מערכת סגורה Cell תרבות פרוטוקול באמצעות כלי HYPERStack עם טכנולוגיה חומר חדיר גז

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים את השימוש הנכון במערכת סגורה של כלי ה-Corning Hypers stack. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הזרקה ומילוי של הכלי במדיום בשיטת הזנה בכבידה. לאחר מכן, תרחיף התאים מבודל בכל אחת מהשכבות והתאים עוברים אינקובציה.

לאחר הדגירה, מסירים את המצע המשומש. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא קצירת התאים מכלי ה-hypers stack. לבסוף, מתקבלים תוצאות של דיפוזיית גזים המראות את יכולתם של התאים לגשת לחמצן במהלך הגדילה עד להגעה לfluence כאשר נעשה שימוש במערכת הסגורה של ה-hypers stack.

היתרון המרכזי של כלי ה-hypers stack עם חומר חדיר לגז הוא שהוא מספק שטח פנים מוגדל לצמיחת תאים. על ידי ביטול המרווח העליון (head space) בכלי, עמיתי p pardo ידגים כעת פרוטוקול למערכת סגורה לשימוש בכלי ה-hypers stack. כלי ה-hypers stack מורכב מ-stat, שהוא תא תרבית התאים הבודד המורכב מהלוח העליון ומסרט חדיר לגז.

התאים גודלים בתוך תא זה. המניפולטור הנוזלי מחבר כל אחת משכבות ה-ette יחד בתוך מודול. המודולים מחוברים באמצעות צינוריות כדי ליצור כלים בכפולות של 12 שכבות.

הסוללה מאפשרת למשתמש לבצע מניפולציה אחת של נוזלים לכל הכלי. סוללת האוויר מחברת גם את שכבות ה-stat זו לזו, אך היא משמשת לדחיקת אוויר מהכלי כאשר מתבצעות הוספות של נוזלים ומכילה קו מילוי לשימוש בזמן המילוי בין השכבות. שכבת stat היא חלל אוויר פתוח הנקרא החלל הטרכאלי (tracheal space), המאפשר חילופי גזים להתרחש דרך הקרום חדיר-הגז של כל שכבה.

צינור העברת הנוזלים מחובר למסד הנוזלים והוא מרכיב הניתן להתאמה המשמש לביצוע כל מניפולציות הנוזלים במערכת סגורה לצורך שחרור עודפי אוויר תוך שמירה על סטריליות. נעשה שימוש בצינור האוורור. צינור האוורור מחובר למסד האוויר ומכיל מסנן אוויר.

לצינורות הטיפול בנוזלים מחוברים צינור רדיפה ומסנן, המשמשים לפינוי הנוזלים מצינורות הטיפול בנוזלים לאחר מילוי הכלי. בפרוטוקול זה נעשה שימוש גם במניפולטור Corning Stack או CSM, שהוא מכשיר טיפול המסייע במיקום הכליים במיקומים הנכונים במהלך השימוש. בהדגמה זו, מוצגת תרבית תאים במערכת סגורה עבור כלי בעל 36 שכבות חדיר לגז.

עם זאת, בשימוש ב-CSM, ניתן למצוא פרטים לביצוע הליך זה בכלי בעל 12 שכבות באמצעות טריס מילוי (filling wedge) בפרוטוקול הכתוב המצורף. התחל בהכנת 3.9 ליטר של מצע בשקיות לפניe חידוע שפופרת המצע. חבר את שקית הסרום לשקית המצע וערבב היטב עד להשגת ריכוז הסרום הרצוי.

סגרו באמצעות תסמיכי שקיות גדולים כמות של כ-300 מיליליטר של מצע בשקית. פעולה זו תבטיח שכל התאים המוחדרים ינוצלו במהלך המילוי, ושלא יישארו תאים בשקית המצע. הניחו את המצע על מעמד לשקיות לצורך חדירת התאים למצע.

מלאו מזרק המחובר לצינור בתרחיף תאים. חברו את המזרק המכיל את תרחיף התאים לשקית המצע באמצעות הלחמה של הצינורות (tube welding). השתמשו בצינור באורך 3 מעל 16 אינץ' מהמזרק לשקית.

הזריקו את תרחיף התאים לתוך שק המצע וערבבו היטב. ניתן לחבר את שק המצע המוחדר לצינור טיפול בנוזלים של הכלי בקוטר של שלוש שמיניות מהאינץ' באמצעות ריתוך צינורות או באמצעות מחברים רב-תכליתיים. היום נשתמש בריתוך צינורות.

סגרו את התסמיכים על צינורות הטיפול בנוזלים וצינורות השטיפה (chase tubes) של הכלי. מקמו את הכלי בעל 36 השכבות בתוך ה-CSM במיקום הטעינה. חברו את צינור מסנן האוורור לתסמיך ההחזקה ב-CSM.

הדק את המכסה והעבר את ה-CSM למצב מילוי כדי למקם את מסנן האוויר בנקודה הגבוהה ביותר, למניעת רטיבה במהלך פעולת המילוי. זווית של 10 מעלות מאפשרת גם התאזנות של הנוזל לשכבות במהלך המילוי תוך פינוי אוויר מקו המילוי. מקם את שק המדিয়াম באותו גובה של הכלי תוך שמירה על תסבוב צינור המעבר (chase tube) סגור.

פתחו את תסביב צינור הטיפול בנוזלים ואת תסביב שקי המצע כדי לאפשר לנוזל להיכנס לכלי. בעזרת מעמד השקיות, הרימו את שק המצע כדי לסייע לזרימת תרחיף התאים אל תוך הכלי. מלאו את הכלי עד שכל המצע המוחדר ייכנס אליו.

החלק העליון של שק המצע צריך להכיל עדיין 300 milliliters של מצע. הסר את התפסן משק המצע כדי להמשיך למלא את הכלי כאשר הנוזל מתקרב לסנפיר האוויר העליון. האט את קצב המילוי על ידי הורדת שק המצע כדי למנוע מילוי יתר.

העלה באיטיות את מפלס הנוזל עד לקו המילוי וסגור את צינורות הטיפול בנוזלים. העבר את המכל ב-CSM לעמדת הבידוד, כאשר שתי מערכות הסניפטרים נמצאות בעמדה הגבוהה ביותר. הורד את שק המצע לגובה נמוך מזה של המכל.

כאשר פילטר השטיפה (chase filter) מוחזק במצב אנכי, פתחו את תפסית צינור השטיפה. פעולה זו תרוקן או תשטוף את המדיום שבצינור העברת הנוזלים חזרה אל שק המדיום. לאחר שהצינור התרוקן, סגרו את התפסית על צינור שק המדיום.

שמרו על מסנן צינור המעקב (chase tube filter) במצב אנכי. פתחו את התסמין בצינור העברת הנוזלים של הכלי כדי לאפשר לכל הנוזל שנותר להיכנס ולהגיע לשיווי משקל בתוך הכלי. המתינו דקה אחת עד שתיים עד לסיום התהליך.

בשלב הבא, סובב את המכל ב-CSM כך שהמניפולטורים יהיו מצד שמאל. הורד את המכל לעמדת הטעינה ב-CSM. סגור את התפסנים הן בצינור המעקב והן בצינור טיפול בנוזלים.

ניתן כעת להסיר את שק המצע מהכלי, או להשאירו מחובר לשימוש מאוחר יותר בהליך הקציר. כדי לאחסן את שק המצע המחובר, גלגלו את השק והניחו אותו תחת רצועות הקיבוע במגש האחסון של הכלי. לבסוף, העבירו את הכלי לאינקובטור. בעת נשיאת הכלי, היזהרו למנוע חדירה של נוזלים למסנן פתח האוורור.

פעולה זו מתבצעת על ידי הטיית קצה המניפולד מעט כלפי מעלה. כדי להתחיל את פרוצדורת הקצירה, רתכו את צינור תמיסת הדיסוציאציה של התאים ואת שקי צינון אתר התגובה (quench bags) יחד כדי ליצור את מכלול שקי הקצירה, וודאו שכל תפסני הצינורות סגורים. הוציאו את הכלי מהאינקובטור והניחו אותו ב-CSM במיקום הטעינה.

שחררו את שק המצע ממתחת לרצועות הקיבוע ותלו אותו על התושבת. עמדו לצדו, והדקו את המכסה כדי לאבטח את הכלי. חברו את צינור האוורור לתפסן ההחזקה והעבירו את ה-CSM למצב מילוי.

ודאו ששק המצע על מעמד השקים תלוי נמוך יותר מהכלי. פתחו את התפס על צינור שק המצע ואת צינור הטיפול בנוזלים של הכלי כדי לאפשר למצע לזרום אל השק המחובר. ברגע שהכלי ריק בערך בשלושת רבעיו, שנו את הגדרות ה-CSM למצב הריק סופי.

כאשר הכלי וצינורות העברת הנוזלים ריקים, הרימו את הצינורות כדי לדחוף את המצע אל מעבר לתסבוב שעל צינור שקית המצע המשומש. לאחר מכן, סגרו הן את התסבוב שעל צינור העברת הנוזלים והן את התסבוב שעל צינור שקית המצע המשומש. החליפו את שקית המצע המשומש במכלול שקית האיסוף באמצעות ריתוך צינורות.

העלה את גובה מכלול שקית פירוק התאים מעל גובה הכלי באמצעות מעמד השקית. מקם את ה-CSM בעמדת המילוי. פתח את תפס תובוס תמיסת פירוק התאים ואת התפס של מכלול שקית האיסוף, והעבר את התמיסה אל הכלי.

עם השלמת ההעברה, סגרו את התפסנים על צינורות הטיפול בנוזלים ועל צינור תמיסת הפירוק של התאים. לאחר מכן, העבירו את ה-CSM למצב הטעינה תוך כדי החזקת ידית המיקום האופקית במצב פתוח. נערו בעדינות את כלי הדגימה מצד לצד באמצעות הגלגל, כדי להפיץ את התמיסה על שכבות התאים.

ניתן להחזיר מדי פעם את הכלי לעמדת המילוי במהלך הטלטול כדי לשמור על פיזור שווה של התמיסה. לאחר שהתמיסה פוזרה כראוי, שחררו את המנוף ב-CSM כדי לנעול אותו בעמדת המילוי. השאירו את הכלי בעמדה זו במהלך זמן הדיסוציאציה הנדרש עבור התאים.

השתמש בעכירות כמדד לקביעת ניתוק התאים. לאחר הניתוק, העבר את ה-CSM למצב טעינה. פתח את תפס שקית הכיבוי ואת תפס צינור הטיפול בנוזלים כדי לאפשר למצע הכיבוי להיכנס לכלי.

סגרו את התפס על צינורות העברת הנוזלים. לאחר השלמת ההעברה, החזירו את ה-CSM למצב הטעינה והחזיקו את ידית המיקום האופקית כדי לנדנד את המכל מצד לצד. בעזרת מעמד השקיות, הנמיכו את מיקום מכלב האיסוף אל מתחת למפלס המכל.

כוון את ה-CSM למצב ריק. פתח את תסביך התקיעות (Clamp) של צינור טיפול בנוזלים של המכל והעבר את תמיסת התאים בחזרה לשק ההקפאה (quench bag). החזר את ה-CSM למצב טעינה ונתק את תסביך שק האיסוף מהמכל באמצעות מכשיר לאיטום צינורות.

כעת תמיסת התאים מוכנה לעיבוד במערכות גידול תאים מסורתיות. בשיטת ה-Headspace, החמצן במצע מרוקן בשיעור ממוצע של 50% במהלך שלושה ימים. בתרבית, נתון זה מראה את הירידה במיליגרמים לליטר של חמצן ברמת התאים לאורך זמן באותה מערכת גידול; מפל החמצן לאורך גובה מצע של שלושה מילימטרים גבוה בכמעט 50% בחיבור שבין המצע ל-Headspace מאשר בשכבת התאים.

מוצג אחוז החמצן בחלל הקנה של מערך ה-hypers במהלך גדילת התאים. האיור מראה כי לאורך 96 שעות, אחוז החמצן בין השכבות המספקות חמצן לכל תחתית של קולט חדיר לגזים נותר קבוע. הדבר מדגים את יכולתם של התאים לגשת לחמצן במהלך הגדילה עד להגעה למצב של התלכדות (confluency).

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכיבו הבנה טובה לגבי אופן המילוי והקציר של כלי ה-Corning Hypers stack במערכת סגורה.