Heterokaryon טכניקה לניתוח של לוקליזציה Cell סוג ספציפי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לעקוב אחר תנועת חלבונים על ידי ביטוי של חלבון בודד הנושא שני פלואורופורים שונים בשתי שורות תאים נפרדות, ומיזוג שורות תאים אלו יחד. דבר זה מושג תחילה על ידי הטרנספקציה של פלסמידים הנושאים את הגן המדובר, המאוחה לאחד משני גנים של חלבוני פלואורופור שונים, לשני סוגי תאים נפרדים. השלב השני של ההליך הוא ערבוב התאים יחד ומתן אפשרות לכל סוג תא לצבור חלבון.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא עיכוב סינתזת חלבונים, ולאחר מכן מיזוג התאים באמצעות polyethylene glycol. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא ויזואליזציה של לוקליזציית החלבון באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות שינוי בלוקליזציית החלבון או בהתנהגות הטרנספורט (trafficking) באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הסרטן, כגון כיצד משתנים תפקודים והתנהגויות ספציפיות של חלבונים כאשר תאים הופכים למסרטנים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי שינויים הספציפיים לתאים שעברו טרנספורמציה, ניתן להחילה גם על מחקרים אחרים, כגון דיפרנציאציה של תאים, ביולוגיה התפתחותית ואיתות תאי.

בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים שיטה זו יתקלו בקושי, כיוון שיהיה צורך באופטימיזציה של תנאי הטרנספקציה ושל תנאי ההיתוך עבור כל סוג תא שונה. השיטה הראשונה המוצגת בפרוטוקול זה להחדרת plasmid DNA לתאים היא שיטת ה-NU Nuclear Affection, המשתמשת בפתרון lonza nuclear effector; התחל בשטיפת תאים שעברו מעבר (passage) לאחרונה ונמצאים בשלב גדילה לוגריתמי באמצעות phosphate buffered saline PBS, ואסוף אותם באמצעות ization. לאחר שהתאים איבדו את היצמדותם, נטרל את ה-trypsin על ידי הוספת מצע מכיל סרום ואסוף את התאים על ידי סרטיפוגציה ב-1500 G למשך חמש דקות בזמן שהתאים עוברים סרטיפוגציה.

הוסיפו כיסויות זכוכית (cover slips) סטריליות לפלטה עם שש בארות תחת מנדף לתרביות רקמה, ולאחר מכן העבירו בפיפט 1.5 milliliters של מצע גידול מלא לכל בארה. כסו את הפלטה והעבירו אותה לאינקובטור לתרביות תאים לצורך השוואת תנאים.

לאחר הצנטריפוגה, העבירו את המבחנות למCב, שאבו את הנוזל העליון והשעיקו מחדש את משקעי התאים בנפח מינימלי של PBS. לאחר מכן, ספרו את התאים וחלקו את נפח סuspended התאים למבחנות מיקרו-צנטריפוגה סטריליות. הדבר יספק כ-5 × 10⁵ תאים לדגימה. צנטריפוגו שוב ב-1500 G למשך חמש דקות.

עם השלמת הסנטריפוגציה, העבירו את המבחנות למנדף תרביות תאים, שאבו את ה-SNA והשעיקו בזהירות. השעיקו את התאים בכל מבחנה ב-100 µL של תמיסת nuclear effector בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 5 µg של DNA פלסמי לכל דגימה והעבירו את הדגימה ל-nuclear effector Q vete וכסו.

הקפידו להימנע מבועות אוויר. הכניסו את ה-sample qve לתוך ה-Q vet holder. בחרו את תוכנית ה-nuclear effector המתאימה והפעילו אותה.

בחירת התוכנית המתאימה ביותר עשויה לדרוש בדיקות מקדימות כדי לקבוע את יעילות הטרנספקציה האופטימלית עם מינימום תמותה. לאחר מכן, זרע את התאים לפלטה בעלת שישה בארות, באוכלוסיות מעורבות או בנפרד כביקורות. החזר את הפלטה לאנקובטור ואפשר לתאים להתאושש במשך 12 שעות.

השיטה השנייה המוצגת לביטוי זמני של פלסמידים היא טרנספקציה באמצעות ריאגנט kagen affecting. כדי להתחיל, העבירו 0.8 micrograms של כל דגימה של DNA פלסמידי ל-200 microliters של בופר EC באבוב צנטריפוגה סטרילי. לאחר מכן, הוסיפו 6.4 microliters של ריאגנט מעצב (enhancer reagent) לכל דגימה.

ערבבו קצרות על ידי נקישה על השפופרת והדגירו למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר דגירה קצרה זו, הוסיפו 20 µL של reagent המשפיע לכל דגימה. ערבבו כל שפופרת על ידי נקישה והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

במהלך הדגירה, הכינו את שני קווי התאים שבהם תשתמשו בניסוי. לצורך הטרנספקציה, התאים צריכים להיות במעבר תאים (passaging) עדכני ובגדילה לוגריתמית בהסמכה של כ-80%. שטפו את התאים פעם אחת באמצעות PBS והוסיפו בחזרה 1.5 milliliters של DMEM טרי עם 10% FBS.

לאחר שדגמי הריאגנטים לטרנספקציית DNA דגרו במשך 15 דקות, הוסיפו לכל דגימה 1.2 milliliters של מצע DMEM בתוספת 10% FBS, ערבבו באמצעות פיפטינג והעבירו מיד, בטפטוף, כ-700 microliters מהקומפלקסים לכל אחת משתי הבארים בלוח שש הבארים, וערבבו על ידי סיבוב הלוח. אפשרו לתאים לעבור טרנספקציה למשך שלוש שעות לפחות באינקובטור; במידת הצורך, הניחו כיסוי זכוכית (cover slip) סטרילי אחד לכל באר בלוח שש הבארים בתוך מ написано תחת מנדף תרביות התאים.

ניתן להשתמש בלוחיות כיסוי מצופות כדי לשפר את היצמדות התאים. לאחר מכן, יש לשטוף את התאים שעברו טרנספקציה פעמיים ב-PBS ולאסוף את התאים באמצעות טריפסינציה מינימלית. פעולה זו מתבצעת על ידי הוספת 100 µL של תמיסת טריפסין לכל באר תוך ניעור של הפלטה כדי להבטיח כיסוי מלא.

לאחר מכן, שאבו מיד את שאריות ה-trypsin. נטרלו את ה-trypsin שנותר על ידי השהיה מחדש של התאים ב-1.5 milliliters של DMEM טרי עם 10%FBS, והעבירו את התאים למצע גידול, בין אם כאוכלוסיות מעורבבות ובין אם בנפרד כביקורות. בלוח שש התאים המכיל זכוכית כיסוי (cover slips), אפשרו לתאים להתאושש במשך 12 שעות באינקובטור לתרביות תאים.

בלי קשר לשיטת הטרנספקציה, הפרוצדורה ליצירת הזרקות נשאיות הטרוגניות היא זהה. לאחר הטרנספקציה, יש להסיר את מצע התרבית מהבארות ולשטוף את התאים פעמיים ב-PBS. לאחר מכן, מומלץ לטפל בתאים ב-cyclo heide כדי לעכב סינתזה נוספת של חלבונים.

הוסיפו cyclo heide בריכוז של 100 µg/mL למצע התרבית כדי לכסות את התאים, והדגירו למשך שעתיים באינקובטור לתרביות תאים. לאחר שעתיים, הוציאו את התאים מהאינקובטור ושטפו אותם פעמיים ב-PBS. כדי להתחיל את ההיתוך, כסו את התאים בתמיסה של 50% polyethylene glycol 1000 ב-DMEM ללא סרום והדגירו למשך 125 שניות.

בטמפרטורת החדר, הסר את תמיסת ה-PEG ושטוף את התאים ב-PBS כדי להסיר שאריות peg. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS שחומם ל-37 °C. הדגר את התאים למשך 18 עד 24 שעות באינקובטור לתרביות תאים.

לאחר דגירה של 18 עד 24 שעות, הוציאו את הפלטה מהמדגרה ושטפו את התאים פעמיים ב-PBS. לאחר מכן, העבירו בפיפטה 1 mL של 4% פאראפורמאלדהיד ב-PBS לכל באר ונערה בעדינות במשך 15 דקות.

במהלך הדגירה, הכינו את תויות המיקרוסקופ לשימוש על ידי הוספת טיפה אחת של תכשיר קיבוע המכיל dpi. לאחר מכן, שטפו את התאים המקובעים פעמיים ב-PBS והסירו בזהירות כל זכוכית כיסוי באמצעות פינצטה קטנה. ספגו את ה-PBS שנותר בעזרת פיסת רקמה לפני הנחתה, כאשר צד התאים פונה כלפי מטה, על תותית מיקרוסקופ עם תכשיר קיבוע בתוספת tappi.

הסר את עודפי תוך המקום (mounting medium) מהשקופית בעזרת נייר סופג ואטום את קצוות הזכוכיות המכסות. באמצעות לק לציפורניים, ניתן כעת להדמיאן את התאים במיקרוסקופיה קונפוקלית או במיקרוסקופיית פלואורסצנציה אפיפלואורסצנטית. בתרשים הזרימה זה, מוצגת שיטת ההטרו (hetero method) לניתוח לוקליזציה של חלבונים הספציפית לסוג תא, בשלושה שלבים בסיסיים.

טרנספקציה של פלסמיד המבטא חלבון מסומן פלואורסצנטית במיזוג תאים עם polyethylene glycol 1000 ודימות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כפי שניתן לראות בתמונות epi fluorescence אלו: פיברובלסטים ראשוניים של ערלה, ביקורות במיזוג עצמי המבטאות חלבון VP3 של נגיף האנימיה בעוף המסומן ב-GFP מראות לוקליזציה ציטופלזמית בעיקרה של החלבון בשורת תאי קרצינומה של ריאה שאינם תאי קטנים H 1299. ביקורות במיזוג עצמי עם אותו חלבון VP3 המסומן ב-DS.RED מראות לוקליזציה גרעינית בעיקרה. מיזוג הטרוקרני של פיברובלסטי ערלה ראשוניים ותאי H 1299 גורם להחדרה של חומר תאי טרנספורמיפי לתוך הפיברובלסטים הראשוניים של הערלה, וגורם לשינוי בלוקליזציה של VP3 המופק מתאים ראשוניים ומסומן ב-GFP אל הגרעין.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי ההצלחה תהיה תלויה במידה רבה ביעילות הטרנספקציה בסוגי התאים הספציפיים שבהם נעשה שימוש, וכן באופטימיזציה של תנאי ההיתוך עבור תאים אלו. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון flip ו-frap כדי לענות על שאלות נוספות הכוללות ניתוח בזמן אמת של דינמיקת הלוקליזציה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן להעריך לוקליזציות של חלבונים הספציפיות לסוגי תאים באמצעות הכנסת חלבונים מתויגים פלואורסצנטית ויצירת היתוכי תאים.