולה המכסה את עין ימין מתחם עם מחט 1. בצע חתך אלכסוני המשתרע מן הגב אל פני השטח הגחון עם 2 מחט, רק המדיאלי של מחט 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את ראשו כך שהצד מקורי הוא על פני צלחת פטרי. הכנס מחט 1 לציפורן בין המוח לבין מקורי, ולהשתמש מחט 2 ללכת בדרך זהה המחט הראשונה. באופן אידיאלי, הקפסולה יהיה לקלף מן המוח עם שתי האונות אופטי המחובר מאז האלה חשובים בייצוב המוח ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קנה הנשימה, שקי האוויר, ורקמות החיבור אחרים מוסרים בזהירות בעזרת שני מלקחיים טיפ נאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסקציה שלמים צריך לקחת 3-10 דקות </li></ol> השנייה. הרכבה העצבים המרכזית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח הוא הועבר לתא הקלטה באמצעות pipet קצה צהוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחדר הקלטה, המוח הוא התייצב על ידי הצבת מסגרת פלטינה כך שתי שערות לחצות קנס ליצור קשר עם רקמת בצומת בין האונות אופטיים אזור במוח המרכזי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח כל מותר לנוח בחדר הקלטה עם טפטוף מתמיד עם מלוחים מחומצן (95% חמצן ופחמן דו חמצני 5%) לפחות 10 דקות. זלוף של החדר עם מלוחים מחומצן הוא המשיך לאורך כל התקופה את ההקלטה. ההכנה היא דמיינו באמצעות מיקרוסקופ זקוף (Axioskop 2FS; Zeiss, Oberkochen, גרמניה) עם במה קבועה של מים 40X טבילה אובייקטיבי (Achroplan; הצמצם המספרי, 0.8; Zeiss) ו Nomarski אופטיקה. GFP נתפסה עם מסנן הקרינה 505-530 BP. </li></ol> ג. Electrophysiology <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipets של 8-14 Mohms משמשים הקלטות התא כולו </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלטות מהדק הנוכחי מתח-clamp מבוצעות באמצעות רשימת EPC7 או מגבר Axopatch 200B, 1322A Digidata התובע ממיר (התקנים מולקולריים, פוסטר סיטי, קליפורניה), Dimension 8200 של Dell המחשב (Dell Computer, Round Rock, TX) ו pClamp 9 תוכנה (התקנים מולקולריים). </li></ol>

<ol><li>Gu, H., O Dowd, D. K., K, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+synaptic+transmission+in+Adult+Drosophila+Kenyon+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cholinergic synaptic transmission in Adult Drosophila Kenyon cells in situ.</a> Journal of Neuroscience. 26, 265-272 (2006).</li>
<li>Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+olfactory+representations+in+the+Drosophila+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe.</a> Science. 303, 366-370 (2004).</li>
</ol>

הכנת מבודד המוח כולו אנו מדגימים בסרטון זה מאפשר הערכה של מנגנוני הסלולר הבסיסית רגישות והעברת סינפטיים של נוירונים שזוהו, לרבות אלה המסלולים עיבוד חוש הריח, את הבוגרים תסיסנית המוח (גו ו-O דאוד, 2006). גישה זו משלימה המחקר של הפעילות העצבית במוחם של מבוגרים תסיסנית שלם (Wilson et כל 2004), ברוב ההקלטות באותה דרך של נוירונים פרוסת מוח היונקים משלימים הקלטות ביונקים מתנהג ער. ישנם שני יתרונות גדולים של כהכנה לטוס באתרו המוח בהשוואה פרוסות יונקים. ראשית המוח לטוס כולו נכנס בקלות לתוך תא ההקלטה ולכן אין ...

<table><tbody><tr><td>#5 פינצטות</td><td>כלי</td><td>Fine Science Tools</td><td>מס' 11251-10</td><td>היזהרו לא לפגוע בקצותיהם העדינים של הפינצטות</td></tr><tr><td>פפאין</td><td>ריאגנט</td><td>Worthington Biochemical</td><td>3126</td><td>20 U/מ"ל המופעלים על ידי 1 mM L-cysteine</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td><td>דגם SMZ-2B:C-PS</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>מצויד בתאורת סיבים אופטיים עם זרוע גמישה (gooseneck) הממוקמת בזווית נמוכה</td></tr><tr><td>מחט &amp;מזרק </td><td></td><td>PrecisionGlide&amp;#174;?, Becton Dickinson Co</td><td>305175 &amp;amp; 309602</td><td>זול ועמיד</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אנכי</td><td>Axioskop2 FS plus</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>מאובזר בבמה קבועה, עדשה אובייקטיבית עם טבילה במים בהגדלה של 40X, אופטיקת נומרסקי (Nomarski) ונורת פלואורסצנציה</td></tr><tr><td>מגבר פאטץ'-קלמפ (Patch clamp amplifier)</td><td>200 B</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ממיר D-A של Digidata </td><td>1322A</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

תא הקלטות שלמות של המוח של מבוגרים תסיסנית

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הליך לבודד את המוח כולו מן הבוגרים תסיסנית כהכנה ההקלטה מתא עצב אחד. נתחיל בתיאור פתרון לנתח ולתפוס של נשים בוגרות שימוש במחקרים שלנו. ההליך להסרת המוח כולו שלם, כולל שתי האונות אופטיים, מומחש. Dissection של קנה הנשימה שמעל מוצג גם. המוח מבודד הוא לא רק קטן אך זקוק לטיפול מיוחד בטיפול בשלב זה כדי למנוע נזק לתאי העצב, רבים מהם קרוב לפני השטח החיצוני של הרקמה. אנו מראים כיצד בעל מיוחדת שפיתחנו משמש כדי לייצב את המוח בחדר ההקלטה. Electrophysiology תקן להגדיר משמש ההקלטה מתא עצב יחיד או זוגות של נוירונים. תמונה ניאון, נצפים מבעד למיקרוסקופ הקלטה, מקו GAL4 נהיגה ביטוי של GFP (GH146) מדגים כיצד נוירונים השלכה (PNS) מזוהים במוח לחיות. תמונת מתח גבוה Nomarski מראה תצוגה של נוירון בודד כי הוא ממוקד עבור הקלטה התא כולו. כאשר המוח יוסר בהצלחה ללא נזק, רוב הנוירונים הם פעילים באופן ספונטני, יורים פוטנציאל פעולה ו / או להציג קלט סינפטי ספונטנית. זו הכנה באתרו, שבו כל תא הקלטה של ​​נוירונים במוח המזוהה כל יכול להיות משולב עם מניפולציות גנטיות תרופתי, הוא מודל שימושי לחקר הפיזיולוגיה פלסטיות הסלולר ב CNS מבוגר.

וידאו זה מדגים את נוהל בידוד המוח כולו מן הבוגרים תסיסנית כהכנה ההקלטה מתא עצב בודד באמצעות תא רגיל הטכנולוגיה כולו. זה כולל תמונות של תאים GFP ונוירונים שכותרתו שנצפו במהלך ההקלטה.

בסרטון זה, אנו מדגימים את ההליך לבידוד מוחות שלמים מ flies של *Drosophila* בוגרת, כהכנה להקלטה מנוירונים בודדים. אנו מתחילים ב...

שמי הוא [שם], אני סייען מומחה במחלקה לאנטומיה ונוירוביולוגיה ב-uc R one. היום אסביר לכם את ההליך לביצוע רישום תא שלם (whole cell recording) במוח של PHA; שלבי המפתח בהכנה זו כוללים כיצד לבצע דקפיטציה לראש, כיצד להוציא את המוח וכיצד להסיר את מערכת ה-TRICARE ואת רקמת ה-G השקופה מפני השטח של המוח. היום אדגים לכם כיצד להכין תמיסת דיסקציה עבור רישום תא שלם במוח של adult soft lab.השלב הראשון הוא להכין את, התמיסה השנייה חשובה מאוד, המפתח להכנה טובה של מוח בוגר. ראשית, אעביר 5 mL של תמיסת קיבוע למבחנה עם תחתית קונית זו. ולאחר מכן, יש לי כאן מבחנה קטנה נוספת.אוסיף מיליליטר אחד של תמיסה רשומה לשפופרת זו, ארגש אותה ולאחר מכן אכין את תמיסת הרגש הזו. אעלה ואוריד את הנוזל באמצעות פיפטה כדי ליצור תמיסת רגש הומוגנית. ולאחר מכן, אקח 100 יחידות של pepane מבקבוק זה.לאחר מכן, אעביר את ה-pepane למבחנת Centrifuge זו. כעת ניתן לראות שהתמיסה עכורה, לכן אוסיף עוד 100 µL של cy ואערבב את התמיסה היטב. לאחר 10 דקות התמיסה תהיה צלולה וכל הגבישים ייעלמו.כעת התמיסה תהיה מוכנה להשחטה. הדרך הטובה ביותר להשתמש בתמיסה זו היא 30 דקות לאחר ערבוב ה-cy וה-pepane. אראה לכם כיצד לאסוף זבוב נקבה משפופרה זו, מכיוון שיש לנו כאן מאות זבובים.אולם אשתמש בצינור שאיבה זה כדי לתפוס את הזכר ואת הנקבה מכאן. אך למעשה, בניסוי אנו משתמשי

whole-cell-recordings-from-brain-of-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

הקלטה בו זמנית של אותות סידן מתא עצב לזהות התנהגות האכלה של תסיסנית melanogaster</em

סרטון זה מתאר כיצד לנתח ולבודד את מוח הדרוזופילה הבוגר – הליך הכרחי לדמיון האיבר, שאחרת מוסתר על ידי הקוטיקולה, העין ורקמת קנה הנשימה. הפרוטוקול לדוגמה מראה הדגמה מפורטת המניבה תכשירים באיכות גבוהה שניתן להשתמש בהם לשיטות אימונוסטיין והדמיה בנוירוביולוגיה של דרוזופילה.

דרוזופילה דיסקציה מוחית של מבוגרים: שיטה בנוירוביולוגיה של זבובים

הסרטון מדגים רישום חוץ-תאי של פעילות עצבית ממערכת העצבים המרכזית (CNS) של זחלי דרוזופילה. מערכת העצבים המרכזית הטרנסקטיבית ממוקמת בתא הקלטה, והפעילות החשמלית לעצב יורד נרשמת כדי לקבוע את תדר הירי הבסיסי. לאחר מכן מוצג סוכן בדיקה, והשינוי בתדירות הירי נרשם כדי לקבוע את ההשפעה המעוררת או המעכבת של הסוכן.

רישום חוץ-תאי של פעילות חשמלית במערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה

מיקרואלקטרודות חדות מאפשרות אפיון אלקטרופיזיולוגי מדויק של תפוקת קולטני האור והאינטרנוירונים החזותיים בדרוזופילה חיה. כאן אנו מראים כיצד להשתמש בשיטה זו כדי להקליט תגובות מתח באיכות גבוהה של תאים בודדים לגירוי אור מבוקר. שיטה זו אידיאלית לחקר עיבוד מידע עצבי בעיניים של תרכובות חרקים.

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים<em&gt; In vivo</em

כל תא הקלטות של תסיסנית melanogaster photoreceptors לאפשר מדידה של ספונטני בליטות כהה, בליטות קוונטיות, תגובות מאקרוסקופיות לאור, ואת המתח הנוכחי היחסים בתנאים שונים. בשילוב עם ד melanogaster כלים מניפולציה גנטית, שיטה זו מאפשרת את המחקר של inositol- השומן ליפיד המסלול נתיב היעד שלה, ערוץ TRP.

שיטה אלקטרו-קולית לקולקציית מתח מלא<em&gt; תסיסנית</em&gt; פוטורספטורים

מאמר זה כולל שיטה לבדוק את החיבורים monosynaptic בין נוירונים בהחלת טטרודוטוקסין וערוץ עמידים טטרודוטוקסין נתרן, NaChBac.

בחינת חיבורים Monosynaptic דרוזופילה באמצעות ערוצי נתרן עמיד לטטרודוקסין

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי להקליט את הפעילות החשמלית יורד של מערכת העצבים המרכזית דרוזופילה melanogaster כדי לאפשר את עלות-יעיל ונוח בדיקה של סוכנים תרופתי, מוטציות גנטיות של חלבונים עצבית, ו/או את התפקיד של מסלולים פיזיולוגיים נחקרו.

הקלטה אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מערכת העצבים המרכזית השלישית-לחלל דרוזופילה Melanogaster

אנו מציגים שיטה המותאמת במיוחד כדי לדמות את המוח כולו של Drosophila הבוגר במהלך ההתנהגות בתגובה לגירויים. הראש ממוקם כדי לאפשר גישה אופטית לכל המוח, בעוד הזבוב יכול להזיז את רגליו ואת האנטנות, את קצה הפרובוסיס, והעיניים יכולות לקבל גירויים חושיים.

הכנת מלנוגאסטר דרוזופילה למבוגרים להדמיית מוח שלמה במהלך תגובות התנהגות וגירויים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 לניטור פעילויות אפילפטיפורמיות. הפרוטוקול מספק כלי רב ערך לחקר אירועים איקטליים בדרוזופילה בוגרת באמצעות הדמיית סידן ex vivo , המאפשר לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים של אפילפסיה ברמה התאית.

אקס ויוו הדמיית סידן למודל דרוזופילה לאפילפסיה

מחסום משמעותי לחקר הפעילות התאית במהלך תהליכים קוגניטיביים כמו למידה וזיכרון הוא השימוש בחומרי הרדמה להכנת הדמיה in vivo . הרדמה פוגעת בזיכרון לטווח קצר ובקוגניציה במספר מודלים, כולל דרוזופילה. מחקר זה מציג שיטה ייחודית להכנת דרוזופילה בוגרת להדמיה in vivo ללא הרדמה.

ב Vivo הדמיה של פעילות עצבית בזבובים בוגרים של דרוזופילה לא מורדמת

למדו את שיטת הקלטות התא השלם במוחות בוגרים של Drosophila. הפרוטוקול מדגים בידוד מוח שלם, הכנת נוירונים מסומני GFP וטכניקות אלקטרופיזיולוגיות לניתוח פעילות עצבית בודדת.

תא הקלטות שלמות של המוח של מבוגרים תסיסנית

גלה סרטונים נוספים