מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד את תוחלת החיים של תולעי C. elegans שעובדו באמצעות תרופות נבדקות. זאת מושגים תחילה על ידי הכנת OP 50, זן חיידקי המשמש להאכלת התולעים. לאחר מכן נוצרת אוכלוסיית תולעים מסונכרנת גילאית, אשר נזרעה בלוחות של 96 בארות יחד עם חיידקי ההזנה OP 50.

במהלך יומיים הבאים, התולעים גדלות לשלב הלרבה L4 והתרופה FUDR מתווספת כדי למנוע רבייה. למחרת, התולעים מגיעות לבגרות והתרופות הנחקרות מתווספות לבארות הבודדות. מנקודה זו ואילך, מספר התולעים החיות והמתות נקבע מדי יומיים עד שלושה ימים, עד שכל התולעים מתות.

התצפית מבוצעת באמצעות מיקרוסקופ הפוך ומספר התולעים המתות והחיות נרשם בכל מפגש. שלום, אני גרג סוליס. אני נמצא במעבדת פטרו במחלקה לפיזיולוגיה כימית במכון סקריפס למחקר (Scripps Research Institute).

היום אראה לכם כיצד לסנכרן תולעים ולחלק אותן לתוך פלטות מיקרוטיטר בעלות 96 בארות. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מאפשרת זיהוי מהיר של מולקולות המאריכות את תוחלת החיים של C. elegans. אז בואו נתחיל.

להכנת חיידקי הזנה עבור C elegance, התחילו ביום מינוס שבעה על ידי הזרקת מושבה בודדת של OP 50 לתוך 5 mL של TB המכיל 100 µg/mL של persin ו-0.1 µg/mL של terin B; דגרו למשך לילה ב-37 °C בשייקר חיידקים. מוקדם למחרת בבוקר, דללו את תרבית הלילה של OP 51 ב-300 mL של TB המכיל 50 µg/mL של ampicillin. דגרו את התרבית בשייקר חיידקים למשך 8 עד 12 שעות ב-37 °C עד להגעה לרוויה. אין לאפשר לתרבית לגדול מעבר ל-14 שעות.

העבירו את ה-OP 50 לשפופרת צנטריפוגה סטרילית שנשקלה מראש. השקיעו את ה-OP 50 באמצעות צנטריפוגה למשך 10 דקות במהירות של 3,500 RPM או 2,200 ×g בצנטריפוגת שולחן. השליכו את העליון (supernatant), השביו את משקע ה-OP 50 במים מזוקקים והשקיעו שוב באמצעות צנטריפוגה. חזרו על פעולה זו; שטפו פעמיים לאחר הפעם השנייה.

שטפו בזהירות והסירו לחלוטין את כל השאריות של המים. שקלו את מבחנת הצנטריפוגה המכילה את המשקע והפחיתו את משקלה של מבחנת צנטריפוגה ריקה כדי לקבוע את משקל המשקע. לאחר מכן, השעיו את המשקע ביסודיות ב-S Complete עד לריכוז של 100 mg/mL.

אין להשאיר גושים. ריכוז של 100 milligrams per milliliter של OP 50 צריך להתאימו ל-2x10¹⁰ חיידקים per milliliter. השתמש בפוטו-ספקטרומטר כדי לקבוע את מספר החיידקים per milliliter אם הקשר בין הצפיפות האופטית למספר החיידקים per milliliter ידוע.

במידת הצורך, התאימו את ריכוז תמיסת ההזנה של OP 50 ל-2×10¹⁰ חיידקים למוליליטר. לבסוף, אחסנו את תמיסת ה-OP 50 בטמפרטורה של 4°C עד לשימשה עבור תרבית התולעים, כדי ליצור אוכלוסיית תולעים סינכרונית מבחינת גיל. התחילו בשעות אחר הצהריים המאוחרות של יום 6- עם פלטת NGM בת 5 עד 10 ימים, שבה אוכלוסיית התולעים מורכבת בעיקר מזחלים בשלב L1 רעבים.

עקרו שפכטל מתכת על ידי חימום קצר מעל מבער בנזן. הניחו לו להתקרר. לאחר מכן, השתמשו בשפכטל הקר כדי לחתוך נתחי אגר מהצלחת המכילה את התולעים המורעבות.

העבירו מספר נתחים כאלה לצלחת NGM חדשה של 10 סנטימטרים שזרעו בה OP 50. דגרו את התולעים למשך כ-65 שעות בטמפרטורה של 20 degrees Celsius עד שרוב אוכלוסיית התולעים תהיה בגיל grave adults. הזמן שנדרש לבעלי שלב L one מורעבים לגדול ל-grave adults עשוי להשתנות מזן לזן.

לאחר הדגירה, אסוף את התולעים מהצלחת שקוטרה 10 סנטימטר על ידי שטיפתן מהצלחת עם 5 עד 10 מיליליטר של מים סטריליים. העבר את תמיסת המים עם התולעים לשפופרת קונית של 15 מיליליטר. שטוף את התולעים על ידי סבוב בצנטריפוגת שולחנית במשך שתי דקות במהירות של 1,200 RPM או 280 ×g. השלף את העלייה והוסף 10 מיליליטר של מים.

חזור על שלב השטיפה, הסר את הנוזל העליון (natant) והוסף חמישה מיליליטר של תמיסת אקונומיקה שהוכנה טרייה. דגום את תמיסת ה-Sodium hydroxide למשך חמש דקות ב-RT עד שהתולעים נפתחות. הקפד לבצע וורטקס (vortex) בעדינות מדי דקה.

עקבו אחר התקדמות התגובה תחת מיקרוסקופ דיסקסיה מיד לאחר שכל הבוגרים נמסים. הוסיפו חמישה מיליליטר של M nine buffer כדי לנטרל את התגובה. שטפו את הביצים שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של M nine buffer באמצעות סבוב בצנטריפוגה למשך שתי דקות במהירות של 2, 500 RPM או 1, 100 times G. לאחר מכן, שטפו את הביצים פעם אחת עם 10 מיליליטר של S complete באמצעות סבוב בצנטריפוגה למשך שתי דקות במהירות של 2, 500 RPM או 1, 100 times G. הסירו את הסנאט.

הוסיפו 10 milliliters של S complete והעבירו את התמיסה למבחנה קונית נקייה של 50 milliliters. הוסיפו 30 milliliters של S complete כדי להגיע לנפח סופי של 40 milliliters. נערו בעדינות את המבחנה למשך הלילה בטמפרטורת החדר באמצעות מוטטור (mutator) או מכשיר דומה, כדי לזרוע את צלחות בעלי החיים למחרת בסביבות הצהריים.

תחת מיקרוסקופ סטריאוסקובי (dissecting scope), בדקו האם התולעים בקעו במהלך הלילה. קבעו את ריכוז התולעים בתמיסת S complete על ידי ספירת מספר התולעים בטיפות של 10 µL. בעזרת מיקרוסקופ סטריאוסקובי, ספרו לפחות 10 טיפות עבור כל דגימה.Resus.

השעו את התולעים בריכוז של 80 עד 100 תולעים למיליליטר. למדום S complete, הוסיפו carbenicillin לריכוז סופי של 50 micrograms per milliliter ו-amphotericin B לריכוז סופי של 0.1 micrograms per milliliter. נערו במערער (mutator).

במידה ומכינים כמויות גדולים יותר של תולעים, השתמשו בבקבוק ערבוב (non clon flask) של 600 מיליליטר עם פקק מסנן. בשעה 14:30, הוסיפו את ה-OP 50 שהוכן בחלק הראשון לריכוז סופי של 6 mg/mL. החזירו את ה-OP 50 לטמפרטורה של 4 °C. העבירו 120 µL של תמיסת התולעים עם OP 50 לכל באער של פלטת 96 באערים בעלת תחתית שקופה.

יש לוודא שהתולעים והסוספנזיה נשארים בפנים בעת הפיפטור; יש לאטום את הפלטה באמצעות סרט איטום כדי למנוע זיהום והתאיידות. יש לנער את הפלטה במנער פלטות מיקרוטיטר במשך שתי דקות ולהדגיר למשך יומיים בטמפרטורה של 20 °C עד שהבעלי החיים מגיעים לשלב L4. לאחר מכן, כדי לעקר את בעלי החיים, יש להוסיף 30 µL של תמיסת סטוק FUDR בריכוז 0.6 mM לכל באר.

שלב זה מעלה את הנפח הסופי בכל באר ל-150 µL ומפחית את הריכוז הסופי של OP 50 מ-6 mg/mL ל-5 mg/mL. אטמו את הפלטה באמצעות סרטי איטום ונערה אותה במשך שתיים עד שלוש דקות במנער פלטות מיקרוטיטראציה. אם OP 50 הוסף בשעה 2:30 ביום מינוס 2, חשוב להוסיף את ה-FUDR לפני הצהריים; החזירו את הפלטות לאינקובטור בטמפרטורה של 20 °C עד השעה 9:00 בבוקר למחרת.

מרבית בעלי החיים צריכים להיות בגרים ולהכיל מספר ביצים. יש להוסיף לכל קבוצה את התרופות שאת השפעתן על תוחלת החיים ברצוננו לבחון, בריכוז הרצוי. במקרה של המסת התרופות ב-DMSO, ריכוזי ה-DMSO הסופיים לא יעלו על 0.6%, שכן ריכוזי DMSO הגבוהים מ-0.6% מקצרים את תוחלת החיים של ה-elgan לאחר הוספת התרופה.

אטמו את הפלטות באמצעות סרט איטום ונערה אותן במשך שתי עד שלוש דקות במנער פלטות מיקרוטיטר. החזירו את הפלטות לאינקובטור בטמפרטורה של 20 degrees Celsius. הוספת התרופות עלולה לעיתים להוביל למותם של מספר בעלי חיים בכל פלטה, במיוחד אם נעשה שימוש בממס שאינו מים.

השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לבדוק אם ישנם בעלי חיים מתים. באופן כללי, מספר בעלי החיים המתים צריך להיות נמוך מ-10 לכל פלטת 96 בארות. החזר את הפלטות לאינקובטור בטמפרטורה של 20 degrees Celsius למשך יומיים כדי לאפשר לחמצן טרי לחדור לתרבית. הסר את האיטום.

המתינו דקה אחת ואטמו מחדש את הפלטה. נערו את הפלטה במשך שתיים עד שלוש דקות במנער פלטות מיקרוטיטר (microtighter plate Shaker). חזרו על הפעולה פעם בשבוע ביום החמישי של אורך חיי הבוגרים. הוסיפו 5 µL של תמיסת OP 50 בריכוז 100 mg/mL שהוכנה קודם לכן לכל אחד מ-96 הבארות כדי למנוע הרעבה. תחלמי התולעים נקבעים על סמך תנועתן שלוש פעמים בשבוע, מתחילת הניסוי ועד למותן.

השתמשו במיקרוסקופ הפוך עם עדשה אובייקטיבית של 2x או 2.5x כדי לצפות בתולעים בלוחות 96-בארות ביום אפס, בתחילת הניסוי. ספרו את המספר הכולל של התולעים בכל בארה.

בארות חיישן המכילות יותר מ-18 בעלי חיים מהניתוח יסומנו, שכן בעלי חיים בבארות אלו לא יספיקו להם OP 50 והם יראו השפעות של הגבלה תזונתית בכל סבב ספירה. רשמו את התאריך ואת מספר בעלי החיים שזזים כבעלי חיים חיים. תנועה בנוזל קלה הרבה יותר מאשר במצע מוצק וניתנת להשראה על ידי תאורה חזקה.

שימוש בהגדלה גבוהה יותר עשוי לסייע בזיהוי תנועות עדינות מאוד, כגון אלו בקצה הלוע. תנועות עדינות כאלו הן לעיתים קרובות התנועות היחידות הנצפות בבעלי חיים זקנים מאוד. החזירו את הצלחות לדגירה בטמפרטורה של 20 degrees Celsius.

חזרו על סבבי הספירה מדי יומיים עד שלושה ימים עד שכל בעלי החיים מתים. זהו עיצוב של גיליון Excel לרישום נתוני תוחלת חיים עבור כל באר. הקואורדינטה שלו בלוחית, זן, ריכוז התרופה של התרופה, ומספר בעלי החיים הכולל שחיים ביום אפס נרשמים בתחילת הניסוי.

יש לתעד את התאריך וכן את מספר בעלי החיים החיים והמתים שלוש פעמים בשבוע, כדי לעקוב אחר ההישרדות של האוכלוסיות השונות בכל באר. איור זה מציג תוצאות של עקומות אורך חיים של sea elegance שתועדו ב-20 °C וב-25 °C. בדיקת אורך החיים מבוססת המיקרוטיטר משחזרת במדויק שינויים באורך החיים התלויים בטמפרטורה.

באופן דומה, כפי שמוצג כאן, בדיקת לוח המיקרוטיטר משחזרת שינויים באורך החיים של מוטנטים שדווח כי אורך חייהם שונה מזה של בעלי הטיפוס הפראי N two. איור זה מראה כיצד מינונים עולים של mirtazapine משפיעים על אורך החיים הממוצע של sea elegance. הנתונים שהתקבלו באמצעות בדיקת לוח המיקרוטיטר הם כמותיים מספיק כדי לקבוע קשרי תגובה למינון. לאחר שילטו בטכניקה זו, ניתן להשתמש בה לסריקת ספריות כימיות גדולות של מולקולות המאריכות את אורך החיים של sea elegance.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.