Name: מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: למדו מדידת אורך חיים ב־Caenorhabditis elegans באמצעות צלחות 96 בארבעה. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר של תרכובות המאריכות חיים ביצורים מודל לחקר הזדקנות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרוטוקול זה פותח במקור על ידי Xiaolan יה מיכאל Petrascheck על פרד האצ&#39;ינסון לחקר הסרטן בסיאטל במעבדה של לינדה באק. הגרסה המפורטת לעיל הוכנה על מנת להפוך את התהליך כולו לרשות הציבור הרחב. אנו מודים קרול טיילור, שרה LeBoeuf ואנדי Tomacelli עבור אנושות בקריאת פרוטוקול. זהו כתב היד # 2866 מן המחקר סקריפס המכון. המעבדה Petrascheck ממומנת על ידי תוכנית נוברטיס ADI.

<ol><li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+life-span+of+age-1+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+and+lower+Gompertz+rate+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Increased life-span of age-1 mutants in Caenorhabditis elegans and lower Gompertz rate of aging.</a> Science. 249, 908-912 (1990).</li>
<li>Kenyon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genetics of ageing.</a> Nature. 464, 504-512 (2010).</li>
<li>Finch, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">The genetics of aging.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 2, 435-462 (2001).</li>
<li>Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blueberry+polyphenols+increase+lifespan+and+thermotolerance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Blueberry polyphenols increase lifespan and thermotolerance in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 5, 59-68 (2006).</li>
<li>Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticonvulsant+medications+extend+worm+life-span%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Anticonvulsant medications extend worm life-span.</a> Science. 307, 258-262 (2005).</li>
<li>McColl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenetic+analysis+of+lithium-induced+delayed+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenetic analysis of lithium-induced delayed aging in Caenorhabditis elegans.</a> J. Biol. Chem. 283, 350-357 (2008).</li>
<li>Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antidepressant+that+extends+lifespan+in+adult+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An antidepressant that extends lifespan in adult Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 450, 553-556 (2007).</li>
<li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reserpine+can+confer+stress+tolerance+and+lifespan+extension+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Reserpine can confer stress tolerance and lifespan extension in the nematode C. elegans.</a> Biogerontology. 9, 309-316 (2008).</li>
<li>Wood, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirtuin+activators+mimic+caloric+restriction+and+delay+ageing+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans.</a> Nature. 430, 686-689 (2004).</li>
<li>Evason, K., Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproic+acid+extends+Caenorhabditis+elegans+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Valproic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 7, 305-317 (2008).</li>
<li>Onken, B., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+induces+a+dietary+restriction-like+state+and+the+oxidative+stress+response+to+extend+C.+elegans+Healthspan+via+AMPK%2C+LKB1%2C+and+SKN-1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Metformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans Healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1.</a> PLoS One. 5, e8758-e8758 (2010).</li>
<li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+increases+stress+resistance+and+extends+life+span+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%29%22%5BJournal%5D)">Ginkgo biloba extract EGb 761 increases stress resistance and extends life span of Caenorhabditis elegans.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 48, 725-731 (2002).</li>
<li>Kang, H. L., Benzer, S., Min, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+extension+in+Drosophila+by+feeding+a+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Life extension in Drosophila by feeding a drug.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 838-843 (2002).</li>
<li>Avanesian, A., Khodayari, B., Felgner, J. S., Jafari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamotrigine+extends+lifespan+but+compromises+health+span+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Lamotrigine extends lifespan but compromises health span in Drosophila melanogaster.</a> Biogerontology. 11, 45-52 (2010).</li>
<li>Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+life-span+with+superoxide+dismutase%2Fcatalase+mimetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics.</a> Science. 289, 1567-1569 (2000).</li>
<li>Benedetti, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+that+confer+thermal+stress+resistance+and+extended+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan.</a> Exp. Gerontol. 43, 882-891 (2008).</li>
<li>Braungart, E., Gerlach, M., Riederer, P., Baumeister, R., Hoener, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+MPP%2B+model+of+Parkinson%27s+disease+for+high-throughput+drug+screenings%5BTitle%5D)+AND+%22Neurodegener+Dis%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans MPP+ model of Parkinson's disease for high-throughput drug screenings.</a> Neurodegener Dis. 1, 175-183 (2004).</li>
<li>Kwok, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li>
<li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chem Biol. 4, 527-533 (2009).</li>
<li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+function+in+novel+targets%3A+C.+elegans+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nat Rev Drug Discov. 5, 387-398 (2006).</li>
<li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli%3A+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 2172-2175 (1989).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li>
<li>Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosecretory+control+of+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).</li>
<li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול שהוצג מאפשר מדידת C.elegans תוחלת החיים ב 96 צלחות microtiter היטב. כפי שמוצג בתוצאות נציג בסעיף זה אמין משכפל ממצאים קודמים ומספק מידע כמותי. שימוש assay זה יש לנו הוקרן בהצלחה והשפעתם על תוחלת החיים C.elegans מעל 89,000 מולקולות. לצורך ההקרנה סמים, מדידת תוחלת החיים בתבנית 96 microtiter גם צלחת יש מספר יתרונות על פני assay התקשורת הקלאסית מוצק. זה מפחית את העבודה הדרושה התקשורת הכנה, את כמות שטח הדגירה, ואת כמות התרופה הנדרשת. הפורמט 96-היטב את ההגדרה מיקרוסקופיה לאפשר אוטומציה של assay כולו הקרנות תפוקה גבוהה. במהלך הפיתוח של assay ערכים מרובים עבור כל משתנה ושילובים של הנ&quot;ל נבדקו השפעתם על C.elegans תוחלת החיים. בדיקות אלה כללו ריכוז OP50 שונים הנעים בין 3-10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(3, 4, 6, 8, 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל), מספר שונה של תולעים בכל טוב החל 7-45 (7, 10, 15, 22, 45 תולעים / טוב), כרכים תרבות שונים הנעים בין 40 ל 150 לכל μL היטב (40, 60, 80, 100, 120, 150 μL), וכן שינויים בהרכב חיץ. אם נמאס עם OP50 Carbenicillin עמידים, ציין לא Carbenicillin ולא amphotericin B בריכוזים נמצאו להשפיע C.elegans תוחלת החיים. רעד עדין רציף של הצלחות, כמו מומלץ לעיתים קרובות בתרבות C.elegans נוזלי, נמצא לוותר על בנפחים קטנים המשמשים assay זה. רעד עדין אך נדרש אם microtiter צלחות עם בארות גדולים יותר לשמש. הערכים המצוינים בפרוטוקול זה נבחרו בקפידה על בסיס השוואה סטטיסטית של תנאים שונים שנבדקו. התכונה המפתיעה ביותר של assay זה כנראה העובדה C.elegans יכולים להישמר 96 צלחות היטב חתומות עם הקלטת. Side-by-הצד השוואות לא גילה כל הבדל בין תוחלת החיים של חיות בתרבית unsealed צלחות, צלחות חתום עם אוטם ניילון, או צלחות חתום עם חומרי איטום המאפשרים חילופי אוויר. בכל שלושת התנאים, החיות פיתחו homogenously מאוד L1 למבוגרים הרה להולדת בתוך 65 שעות והראה תוחלת החיים דומה מאוד. בעלי חיים גדל במקביל על NGM פיתחו מעט מהר יותר, אבל ההבדל הזה היה עצמאי של היעדרות או נוכחות של אוטם. הפרוטוקול שהוצג מבוסס על חיידקים חיים, אבל יכול להיות מותאמים עבור חיידקים מתים. עם זאת, assay נוזל חיידקים לשרוד אחד יכול להתרבות במהירות לאכלס מחדש את התרבות. בידיים שלנו, הדרך היחידה אמין כדי להרוג חיידקים עד כדי כך שהם יכולים לשמש לתרבות נוזלי על ידי טיפול ממושך של החיידקים עם קרינת גמא. נקודה אחת חשוב לקחת בחשבון בתכנון של ניסוי תוחלת החיים הוא הכוח של גילוי. תלוי בגודל ההשפעה, ההשפעה של התרופה עניין חייבים להיבדק בבארות מרובים. ב assay טיפוסי 4 סמים מטופלים 4 בארות שליטה, המקביל בערך 40-50 חיות כל, צריך להספיק כדי לזהות עלייה של 30% בתוחלת החיים ב 95% יותר מאשר הניסויים. עליות של 14% מזוהים רק 60% מהמקרים ולכן דורשים בארות לשכפל יותר. שפע של נתוני תוחלת החיים שנוצר על ידי assay זה עשוי לשמש לפיתוח הניסוי או זן ספציפי מודלים Gompertz מצדי 1. אלה מודלים Gompertz מועילים כדי לקבוע את הכוח של איתור כדי להעריך את מספר תוצאות חיוביות וגם שליליות שווא עבור בקנה מידה גדול המסכים. אנו לאמת את התחזיות של מודלים אלה בניסויים עיוור והשתמשו בהם כדי להעריך את מספרם של תשלילים כוזב מסכים גדולים (תוצאות לא פורסם). לסיכום, אנו צופים כי assay הציג תהיה תועלת רבה לזהות מולקולות קטנות להאריך את תוחלת החיים של C.elegans ו ללמוד את המנגנונים.

A correction to the article Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates was made.

Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B</td><td>Calbiochem</td><td>cat# 171375</td><td>נקרא גם Fungizone</td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat# F0503</td><td>FUDR מנוטרל על ידי חום, יש להפשיר במים קרים</td></tr><tr><td>Mianserin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2525-250MG</td><td>לשימוש כביקורת חיובית בריכוז סופי של 50&amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>Cyproheptadine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat#C6022-MG</td><td>ביקורת חיובית חלופית בריכוז סופי של 10 &amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>סרט איטום</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 236370</td><td>פוליאסטר, לא סטרילי</td></tr><tr><td>פלטה של 96 בארות</td><td>Falcon BD</td><td>cat# 351172</td><td>לא מטופלת, שקופה, סטרילית באריזה בודדת, פוליסטירן</td></tr><tr><td>בקבוק Nunclon</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 178883</td><td>משמש לנפחים גדולים</td></tr></tbody></table>

מדידת caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

תוחלת החיים היא תהליך ביולוגי מוסדר על ידי מספר מסלולים גנטיים. אסטרטגיה אחת כדי לחקור את הביולוגיה של ההזדקנות היא ללמוד חיות הנמל מוטציות מרכיבי גיל הרגולציה המסלולים. אם מוטציות אלו לטרוד את הפונקציה של המסלול לגיל הרגולציה, ולכן לשנות את תוחלת החיים של האורגניזם כולו, הם מספקים תובנות מכניסטית חשוב 1-3. אסטרטגיה נוספת לחקור את הרגולציה של תוחלת החיים היא להשתמש מולקולות קטנות להפריע גיל הרגולציה המסלולים. נכון להיום, מספר מולקולות ידועים להאריך את תוחלת החיים ביצורים שונים מודל משמשים ככלים ללמוד את הביולוגיה של ההזדקנות 4-16. מספר מולקולות מזוהה עד כה הוא קטן לעומת &quot;הכלים&quot; הגנטי הזמין מחקר על הביולוגיה של ההזדקנות. Caenorhabditis elegans היא אחד הדגמים העיקרון המשמש במחקר ההזדקנות בגלל גנטיקה מעולה שלה אורך חיים קצר של שלושה שבועות. לאחרונה, C.elegans התפתחה כאורגניזם מודל מבוסס פנוטיפ מסכי סמים 5,7,16-20 בגלל גודלו הקטן ואת יכולתה לצמוח הצלחות microtiter. כאן אנו מציגים assay למדוד C.elegans תוחלת החיים ב 96 צלחות microtiter היטב. Assay פותחה בהצלחה למסך ספריות גדולות של מולקולות להאריך את תוחלת החיים C.elegans 7. האמינות של assay הוערך בדיקות מרובות: ראשית, על ידי מדידת תוחלת החיים של חיות הבר סוג גדל בטמפרטורות שונות; השני, על ידי מדידת תוחלת החיים של מוטנטים עם תוחלת החיים משתנה; שלישי, על ידי מדידת השינויים תוחלת החיים בתגובה ריכוזים שונים Mirtazepine של דיכאון. Mirtazepine יש בעבר הוכח להאריך את תוחלת החיים ב C.elegans 7. התוצאות של בדיקות אלה מראים כי assay הוא מסוגל לשכפל את הממצאים הקודמים של מבחני אחרות הוא כמותי. הפורמט microtiter גם עושה את זה assay תוחלת החיים תואם למערכות אוטומטיות טיפול נוזלי מאפשר השתלבות בפלטפורמות אוטומטיות.

בפרוטוקול זה אנו מציגים שיטה למדידת<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; תוחלת החיים בשנת 96 צלחות microtiter היטב.

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב

תוחלת החיים היא תהליך ביולוגי המווסת על ידי מספר מסלולים גנטיים. אסטרטגיה אחת לחקר הביולוגיה של ההזדקנות היא לימוד בעלי חיים הנושאים...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד את תוחלת החיים של תולעי C. elegans שעובדו באמצעות תרופות נבדקות. זאת מושגים תחילה על ידי הכנת OP 50, זן חיידקי המשמש להאכלת התולעים. לאחר מכן נוצרת אוכלוסיית תולעים מסונכרנת גילאית, אשר נזרעה בלוחות של 96 בארות יחד עם חיידקי ההזנה OP 50.במהלך יומיים הבאים, התולעים גדלות לשלב הלרבה L4 והתרופה FUDR מתווספת כדי למנוע רבייה. למחרת, התולעים מגיעות לבגרות והתרופות הנחקרות מתווספות לבארות הבודדות. מנקודה זו ואילך, מספר התולעים החיות והמתות נקבע מדי יומיים עד שלושה ימים, עד שכל התולעים מתות.התצפית מבוצעת באמצעות מיקרוסקופ הפוך ומספר התולעים המתות והחיות נרשם בכל מפגש. שלום, אני גרג סוליס. אני נמצא במעבדת פטרו במחלקה לפיזיולוגיה כימית במכון סקריפס למחקר (Scripps Research Institute).היום אראה לכם כיצד לסנכרן תולעים ולחלק אותן לתוך פלטות מיקרוטיטר בעלות 96 בארות. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מאפשרת זיהוי מהיר של מולקולות המאריכות את תוחלת החיים של C. elegans. אז בואו נתחיל.להכנת חיידקי הזנה עבור C elegance, התחילו ביום מינוס שבעה על ידי הזרקת מושבה בודדת של OP 50 לתוך 5 mL של TB המכיל 100 µg/mL של persin ו-0.1 µg/mL של terin B; דגרו למשך לילה ב-37 °C בשייקר חיידקים. מוקדם למחרת בבוקר, דללו את תרבית הלילה של OP 51 ב-300 mL של TB המכיל 50 µg/mL של ampicillin. דגרו את התרבית בשייקר חיידקים למשך 8 עד 12 שעות ב-37 °C עד להגעה לרוויה. אין לאפשר לתרבית לגדול מעבר ל-14 שעות.העבירו את ה-OP 50 לשפופרת צנטריפוגה סטרילית שנשקלה מראש. השקיעו את ה-OP 50 באמצעות צנטריפוגה למשך 10 דקות במהירות של 3,500 RPM או 2,200 ×g בצנטריפוגת שולחן. השליכו את העליון (supernatant), השביו את משקע ה-OP 50 במים מזוקקים והשקיעו שוב באמצעות צנטריפוגה. חזרו על פעולה זו; שטפו פעמיים לאחר הפעם השנייה.שטפו בזהירות והסירו לחלוטין את כל השאריות של המים. שקלו את מבחנת הצנטריפוגה המכילה את המשקע והפחיתו את משקלה של מבחנת צנטריפוגה ריקה כדי לקבוע את משקל המשקע. לאחר מכן, השעיו את המשקע ביסודיות ב-S Complete עד לריכוז של 100 mg/mL.אין להשאיר גושים. ריכוז של 100 milligrams per milliliter של OP 50 צריך להתאימו ל-2x10¹⁰ חיידקים per milliliter. השתמש בפוטו-ספקטרומטר כדי לקבוע את מספר החיידקים per milliliter אם הקשר בין הצפיפות האופטית למספר החיידקים per milliliter ידוע.במידת הצורך, התאימו את ריכוז תמיסת ההזנה של OP 50 ל-2×10¹⁰ חיידקים למוליליטר. לבסוף, אחסנו את תמיסת ה-OP 50 בטמפרטורה של 4°C עד לשימשה עבור תרבית התולעים, כדי ליצור אוכלוסיית תולעים סינכרונית מבחינת גיל. התחילו בשעות אחר הצהריים המאוחרות של יום 6- עם פלטת NGM בת 5 עד 10 ימים, שבה אוכלוסיית התולעים מורכבת בעיקר מזחלים בשלב L1 רעבים.עקרו שפכטל מתכת על ידי חימום קצר מעל מבער בנזן. הניחו לו להתקרר. לאחר מכן, השתמשו בשפכטל הקר כדי לחתוך נתחי אגר מהצלחת המכילה את התולעים המורעבות.העבירו מספר נתחים כאלה לצלחת NGM חדשה של 10 סנטימטרים שזרעו בה OP 50. דגרו את התולעים למשך כ-65 שעות בטמפרטורה של 20 degrees Celsius עד שרוב אוכלוסיית התולעים תהיה בגיל grave adults. הזמן שנדרש לבעלי שלב L one מורעבים לגדול ל-grave adults עשוי להשתנות מזן לזן.לאחר הדגירה, אסוף את התולעים מהצלחת שקוטרה 10 סנטימטר על ידי שטיפתן מהצלחת עם 5 עד 10 מיליליטר של מים סטריליים. העבר את תמיסת המים עם התולעים לשפופרת קונית של 15 מיליליטר. שטוף את התולעים על ידי סבוב בצנטריפוגת שולחנית במשך שתי דקות במהירות של 1,200 RPM או 280 ×g. השלף את העלייה והוסף 10 מיליליטר של מים.חזור על שלב השטיפה, הסר את הנוזל העליון (natant) והוסף חמישה מיליליטר של תמיסת אקונומיקה שהוכנה טרייה. דגום את תמיסת ה-Sodium hydroxide למשך חמש דקות ב-RT עד שהתולעים נפתחות. הקפד לבצע וורטקס (vortex) בעדינות מדי דקה.עקבו אחר התקדמות התגובה תחת מיקרוסקופ דיסקסיה מיד לאחר שכל הבוגרים נמסים. הוסיפו חמישה מיליליטר של M nine buffer כדי לנטרל את התגובה. שטפו את הביצים שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של M nine buffer באמצעות סבוב בצנטריפוגה למשך שתי דקות במהירות של 2, 500 RPM או 1, 100 times G. לאחר מכן, שטפו את הביצים פעם אחת עם 10 מיליליטר של S complete באמצעות סבוב בצנטריפוגה למשך שתי דקות במהירות של 2, 500 RPM או 1, 100 times G. הסירו את הסנאט.הוסיפו 10 milliliters של S complete והעבירו את התמיסה למבחנה קונית נקייה של 50 milliliters. הוסיפו 30 milliliters של S complete כדי להגיע לנפח סופי של 40 milliliters. נערו בעדינות את המבחנה למשך הלילה בטמפרטורת החדר באמצעות מוטטור (mutator) או מכשיר דומה, כדי לזרוע את צלחות בעלי החיים למחרת בסביבות הצהריים.תחת מיקרוסקופ סטריאוסקובי (dissecting scope), בדקו האם התולעים בקעו במהלך הלילה. קבעו את ריכוז התולעים בתמיסת S complete על ידי ספירת מספר התולעים בטיפות של 10 µL. בעזרת מיקרוסקופ סטריאוסקובי, ספרו לפחות 10 טיפות עבור כל דגימה.Resus.השעו את התולעים בריכוז של 80 עד 100 תולעים למיליליטר. למדום S complete, הוסיפו carbenicillin לריכוז סופי של 50 micrograms per milliliter ו-amphotericin B לריכוז סופי של 0.1 micrograms per milliliter. נערו במערער (mutator).במידה ומכינים כמויות גדולים יותר של תולעים, השתמשו בבקבוק ערבוב (non clon flask) של 600 מיליליטר עם פקק מסנן. בשעה 14:30, הוסיפו את ה-OP 50 שהוכן בחלק הראשון לריכוז סופי של 6 mg/mL. החזירו את ה-OP 50 לטמפרטורה של 4 °C. העבירו 120 µL של תמיסת התולעים עם OP 50 לכל באער של פלטת 96 באערים בעלת תחתית שקופה.יש לוודא שהתולעים והסוספנזיה נשארים בפנים בעת הפיפטור; יש לאטום את הפלטה באמצעות סרט איטום כדי למנוע זיהום והתאיידות. יש לנער את הפלטה במנער פלטות מיקרוטיטר במשך שתי דקות ולהדגיר למשך יומיים בטמפרטורה של 20 °C עד שהבעלי החיים מגיעים לשלב L4. לאחר מכן, כדי לעקר את בעלי החיים, יש להוסיף 30 µL של תמיסת סטוק FUDR בריכוז 0.6 mM לכל באר.שלב זה מעלה את הנפח הסופי בכל באר ל-150 µL ומפחית את הריכוז הסופי של OP 50 מ-6 mg/mL ל-5 mg/mL. אטמו את הפלטה באמצעות סרטי איטום ונערה אותה במשך שתיים עד שלוש דקות במנער פלטות מיקרוטיטראציה. אם OP 50 הוסף בשעה 2:30 ביום מינוס 2, חשוב להוסיף את ה-FUDR לפני הצהריים; החזירו את הפלטות לאינקובטור בטמפרטורה של 20 °C עד השעה 9:00 בבוקר למחרת.מרבית בעלי החיים צריכים להיות בגרים ולהכיל מספר ביצים. יש להוסיף לכל קבוצה את התרופות שאת השפעתן על תוחלת החיים ברצוננו לבחון, בריכוז הרצוי. במקרה של המסת התרופות ב-DMSO, ריכוזי ה-DMSO הסופיים לא יעלו על 0.6%, שכן ריכוזי DMSO הגבוהים מ-0.6% מקצרים את תוחלת החיים של ה-elgan לאחר הוספת התרופה.אטמו את הפלטות באמצעות סרט איטום ונערה אותן במשך שתי עד שלוש דקות במנער פלטות מיקרוטיטר. החזירו את הפלטות לאינקובטור בטמפרטורה של 20 degrees Celsius. הוספת התרופות עלולה לעיתים להוביל למותם של מספר בעלי חיים בכל פלטה, במיוחד אם נעשה שימוש בממס שאינו מים.השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לבדוק אם ישנם בעלי חיים מתים. באופן כללי, מספר בעלי החיים המתים צריך להיות נמוך מ-10 לכל פלטת 96 בארות. החזר את הפלטות לאינקובטור בטמפרטורה של 20 degrees Celsius למשך יומיים כדי לאפשר לחמצן טרי לחדור לתרבית. הסר את האיטום.המתינו דקה אחת ואטמו מחדש את הפלטה. נערו את הפלטה במשך שתיים עד שלוש דקות במנער פלטות מיקרוטיטר (microtighter plate Shaker). חזרו על הפעולה פעם בשבוע ביום החמישי של אורך חיי הבוגרים. הוסיפו 5 µL של תמיסת OP 50 בריכוז 100 mg/mL שהוכנה קודם לכן לכל אחד מ-96 הבארות כדי למנוע הרעבה. תחלמי התולעים נקבעים על סמך תנועתן שלוש פעמים בשבוע, מתחילת הניסוי ועד למותן.השתמשו במיקרוסקופ הפוך עם עדשה אובייקטיבית של 2x או 2.5x כדי לצפות בתולעים בלוחות 96-בארות ביום אפס, בתחילת הניסוי. ספרו את המספר הכולל של התולעים בכל בארה.בארות חיישן המכילות יותר מ-18 בעלי חיים מהניתוח יסומנו, שכן בעלי חיים בבארות אלו לא יספיקו להם OP 50 והם יראו השפעות של הגבלה תזונתית בכל סבב ספירה. רשמו את התאריך ואת מספר בעלי החיים שזזים כבעלי חיים חיים. תנועה בנוזל קלה הרבה יותר מאשר במצע מוצק וניתנת להשראה על ידי תאורה חזקה.שימוש בהגדלה גבוהה יותר עשוי לסייע בזיהוי תנועות עדינות מאוד, כגון אלו בקצה הלוע. תנועות עדינות כאלו הן לעיתים קרובות התנועות היחידות הנצפות בבעלי חיים זקנים מאוד. החזירו את הצלחות לדגירה בטמפרטורה של 20 degrees Celsius.חזרו על סבבי הספירה מדי יומיים עד שלושה ימים עד שכל בעלי החיים מתים. זהו עיצוב של גיליון Excel לרישום נתוני תוחלת חיים עבור כל באר. הקואורדינטה שלו בלוחית, זן, ריכוז התרופה של התרופה, ומספר בעלי החיים הכולל שחיים ביום אפס נרשמים בתחילת הניסוי.יש לתעד את התאריך וכן את מספר בעלי החיים החיים והמתים שלוש פעמים בשבוע, כדי לעקוב אחר ההישרדות של האוכלוסיות השונות בכל באר. איור זה מציג תוצאות של עקומות אורך חיים של sea elegance שתועדו ב-20 °C וב-25 °C. בדיקת אורך החיים מבוססת המיקרוטיטר משחזרת במדויק שינויים באורך החיים התלויים בטמפרטורה.באופן דומה, כפי שמוצג כאן, בדיקת לוח המיקרוטיטר משחזרת שינויים באורך החיים של מוטנטים שדווח כי אורך חייהם שונה מזה של בעלי הטיפוס הפראי N two. איור זה מראה כיצד מינונים עולים של mirtazapine משפיעים על אורך החיים הממוצע של sea elegance. הנתונים שהתקבלו באמצעות בדיקת לוח המיקרוטיטר הם כמותיים מספיק כדי לקבוע קשרי תגובה למינון. לאחר שילטו בטכניקה זו, ניתן להשתמש בה לסריקת ספריות כימיות גדולות של מולקולות המאריכות את אורך החיים של sea elegance.תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במאמר זה אנו מציגים את פרוטוקול כללי למדידת אורך החיים של נמטודות שמרו על התקשורת עם מזון מוצק-UV הרג חיידקים.

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח על מדיה מוצק

סרטון זה מתאר שיטה מסורתית מבוססת לוחות למדידת תוחלת החיים של C. elegans. הפרוטוקול לדוגמה מודד את תוחלת החיים של תולעים שטופלו ב-RNAi.

ניתוח תוחלת חיים: מדידת אריכות ימים של C. elegans

ביצה בתולעת assay (EIW) הוא שיטה יעילה לכמת-הטלת התנהגות. שינויים בנחת ביצה יכולים להיות תגובה התנהגותית של האורגניזם...

מדידת ההשפעות של חיידקים על<em&gt; ג Elegans</em&gt; התנהגות באמצעות Assay שימור ביצה

C. elegans הוא אורגניזם מודל אטרקטיבי לחקר מסלולי העברת אותות המעורבים בעמידות לעקה חמצונית. כאן אנו מספקים פרוטוקול למדידת עמידות לעקה חמצונית של בעלי חיים C. elegans בשלב נוזלי, באמצעות מספר חומרים מחמצנים ב-96 לוחות בארות.

מדידת התנגדות סטרס חמצוני של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; בצלחות microtiter 96-היטב

פרוטוקול בסיסי כדי להעריך את הרעילות של כימיקלים חיית מודל, Caenorhabditis elegans, מתואר. השיטה זו נוח ושימושי עבור הפיתוח של תרופות כמו גם באשר הערכת הסיכונים של מזהמים סביבתיים שונים.

מדידת אפקט של כימיקלים על גדילה, רבייה של Caenorhabditis elegans

כאן נתאר פרוטוקול פשוט להפקת במהירות מאות צמיחה נמטודות מדיה אגר, 96-ובכן תרבות צלחות עם מספרים עקביים של Caenorhhabditis elegans לכל טוב. תרבויות אלה שימושיים להקרנה פנוטיפי של אורגניזם שלם. אנו מתמקדים כאן באמצעות תרבויות אלה לכימיקלים מסך עבור אפקטים פרו-אריכות ימים.

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

כאן נתאר שיטת עותקים משוכפלים, גישה באופן כמותי מודדים C. elegans תוחלת החיים/הישרדות, healthspan באופן תפוקה גבוהה וחזק, ובכך לאפשר הקרנה של מצבים רבים מבלי להתפשר על איכות הנתונים. פרוטוקול זה מפרט את האסטרטגיה, ומספק כלי תוכנה לניתוח של נתונים המשוכפלים.

השיטה קבע עותק משוכפל: בגישה תפוקה גבוהה באופן כמותי מידה Caenorhabditis elegans תוחלת החיים

הפרוטוקול הבא מתאר את הפיתוח והאופטימיזציה של זרימת עבודה בתפוקה גבוהה עבור גידול תולעים, הדמיה פלואורסצנטית ועיבוד תמונה אוטומטי כדי לכמת אגרגטים של פוליגלוטמין כהערכה של שינויים בפרוטאוסטזיס.

אוטומציה של כימות מצטבר ב - Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans משמשים כמערכת מודל מצוינת עם שיטות חזקות ובעלות נמוכה לסקר את תוחלת החיים, תוחלת החיים והחוסן ללחץ.

סקר שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב - Caenorhabditis elegans

כאן, אנו מציגים שיטה כללית לקביעת הכדאיות העוברית והמספר הכולל של עוברים המיוצרים (brood) באמצעות אורגניזם המודל C. elegans.

מדידת כדאיות עוברית וגודל הברוד ב- Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מתאר בדיקה לכימות קצב ההזנה של Caenorhabditis elegans בהתבסס על מדידת פינוי החיידקים בתרבית נוזלית.

כימות צריכת המזון ב- Caenorhabditis elegans על ידי מדידת פינוי חיידקים

למדו מדידת אורך חיים ב־Caenorhabditis elegans באמצעות צלחות 96 בארבעה. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר של תרכובות המאריכות חיים ביצורים מודל לחקר הזדקנות.

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב

גלה סרטונים נוספים