Name: Heterokaryon טכניקה לניתוח של לוקליזציה Cell סוג ספציפי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: למדו שיטת הטרוקריון לניתוח לוקליזציה ספציפית לסוג תא באמצעות שתי קווי תא נפרדים ופיוז'ן עם פוליאתילן גליקול. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תנועת חלבונים ושינויי התנהגות בתאים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות הפוליטכני וורצ&#39;סטר מכון המחלקה לכימיה וביוכימיה למימון.

1. Transfection של שורות תאים Transfection שיטה 1 (Lonza Nucleofection עבור מוגברת יעילות התא הראשוני transfection) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צריכים להיות מעבר האחרונות בצמיחה יומן שלב לפני transfection. שטפו תאים phophate שנאגרו מלוחים (PBS) ותאי הקציר ידי trypsinization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 1500 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תלושי לכסות מעוקר לצלחת 6 באר. תלושי כיסוי עשוי להיות מצופה על הידבקות התא משופרת. מקום 1.5 מ"ל של התקשורת בתרבות (במקרה זה מדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM), 10% בסרום שור העובר (FBS)) לתוך כל טוב לאזן את התקשורת בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים על ידי trypsinization ו resuspend בהיקף מינימלי של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים צנטריפוגות את הסכום הנכון של resuspension לספק ~ 5x10 5 תאים לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בקפידה 100 הטמפרטורה μL פתרון Nucleofector החדר המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 100 μL ההשעיה תא עם דנ"א 5 מיקרוגרם פלסמיד ולהעביר את המדגם כדי קובט Nucleofector נזהר שלא לכלול בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את תוכנית Nucleofector המתאים (זה עשוי לדרוש בדיקה קודמת להקים transfection יעילות אופטימלית עם תמותה מינימלית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קובט המכיל את ההשעיה תא / דנ"א לתוך המחזיק קובט Nucleofector ולהתחיל בתוכנית שנבחרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום, להסיר את קובט ולהוסיף ~ 500 μL של טרום equilibrated התקשורת בתרבות אליו (נלקח מתוך צלחת 6-היטב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את הדגימה לתוך צלחת 6-היטב עם נפח סופי של 1.5 מ"ל לכל טוב. תאים צריכים להיות מצופה באחת אוכלוסיות מעורבות או בנפרד, עבור פקדי. </li></ol> Transfection שיטה 2 (Qiagen transfection Effectene עבור שורות תאים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מתחמי transfection באמצעות מגיב Effectene Qiagen ידי הראשון מוסיף 0.8 מיקרוגרם של כל דגימה DNA פלסמיד למאגר 200 EC μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6.4 μL מגיב משפר מדגם זה, מערבבים בקצרה על ידי מצליף את הצינור, ואת דגירה למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מגיב Effectene μL לערבב כל המדגם, על ידי מצליף את הצינור, ו דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה זה, להכין את שתי שורות תאים של עניין transfection. שטפו תאים passaged לאחרונה (&lt;80 מפגש%) פעם שנאגרו מלוחים פוספט (PBS). הוסף גב 1.5 טרי מ"ל התחמם equilibrated צמיחה בינוני (במקרה זה שונה Dulbecco הנשר של המדיום (DMEM), 10% בסרום שור העובר (FBS)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מתחמי transfection יש מודגרות למשך 15 דקות, להעביר 1.2 מ"ל של התקשורת מדגם זה. מערבבים על ידי pipetting, ומיד להעביר ~ 700 μL של קומפלקסים לכל אחד שתי בארות בצלחת 6-הבאר. הוסף dropwise, ומערבבים בעדינות ידי על ידי מתערבל את הצלחת. אפשר התאים transfect לפחות 3 שעות (עשוי להשתנות בהתאם לסוג התא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תלושי לכסות מעוקר לצלחת 6-באר חדשה. תלושי כיסוי עשוי להיות מצופה על הידבקות התא משופרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי התאים יש transfected, לשטוף תאים פעמיים עם PBS ולאסוף את התאים על ידי trysinization מינימלי על ידי הוספת כ -100 פתרון טריפסין μL זה טוב, בקצרה להסעיר את הצלחת מעיל מלא כל טוב, ומיד aspirating את טריפסין. ברגע שהתאים נוקף, להוסיף 1.5 התקשורת טרי מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, התאים צריכים להיות מצופה באוכלוסיות או מעורבת או נפרדת (עבור פקדי) על גבי תלושי כיסוי סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לשחזר את התאים למשך 12 שעות. </li></ol> 2. תא Fusion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה תרבות מן התאים ולשטוף פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, מומלץ לטפל בתאים עם cycloheximide (100 מיקרוגרם / מ"ל) לעכב את סינתזת החלבון. אפשר התאים כדי לדגור על 2 שעות ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתיך תאים על ידי חשיפת אותם בתמיסה של 50% פוליאתילן גליקול 1000 (PEG 1000) בסרום ללא DMEM עבור 125 שניות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם PBS להסיר את הפתרון 1000 PEG, ולהוסיף 2 מ"ל חימם טרי התקשורת equilibrated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תאים כדי לדגור במשך 18 - 24 שעות. </li></ol> Fluorescence מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה והתרבות, לשטוף את התאים פעמיים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים על ידי הוספת 1 מ"ל של פתרון paraformaldehyde 4% (ב PBS) היטב כל אחד. להתסיס בעדינות במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים קבוע פעמיים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את מכסה מחליק מהצלחת, הפתיל את PBS עודף. הפוך על שקופיות מיקרוסקופ עמוסה טיפה אחת הרכבה בינונית (90% גליצרול, 100mm טריס pH 7.5, DABCO 2% (1,4-diazabicoyclo אוקטן) DAPI המכיל (4 ',6-diamidino-2-phenylindole). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני הרכבה עודף משקופיות, ואת החותם שיתוףver מחליק עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופיה confocal או epifluorescence. </li></ol> 3. נציג תוצאות תרשים 2 מציג דוגמה heterokaryon הניסוי באמצעות fibroblasts הראשי H1299 שאינם קטנים סרטן ריאות מסוג תאים תאים. החלבון של עניין בניסוי הזה (אנמיה עוף Virus-VP3) מציג לוקליזציה cytoplasmic בעיקר סוגי תאים ראשוניים לוקליזציה גרעיני סוגי תאים טרנספורמציה כמו דמיינו ידי מיקרוסקופיה epifluorescence. החלבון מבוטא היתוך כדי או GFP (pEGFP-N1 וקטור, Clontech) ב fibroblasts העורלה הראשי (קרן היסוד) או dsRed (dsRed-N1 וקטור, Clontech) ב H1299 תאים. דגימות בקרת מעורבים עצמית fusions (שתי שורות למעלה) להציג תאים multinucleated ללא שינוי היציב דפוסי לוקליזציה. שינויים כאלה שעלולות להתרחש עקב רגישות לתנאי היתוך או היווצרות של syncitia. Fusions Heterokaryon (השורה התחתונה) להפגין כניסה הגרעיני של חלבון ה-GFP-התמזגו תאים שמקורם הראשוני colocalization עם חלבון dsRed-התמזגו בתגובה הקדמה של חומר תא שינה. הדוגמה המוצגת היא שילוב heterokaryon נדיר יחסית הנובעת רק שני תאים, אחד מכל סוג, כפי שמודגם על ידי נוכחות של שני אותות fluoroprotein. בנוסף לגילוי סוגים אלה של מעברים לוקליזציה, פעילות הלוך ושוב nucleocytoplasmic ניתן לאתר בקלות על ידי נוכחות של fluorophore יחיד גרעינים שניהם. זה סוג של נחישות ברורה כאשר בוחנים 01:01 fusions התא תלוי עיכוב של התרגום. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תרשים זרימה של השיטה heterokaryon באמצעות fibroblasts הראשי H1299 שאינם קטנים קרצינומה של תאים סלולריים. הגן של עניין הוא משובטים כדי לייצר היתוך מסגרת אחת של שני גנים חלבון פלואורסצנטי. קווים סלולריים הם אז transfected transiently עם לבנות או ואיפשר להתאושש. היווצרות Heterokaryon הוא המושרה על ידי טיפול קצר עם פוליאתילן גליקול (PEG) ואחריו דגירה נוסף. לבסוף, לוקליזציה המשנה הסלולר של החלבון של עניין הוא ציין באמצעות צורות שונות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. סחר Nucleocytoplasmic ו הלוך ושוב פעילות של חלבון אנמיה עוף וירוס VP3 דמיינו ידי היתוך heterokaryon. שורה עליונה: תמונות נציג עצמית התמזגו H1299 תאים להביע dsRed-VP3 שורה התיכון:.. תמונות epifluorescence נציג העיקרי תאים פיברובלסטים העורלה (קרן היסוד) להביע את ה-GFP-VP3 לאחר היתוך PEG שורה תחתונה: פיוז'ן Heterokaryon של קרן היסוד ו H1299 תאים. צהוב עולה colocalization-GFP אותות dsRed. תאים היו צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי AF6000E לייקה לייקה ותוכנות הדמיה.

<ol><li>Belaya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIPing+heterokaryons+to+analyze+nucleo-cytoplasmic+shuttling+of+yeast+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins.</a> RNA. 12, 921-930 (2006).</li>
<li>Bhaumik, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+target+of+a+transcriptional+activator+revealed+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer.</a> Genes Dev. 18, 333-343 (2004).</li>
<li>Cohen, H. R., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIST+RNA+exhibits+nuclear+retention+and+exhibits+reduced+association+with+the+export+factor+TAP%2FNXF1%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1.</a> Chromosoma. 116, 373-383 (2007).</li>
<li>Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dapper1+is+a+nucleoplasmic+shuttling+protein+that+negatively+modulates+Wnt+signaling+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus.</a> J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).</li>
<li>Grespin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+Hormone+Receptor+%CE%B11+Follows+a+Cooperative+CRM1%2FCalreticulin-mediated+Nuclear+Export+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thyroid Hormone Receptor α1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway.</a> J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).</li>
<li>Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptin+Nucleocytoplasmic+Shuttling+Is+Required+for+Cell+Type-Specific+Localization%2C+Apoptosis%2C+and+Recruitment+of+the+Anaphase-Promoting+Complex%2FCyclosome+to+PML+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virology%22%5BJournal%5D)">Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies.</a> J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).</li>
<li>Jeffries, S., Capobianco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+transformation+by+Notch+requires+nuclear+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization.</a> Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).</li>
<li>Keaton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocytoplasmic+trafficking+of+G2%2FM+regulators+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).</li>
<li>Ling, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear-Cytoplasmic+Shuttling+Is+Not+Required+for+the+Epstein-Barr+Virus+EBNA-LP+Transcriptional+Coactivation+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virology%22%5BJournal%5D)">Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function.</a> J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).</li>
<li>Lin, X. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RXR%CE%B1+acts+as+a+carrier+for+TR3+nuclear+export+in+a+9-cis+retinoic+acid-dependent+manner+in+gastric+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells.</a> J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).</li>
<li>Vissinga, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Export+of+NBN+Is+Required+for+Normal+Cellular+Responses+to+Radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation.</a> Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).</li>
<li>Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+p19Arf+localization+accompany+apoptotic+crisis+during+pre-B-cell+transformation+by+Abelson+murine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus.</a> J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול heterokaryon המובא כאן מספק שיטה יעילה לפרש בקלות עבור אפיון של התנהגות מסוג מסוים לוקליזציה התא וכן פעילות nucleocytoplasmic הלוך ושוב. שיטה זו מנצלת את הרגישות של ניתוח הקרינה, כמו גם את היכולת תאים התמונה לחיות ולבצע מחקרים של הדינמיקה חלבון. הטכניקה היא מותאמת בקלות הרבה סוגי תאים שונים, והוא מקובל גם הדמיה תא חי וקבוע. לדוגמה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך יכול לשמש הדמיה לחיות זמן לשגות לכידת וידאו. לעומת זאת, התאים רכוב ניתן להשתמש במיקרוסקופ או epifluorescence לקביעת מצב יציב לגרסאות המגוירות או הדמיה confocal מפורטת יותר של לגרסאות המגוירות בדידים. יתר על כן, טכניקות כגון התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP), או הפסד הקרינה photobleaching (FLIP) יכול לשמש בקביעת קינטיקה לוקליזציה 1. שילוב של fluorophores חלופי בפרוטוקול תאפשר אינטראקציה ניסויים כגון חלבון פלואורסצנטי תהודה העברת אנרגיה (סריג), שתבוצע בקונצרט 2. מעכבי שונים של סחר בבני הסלולר כגון B leptomycin או דומיננטי שלילי רן בונה GTPase ניתן להשתמש כדי להקים את התלות ביבוא מסוים או מסלולים יצוא 5,6,9. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים מסוימים מעורבים בפעילות הלוך ושוב, יש להקפיד כדי למנוע תופעות לוקליזציה בשל סינתזה של חלבונים חדשים. במקרים אלה, מעכבי תרגום או נקודות זמן מוגבל חייב לשמש. עם זאת, הממצאים בשל עיכוב translational להישאר אפשרות. Fusions תא המכיל אחד מכל סוג התא המבוקש ביותר לפרשנות ברורה של הלוך ושוב והתנהגות לוקליזציה. אופטימיזציה של מספר תאים התנאים היתוך (תזמון וריכוז) עשוי להיות נחוץ כדי לקדם אירועים כאלה נוחים 01:01 היתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לציין כי אופטימיזציה של צעדים מסוימים בפרוטוקול יהיה צורך בהתאם לסוגי תאים מסוים בשימוש. היבטים בהליך ניסיוני כגון איחוי יעילות, יעילות transfection, ואת הכדאיות לאחר המיזוג עשוי להשתנות במידה רבה בין סוגי תאים. בפרט, סוגי התאים העיקריים יכול להיות מאתגר לנהל בשל התנאים תרבות מורכבת transfection יעילות נמוכה. שימוש בטכנולוגיות כגון מכשיר Lonza Nucleofector יכול לאפשר עיבוד מהיר של התאים, כמו גם יעילות transfection עלה באופן דרמטי. בנוסף, שיטות electroporation לאפשר העברה קלה של תאים השעיה אל השלבים הבאים היתוך. </li></ul>

<table><tbody><tr><td>ריאגנט Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>סליין במאזן פוספטים (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3023602</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו&amp;rsquo;Eagle המודגש&amp;rsquo;תווך גידול (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30243FS</td><td>סוכר גבוה (High glucose)</td></tr><tr><td>פאראפורמאלדהיד</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>סרום Hyclone (עגלי עובר)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>פלטות 6 באריים של Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול 1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>528875-25GM</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2522-25G</td><td></td></tr><tr><td>ערכה ל-Nucleofector עבור תאי HDF</td><td>Lonza Inc.</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr></tbody></table>

heterokaryon טכניקה לניתוח של לוקליזציה cell סוג ספציפי

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

מספר משמעותי של חלבונים מוסדרים על ידי סחר subcellular או nucleocytolasmic הלוך ושוב. חלבונים אלה להציג מגוון רחב של תפקודים תאיים כולל לייבא גרעיני / יצוא של רנ&quot;א וחלבונים, תקנה תעתיק, ו אפופטוזיס. מעניין, וארגון מחדש הסלולר הגדולות, כולל חלוקת התא, בידול ושינוי, לעתים קרובות כרוך פעילויות כגון 3,4,8,10. מחקר מפורט של החלבונים האלה מנגנוני הרגולציה שלהם יכול להיות מאתגר כמו גירוי על שינויים אלה לוקליזציה יכול להיות חמקמק, והתנועות עצמם יכולים להיות דינמי די קשה לעקוב. מחקרים שכללו oncogenesis הסלולר, למשל, ממשיכים ליהנות מסלולים הבנה ופעילויות חלבון שונים בין תאים ראשוניים נורמליים ותאי שינה 6,7,11,12. כאשר חלבונים רבים מראים לוקליזציה שינו במהלך טרנספורמציה או כתוצאה של שינוי, שיטות כדי לאפיין ביעילות אלה חלבונים המסלולים שבהם הם משתתפים עומדים לשפר את ההבנה של oncogenesis ושטחים פתוחים תרופה חדשה המיקוד. כאן אנו מציגים שיטה לניתוח סחר חלבון הלוך ושוב בין פעילות בתאי יונקים העיקרי והפך. שיטה זו משלבת את דור fusions heterokaryon עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי לספק פרוטוקול גמיש שניתן להשתמש בהם כדי לזהות לגרסאות המגוירות חלבון היציב או דינמי. כפי שמוצג באיור 1, שני סוגי תאים נפרדים transfected transiently עם בונה פלסמיד הנושא גן fluoroprotein המצורפת הגן של עניין. אחרי הביטוי, התאים הם התמזגו באמצעות פוליאתילן גליקול, ואת לגרסאות המגוירות חלבון עלול אז להיות צילמו באמצעות מגוון של שיטות. הפרוטוקול המובא כאן הוא גישה בסיסית אשר בטכניקות מיוחדות ניתן להוסיף.

שיטה גמישה ויעילה לאפיון של לוקליזציה סוג ספציפי חלבון התא nucleocytoplasmic הלוך ושוב מתואר. גישה זו משתמשת heterokaryon חלבונים היתוך fluorescently-שכותרתו לגרסאות המגוירות חלבון תמונה לאחר איחוי תאים. פרוטוקול ניתנת היציב לגרסאות המגוירות או קביעות יותר דינמי המבוסס על הדמיה תא חי.

Heterokaryon טכניקה לניתוח של לוקליזציה Cell סוג ספציפי

מספר משמעותי של חלבונים מווסת על ידי תעבורה תת-תאית או מעבר הלוך ושוב בין הגרעין לציטוזול (nucleocytolasmic shuttling). חלבונים אלו מציגים מגוון רחב של...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לעקוב אחר תנועת חלבונים על ידי ביטוי של חלבון בודד הנושא שני פלואורופורים שונים בשתי שורות תאים נפרדות, ומיזוג שורות תאים אלו יחד. דבר זה מושג תחילה על ידי הטרנספקציה של פלסמידים הנושאים את הגן המדובר, המאוחה לאחד משני גנים של חלבוני פלואורופור שונים, לשני סוגי תאים נפרדים. השלב השני של ההליך הוא ערבוב התאים יחד ומתן אפשרות לכל סוג תא לצבור חלבון.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא עיכוב סינתזת חלבונים, ולאחר מכן מיזוג התאים באמצעות polyethylene glycol. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא ויזואליזציה של לוקליזציית החלבון באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות שינוי בלוקליזציית החלבון או בהתנהגות הטרנספורט (trafficking) באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הסרטן, כגון כיצד משתנים תפקודים והתנהגויות ספציפיות של חלבונים כאשר תאים הופכים למסרטנים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי שינויים הספציפיים לתאים שעברו טרנספורמציה, ניתן להחילה גם על מחקרים אחרים, כגון דיפרנציאציה של תאים, ביולוגיה התפתחותית ואיתות תאי.בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים שיטה זו יתקלו בקושי, כיוון שיהיה צורך באופטימיזציה של תנאי הטרנספקציה ושל תנאי ההיתוך עבור כל סוג תא שונה. השיטה הראשונה המוצגת בפרוטוקול זה להחדרת plasmid DNA לתאים היא שיטת ה-NU Nuclear Affection, המשתמשת בפתרון lonza nuclear effector; התחל בשטיפת תאים שעברו מעבר (passage) לאחרונה ונמצאים בשלב גדילה לוגריתמי באמצעות phosphate buffered saline PBS, ואסוף אותם באמצעות ization. לאחר שהתאים איבדו את היצמדותם, נטרל את ה-trypsin על ידי הוספת מצע מכיל סרום ואסוף את התאים על ידי סרטיפוגציה ב-1500 G למשך חמש דקות בזמן שהתאים עוברים סרטיפוגציה.הוסיפו כיסויות זכוכית (cover slips) סטריליות לפלטה עם שש בארות תחת מנדף לתרביות רקמה, ולאחר מכן העבירו בפיפט 1.5 milliliters של מצע גידול מלא לכל בארה. כסו את הפלטה והעבירו אותה לאינקובטור לתרביות תאים לצורך השוואת תנאים.לאחר הצנטריפוגה, העבירו את המבחנות למCב, שאבו את הנוזל העליון והשעיקו מחדש את משקעי התאים בנפח מינימלי של PBS. לאחר מכן, ספרו את התאים וחלקו את נפח סuspended התאים למבחנות מיקרו-צנטריפוגה סטריליות. הדבר יספק כ-5 × 10⁵ תאים לדגימה. צנטריפוגו שוב ב-1500 G למשך חמש דקות.עם השלמת הסנטריפוגציה, העבירו את המבחנות למנדף תרביות תאים, שאבו את ה-SNA והשעיקו בזהירות. השעיקו את התאים בכל מבחנה ב-100 µL של תמיסת nuclear effector בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 5 µg של DNA פלסמי לכל דגימה והעבירו את הדגימה ל-nuclear effector Q vete וכסו.הקפידו להימנע מבועות אוויר. הכניסו את ה-sample qve לתוך ה-Q vet holder. בחרו את תוכנית ה-nuclear effector המתאימה והפעילו אותה.בחירת התוכנית המתאימה ביותר עשויה לדרוש בדיקות מקדימות כדי לקבוע את יעילות הטרנספקציה האופטימלית עם מינימום תמותה. לאחר מכן, זרע את התאים לפלטה בעלת שישה בארות, באוכלוסיות מעורבות או בנפרד כביקורות. החזר את הפלטה לאנקובטור ואפשר לתאים להתאושש במשך 12 שעות.השיטה השנייה המוצגת לביטוי זמני של פלסמידים היא טרנספקציה באמצעות ריאגנט kagen affecting. כדי להתחיל, העבירו 0.8 micrograms של כל דגימה של DNA פלסמידי ל-200 microliters של בופר EC באבוב צנטריפוגה סטרילי. לאחר מכן, הוסיפו 6.4 microliters של ריאגנט מעצב (enhancer reagent) לכל דגימה.ערבבו קצרות על ידי נקישה על השפופרת והדגירו למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר דגירה קצרה זו, הוסיפו 20 µL של reagent המשפיע לכל דגימה. ערבבו כל שפופרת על ידי נקישה והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.במהלך הדגירה, הכינו את שני קווי התאים שבהם תשתמשו בניסוי. לצורך הטרנספקציה, התאים צריכים להיות במעבר תאים (passaging) עדכני ובגדילה לוגריתמית בהסמכה של כ-80%. שטפו את התאים פעם אחת באמצעות PBS והוסיפו בחזרה 1.5 milliliters של DMEM טרי עם 10% FBS.לאחר שדגמי הריאגנטים לטרנספקציית DNA דגרו במשך 15 דקות, הוסיפו לכל דגימה 1.2 milliliters של מצע DMEM בתוספת 10% FBS, ערבבו באמצעות פיפטינג והעבירו מיד, בטפטוף, כ-700 microliters מהקומפלקסים לכל אחת משתי הבארים בלוח שש הבארים, וערבבו על ידי סיבוב הלוח. אפשרו לתאים לעבור טרנספקציה למשך שלוש שעות לפחות באינקובטור; במידת הצורך, הניחו כיסוי זכוכית (cover slip) סטרילי אחד לכל באר בלוח שש הבארים בתוך מ написано תחת מנדף תרביות התאים.ניתן להשתמש בלוחיות כיסוי מצופות כדי לשפר את היצמדות התאים. לאחר מכן, יש לשטוף את התאים שעברו טרנספקציה פעמיים ב-PBS ולאסוף את התאים באמצעות טריפסינציה מינימלית. פעולה זו מתבצעת על ידי הוספת 100 µL של תמיסת טריפסין לכל באר תוך ניעור של הפלטה כדי להבטיח כיסוי מלא.לאחר מכן, שאבו מיד את שאריות ה-trypsin. נטרלו את ה-trypsin שנותר על ידי השהיה מחדש של התאים ב-1.5 milliliters של DMEM טרי עם 10%FBS, והעבירו את התאים למצע גידול, בין אם כאוכלוסיות מעורבבות ובין אם בנפרד כביקורות. בלוח שש התאים המכיל זכוכית כיסוי (cover slips), אפשרו לתאים להתאושש במשך 12 שעות באינקובטור לתרביות תאים.בלי קשר לשיטת הטרנספקציה, הפרוצדורה ליצירת הזרקות נשאיות הטרוגניות היא זהה. לאחר הטרנספקציה, יש להסיר את מצע התרבית מהבארות ולשטוף את התאים פעמיים ב-PBS. לאחר מכן, מומלץ לטפל בתאים ב-cyclo heide כדי לעכב סינתזה נוספת של חלבונים.הוסיפו cyclo heide בריכוז של 100 µg/mL למצע התרבית כדי לכסות את התאים, והדגירו למשך שעתיים באינקובטור לתרביות תאים. לאחר שעתיים, הוציאו את התאים מהאינקובטור ושטפו אותם פעמיים ב-PBS. כדי להתחיל את ההיתוך, כסו את התאים בתמיסה של 50% polyethylene glycol 1000 ב-DMEM ללא סרום והדגירו למשך 125 שניות.בטמפרטורת החדר, הסר את תמיסת ה-PEG ושטוף את התאים ב-PBS כדי להסיר שאריות peg. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS שחומם ל-37 °C. הדגר את התאים למשך 18 עד 24 שעות באינקובטור לתרביות תאים.לאחר דגירה של 18 עד 24 שעות, הוציאו את הפלטה מהמדגרה ושטפו את התאים פעמיים ב-PBS. לאחר מכן, העבירו בפיפטה 1 mL של 4% פאראפורמאלדהיד ב-PBS לכל באר ונערה בעדינות במשך 15 דקות.במהלך הדגירה, הכינו את תויות המיקרוסקופ לשימוש על ידי הוספת טיפה אחת של תכשיר קיבוע המכיל dpi. לאחר מכן, שטפו את התאים המקובעים פעמיים ב-PBS והסירו בזהירות כל זכוכית כיסוי באמצעות פינצטה קטנה. ספגו את ה-PBS שנותר בעזרת פיסת רקמה לפני הנחתה, כאשר צד התאים פונה כלפי מטה, על תותית מיקרוסקופ עם תכשיר קיבוע בתוספת tappi.הסר את עודפי תוך המקום (mounting medium) מהשקופית בעזרת נייר סופג ואטום את קצוות הזכוכיות המכסות. באמצעות לק לציפורניים, ניתן כעת להדמיאן את התאים במיקרוסקופיה קונפוקלית או במיקרוסקופיית פלואורסצנציה אפיפלואורסצנטית. בתרשים הזרימה זה, מוצגת שיטת ההטרו (hetero method) לניתוח לוקליזציה של חלבונים הספציפית לסוג תא, בשלושה שלבים בסיסיים.טרנספקציה של פלסמיד המבטא חלבון מסומן פלואורסצנטית במיזוג תאים עם polyethylene glycol 1000 ודימות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כפי שניתן לראות בתמונות epi fluorescence אלו: פיברובלסטים ראשוניים של ערלה, ביקורות במיזוג עצמי המבטאות חלבון VP3 של נגיף האנימיה בעוף המסומן ב-GFP מראות לוקליזציה ציטופלזמית בעיקרה של החלבון בשורת תאי קרצינומה של ריאה שאינם תאי קטנים H 1299. ביקורות במיזוג עצמי עם אותו חלבון VP3 המסומן ב-DS.RED מראות לוקליזציה גרעינית בעיקרה. מיזוג הטרוקרני של פיברובלסטי ערלה ראשוניים ותאי H 1299 גורם להחדרה של חומר תאי טרנספורמיפי לתוך הפיברובלסטים הראשוניים של הערלה, וגורם לשינוי בלוקליזציה של VP3 המופק מתאים ראשוניים ומסומן ב-GFP אל הגרעין.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי ההצלחה תהיה תלויה במידה רבה ביעילות הטרנספקציה בסוגי התאים הספציפיים שבהם נעשה שימוש, וכן באופטימיזציה של תנאי ההיתוך עבור תאים אלו. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון flip ו-frap כדי לענות על שאלות נוספות הכוללות ניתוח בזמן אמת של דינמיקת הלוקליזציה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן להעריך לוקליזציות של חלבונים הספציפיות לסוגי תאים באמצעות הכנסת חלבונים מתויגים פלואורסצנטית ויצירת היתוכי תאים.

heterokaryon-technique-for-analysis-of-cell-type-specific-localization

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במאמר זה אנו מתארים שיטה פשוטה קצירת של תאים בודדים מתרבויות עכברוש העיקרי העצבית וניתוח transcriptome הבאים באמצעות הגברה ארנה. גישה זו היא להכליל לכל סוג תא.

ניתוח Transcriptome של תאים בודדים

רקמות דרוזופילה בדרך כלל מכילות תערובת הטרוגנית של סוגי תאים. כדי לבחון ביטוי גנים בסוגי תאים מסוימים מרקמה מסוימת, גרעינים יכולים להיות מתויגים גנטי ולאחר מכן מבודד באמצעות גישה המבוססת על זיקה. גרעינים בודדים יכולים לשמש עבור יישומים במורד כגון ניתוח ביטוי גנים וimmunoprecipitation הכרומטין.

בידוד מבוסס זיקה של תייג גרעינים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות לניתוח ביטוי גנים

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בטכניקת מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים (FACS) כדי למיין סוגים ספציפיים של תאים עצביים לניתוח עוקב של ביטוי גנים ספציפיים לסוג התא, סמנים אפיגנטיים ו/או ביטוי חלבון.

ביטוי גנים מסוג התא ספציפי באמצעות סלולארי קרינה המופעל מיון לבדיקת רקמות במוח החולדה

כאן אנו מדווחים על פרוטוקולים לאיתור חלבוני צנטרומר-קינטוכור אנדוגניים ואקסוגניים בתאים אנושיים ולכמת את רמות החלבון הללו בצנטרומר-קינטוכור על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית עקיפה באמצעות קיבוע (קיבוע פרפורמלדהיד, אצטון או מתנול).

חלבונים Immunofluorescence ניתוח של אנדוגני אקסוגניים centromere-קינטוכור

כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית לסיווג סוגי תאים נוירונים לפני הבידוד ועל אפיון לאחר מכן של transcriptomes תא בודד. פרוטוקול זה מייעל את ההכנה של דגימות עבור רצף RNA מוצלח (RNA-Seq) ומתאר מתודולוגיה שתוכננה במיוחד עבור הבנה משופרת של מגוון הסלולר.

יחיד תא RNA-Seq של קבוצות מוגדרות של תאים גנגליון רשתית

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה ונוחה כדי לתייג והמחש בשידור חי הכרומוזומים בתאים mitotic באמצעות תווית 2.0 BacMam Histone2B-GFP ומערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית דיסק מסתובב.

תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה

כאן, אנו מציגים עבור צבע רב לוקליזציה של חלבוני ממברנה בודדת פרוטוקול organelles של תאים חיים. כדי לצרף fluorophores, משמשים החלבונים תיוג עצמי. חלבונים, במיקום שונה ממברנות תאי האברון המשמש אותו, יכול להיות מקומי עם דיוק של ~ 18 ננומטר.

צבע רב לוקליזציה מיקרוסקופיה של חלבוני ממברנה בודדת ב- Organelles של תאים בתרבית של חיים

תפזורת ג'ין ביטוי מדידות ענן תא בודד הבדלים באוכלוסיות הטרוגניות תא. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור ביטוי מפענוח ואינדקס איך החד-תאיים מיון על-ידי Florescence מופעל התא מיון (FACS) יכול להיות משולב על הטרוגניות, immunophenotypically מאפיינות אוכלוסיות תאים נפרדים מולקולרי.

הגישה קומבינטורית תא בודד כדי לאפיין את מולקולרית והטרוגניות Immunophenotypic של גזע האדם ואוכלוסיות קדמון

מטרת פרוטוקול זה היא לנתיך שני סוגי תאים שונים כדי ליצור תאים היברידיים. ניתוח מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית של תאים התמזגו משמש כדי לעקוב אחר התא של המקור של אורגלים הסלולר. ניתן להשתמש באפשרות זו כדי לחקור כיצד המבנה התאי והפונקציה מגיבים להפרעות באיחוי התאים.

תא תא פיוז'ן של הגנום בעריכה קווי תאים עבור פרטורבציה של מבנה הסלולר ותפקוד

ההצלחה של תעתיק חד-תאי/חד-גרעיני ומולטי-אומיקה תלויה במידה רבה באיכות התאים/גרעינים. לכן, בידוד תאים/גרעינים מרקמה וטיהורם חייבים להיות סטנדרטיים ביותר. פרוטוקול זה מתאר את הכנת הגרעינים מהמוח וממח העצם לבדיקת מולטיום-גרעינים חד-גרעיניים במורד הזרם.

הכנה איכותית של גרעיני מוח ומח עצם לבדיקות מולטיום של גרעינים בודדים

אנו מציגים פרוטוקול צביעה וניתוח מיקרוסקופ מיקום כרומטין חד-מולקולי (SMLM) בשלושה צבעים, המאפשר מיפוי שכפול של אאוכרומטין, הטרוכרומטין ו-RNAP II לניתוח מרחבי. פרוטוקול זה מאפשר תיוג רב-צבעוני יעיל בסביבות גרעיניות צפופות, כולל מטרות הקשורות לכרומטין, ומאפשר גילוי סימולטני אמין.

פרוטוקול מיקרוסקופ מיקום מולקולה בודדת רב-תוויות לחקר כרומטין בסביבה גרעינית צפופה

למדו שיטת הטרוקריון לניתוח לוקליזציה ספציפית לסוג תא באמצעות שתי קווי תא נפרדים ופיוז'ן עם פוליאתילן גליקול. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תנועת חלבונים ושינויי התנהגות בתאים חיים.

Heterokaryon טכניקה לניתוח של לוקליזציה Cell סוג ספציפי

גלה סרטונים נוספים