מערכת סגורה Cell תרבות פרוטוקול באמצעות כלי HYPERStack עם טכנולוגיה חומר חדיר גז
November 29th, 2010
מבוא לתוך פרוטוקול הטכנולוגיה, וטיפול של כלי HYPERStack קורנינג ואביזרים המשמשים תרבית תאים תשואה גבוהה חסיד. פרוטוקול יציג כיצד להשתמש בכלי מערכת סגורה לקציר תא הגדלת מעל הנוכחי מוצרים מוערמים צלחת.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את השימוש הנכון במערכת סגורה בכלי הערימה של Corning Hypers. זה מושג על ידי חיסון ומילוי הכלים במדיה בשיטת הזנת הכבידה. לאחר מכן, תרחיף התאים מבודד בכל אחת מהשכבות והתאים מודגרים.
לאחר הדגירה, המדיה המושקעת מוסרת. השלב האחרון של ההליך הוא קצירת התאים מכלי הערימה של ההיפר. בסופו של דבר, תוצאות דיפוזיה של גזים מתקבלות כדי להראות את יכולתם של תאים לגשת לחמצן במהלך הגדילה לשטף משותף כאשר נעשה שימוש במערכת הסגורה של היפר מחסנית.
היתרון העיקרי של כלי ערימה היפרס עם חומר חדיר לגז הוא בכך שהוא מספק שטח פנים מוגבר לצמיחת תאים. על ידי ביטול מרווח הראש בכלי, עמיתי p pardo ידגים כעת פרוטוקול מערכת סגור לשימוש בכלי הערימה של Hypers. כלי הערימה של היפרס מורכב מסטאט, שהוא תא תרבית התאים הבודד המורכב מהצלחת העליונה ומסרט חדיר לגז.
התאים מתורבתים בתוך תא זה. סעפת הנוזל מחברת כל אחת משכבות ה-ette יחד בתוך מודול. מודולים מחוברים עם צינורות ליצירת כלים בכפולות של 12 שכבות.
הסעפת מאפשרת למשתמש לבצע מניפולציה נוזלית אחת לכל הכלי. סעפת האוויר גם מחברת את שכבות הסטטיסטיקה יחד, אך משמשת להוצאת אוויר מהכלי כאשר מתרחשות תוספות נוזלים ומכילה קו מילוי לשימוש במהלך המילוי בין כל אחת מהן. שכבת סטאט היא חלל באוויר הפתוח הנקרא חלל קנה הנשימה, המאפשר חילופי גזים להתרחש דרך הסרט החדיר לגז של כל שכבה.
צינור הטיפול בנוזלים מחובר לסעפת הנוזל והוא רכיב הניתן להתאמה אישית המשמש לביצוע כל מניפולציות נוזל המערכת הסגורה לשחרור עודפי אוויר תוך שמירה על סטריליות. נעשה שימוש בצינורות האוורור. צינור האוורור מחובר לסעפת האוויר ומכיל מסנן אוויר.
לצינור הטיפול בנוזלים מחוברים צינורות המרדף והמסנן, המשמשים לפינוי הנוזל מצינור הטיפול בנוזלים לאחר מילוי הכלי. כמו כן משמש בפרוטוקול זה מניפולטור Corning Stack או CSM, שהוא מכשיר טיפול המסייע בהצבת הכלים במיקומים הנכונים במהלך השימוש. בהדגמה זו, תרבית תאים במערכת סגורה מודגמת עבור כלי חדיר גז בן 36 שכבות.
עם זאת, באמצעות CSM, ניתן למצוא פרטים לביצוע הליך זה על כלי בן 12 שכבות באמצעות טריז מילוי בפרוטוקול הכתוב הנלווה. התחל בהכנת 3.9 ליטר מדיה בשקיות לפני חיסון שפופרת המדיה. יש להרטיב את שקית הסרום לשקית המדיה ולערבב היטב כדי להגיע לריכוז הסרום הרצוי.
מהדקים כ-300 מיליליטר מדיה בשקית באמצעות מהדקי שקיות גדולים. זה יבטיח שימוש בכל התאים המחוסנים במהלך המילוי, ואף אחד מהם לא נשאר בשקית המדיה. הנח את המדיה על מעמד שקיות כדי לחסן את המדיה.
מלאו מזרק המחובר לצינור עם מתלה תאים. חבר את המזרק המכיל מתלה תאים לשקית המדיה באמצעות ריתוך צינור. שלושה צינורות מעל 16 אינץ' מהמזרק לשקית.
הזרקו את תרחיף התא לשקית המדיה וערבבו היטב. ניתן לחבר את שקית המדיה המחוסנת לצינורות הטיפול בנוזלים של הספינה בשלושה מעל שמונה אינץ' על ידי ריתוך צינורות או באמצעות מחברים רב תכליתיים. היום נשתמש בריתוך צינורות.
סגור את המהדקים על צינורות הטיפול בנוזלים והמרדף של הכלי. הנח את הכלי בן 36 השכבות לתוך CSM במצב העומס. חבר את צינור מסנן האוורור לתוך האחיזה clamp על ה-CSM.
הדק את המכסה והעבר את ה-CSM למצב המילוי כדי למקם את מסנן האוויר במיקום הגבוה ביותר כדי למנוע הרטבה במהלך פעולת המילוי. הזווית של 10 מעלות מאפשרת גם שיווי משקל של הנוזל לשכבות במהלך מילוי אוויר צלול מקו המילוי. על ידי מיקום שקית המדיה באותה רמה כמו הכלי, תוך שמירה על מהדק צינור המרדף סגור.
פתח את צינור הטיפול בנוזל clamp ואת שקית המדיה clamp כדי לאפשר לנוזל להיכנס לכלי. בעזרת מעמד התיק, הרם את שקית המדיה כדי לעזור לתרחיף התאים לזרום לתוך הכלי. מלאו את הכלי עד שכל המדיה המחוסנת נכנסת לכלי.
החלק העליון של שקית המדיה עדיין צריך להכיל 300 מיליליטר של מדיה. הסר את clamp משקית המדיה כדי להמשיך למלא את הכלי כאשר הנוזל מתקרב לסעפת האוויר העליונה. האטו את קצב המילוי על ידי הנמכת שקית המדיה כדי למנוע מילוי יתר.
הביאו לאט את מפלס הנוזל לקו המילוי וגושו את צינור הטיפול בנוזל. הביאו את הכלי ב-CSM למצב הבידוד והניחו את שתי קבוצות הסעפות במיקום הגבוה ביותר. הורד את שקית המדיה מתחת לגובה הכלי.
כשמסנן המרדף מוחזק במצב זקוף, פתח את מהדק צינור המרדף. פעולה זו תרוקן או תרדוף את המדיה בצינור הטיפול בנוזלים בחזרה לתוך שקית המדיה. לאחר שהצינור ריק, סגור את המהדק על צינור שקית המדיה.
שמירה על מסנן צינור המרדף במצב זקוף. פתח את המהדק על צינור הטיפול בנוזלים של הכלי כדי לאפשר לכל נוזל שנותר להיכנס ולהתאזן בכלי. המתן דקה עד שתיים עד שזה יקרה.
לאחר מכן, סובב את הכלי ב- CSM כך שהסעפות יהיו בצד שמאל. הורד את הכלי למצב העומס ב- CSM. סגור את המהדקים הן על המרדף והן על צינורות הטיפול בנוזלים.
כעת ניתן להוציא את שקית המדיה מהכלי, או שהיא עשויה להישאר מחוברת לשימוש מאוחר יותר בהליך הקציר. כדי לאחסן את שקית המדיה המצורפת, גלגל את שקית המדיה והנח אותה מתחת לרצועות השמירה במגש האחסון של הכלי. לבסוף, העבר את הכלי לחממה בעת נשיאת הכלי, הקפד למנוע כניסת נוזל למסנן האוורור.
זה מושג על ידי הטיית קצה הסעפת מעט כלפי מעלה. כדי להתחיל את צינור הליך הקציר, יש לרתך את תמיסת האסוציאציה של התאים ולהרוות שקיות יחד כדי ליצור את מכלול שקיות הקציר, ודא שכל מהדקי הצינורות סגורים. הסר את הכלי מהחממה והנח אותו ב- CSM במצב העומס.
שחרר את שקית המדיה מתחת לרצועות השמירה ותלה אותה על השקית. עמדו לאחר מכן, הדקו את המכסה כדי לאבטח את הכלי. חבר את צינור האוורור לתוך האחיזה clamp והעבר את CSM למצב המילוי.
ודא ששקית המדיה על מעמד התיק תלויה נמוך יותר מהכלי. פתח את clamp על צינור שקית המדיה ועל צינור הטיפול בנוזל של הכלי כדי לאפשר למדיה לזרום לתוך השקית המצורפת. לאחר שהכלי ריק כשלושה רבעים, שנה את הגדרות CSM למצב הריק הסופי.
כאשר הכלי וצינור הטיפול בנוזלים ריקים, הרם את הצינור כדי לרדוף אחרי המדיה מעבר למהדק על צינור שקית המדיה המשומש. לאחר מכן סגור גם את המהדק על צינור הטיפול בנוזל וגם את המהדק על צינורות שקית המדיה המושקעת. החלף את שקית המדיה שהוצאה במכלול שקית הקטיף על ידי ריתוך צינורות.
הרם את גובה מכלול שקיות ניתוק התאים מעל גובה הכלי באמצעות מעמד התיק. מקם את CSM במצב מילוי. פתח את מהדק צינור תמיסת דיסוציאציה של התאים ואת מהדק מכלול שקית הקציר והעביר את התמיסה לכלי.
לאחר השלמת ההעברה, סגור את המהדקים על צינור הטיפול בנוזלים ועל צינורות תמיסת הדיסוציאציה של התאים. לאחר מכן, הביאו את ה-CSM למצב העומס תוך החזקת ידית המיקום האופקית פתוחה. נדנד בעדינות את הכלי מצד לצד באמצעות הגלגל, והחלק את התמיסה על שכבות התאים.
ניתן להחזיר את הכלי מדי פעם למצב מילוי במהלך הנדנוד כדי לשמור על פיזור שווה של התמיסה. לאחר שהפתרון הופץ כראוי, שחרר את הידית על CSM כדי לנעול את מצב המילוי. השאירו את הכלי במצב זה בזמן הדיסוציאציה הנדרש לתאים.
השתמש בעכירות כמדריך לקביעת ניתוק תאים. לאחר הניתוק, העבר את ה-CSM למצב העומס. פתח את שקית המרווה clamp ואת צינור הטיפול בנוזל clamp כדי לאפשר לאמצעי המרווה להיכנס לכלי.
סגור את המהדק על צינור הטיפול בנוזלים. לאחר השלמת ההעברה, החזר את ה-CSM למצב העומס והחזק את ידית המיקום האופקית כדי לנענע את הכלי מצד לצד. בעזרת מעמד השקיות, הורד את המיקום של מכלול שקיות הקציר מתחת למפלס הכלי.
כוונן את CSM למצב הריק. פתח את צינור הטיפול בנוזל הכלי Clamp והעביר את תמיסת התא בחזרה לשקית המרווה. החזר את ה-CSM למצב העומס ונתק את מכלול שקית הקציר מהכלי באמצעות אוטם צינורות.
כעת פתרון התאים מוכן לעיבוד במערכות גידול תאים מסורתיות. עם Headspace, החמצן במדיה מתרוקן בממוצע של 50% במשך שלושה ימים. בתרבית, איור זה מראה את הירידה במיליגרם לליטר חמצן ברמת התאים לאורך זמן באותה מערכת גידול, שיפוע החמצן דרך גובה מדיה של שלושה מילימטרים גדול כמעט ב-50% בצומת המדיה ל-Headspace מאשר בשכבת התא.
מוצג אחוז החמצן בחלל קנה הנשימה של ערימת ההיפר במהלך צמיחת התאים. האיור מראה כי במשך 96 שעות, אחוז החמצן בין השכבות המספק כל תחתית סרט חדיר גז נשאר קבוע. זה מדגים את יכולתם של התאים לגשת לחמצן במהלך הגדילה לשטף משותף.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למלא ולקצור את כלי הערימה של Corning Hypers במערכת הסגורה.
סקירה
מאמר זה מציג את כלי ה-Corning HYPERStack ואת האביזרים שלהם, המיועדים לתרבית תאים דביקים בתפוקה גבוהה. הפרוטוקול מדגים את השימוש במערכת סגורה של כלים אלו כדי לשפר את יעילות קטיף התאים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- טכנולוגיית תרבית תאים
- קטיף תאים דביקים
- פרוטוקולי מערכת סגורה
רקע
- כלי ה-Corning HYPERStack מספקים שטח מוגדל לגידול תאים.
- חומרים חדירים לגז מאפשרים חילוף גזים יעיל במהלך תרבית התאים.
- עיצוב המערכת הסגורה ממזער את הסיכונים לזיהום.
- שימוש במניפולטור נוזלי מפשט מניפולציות נוזלים.
מטרת המחקר
- להדגים את השימוש הנכון בכלי ה-Corning HYPERStack.
- להראות כיצד לחסן ולמלא את הכלים בצורה יעילה.
- לתאר את השלבים לקטיף תאים מהכלים.
שיטות ששימשו
- חסינת מדיה עם השעיית תאים.
- שיטת האכלה בכבידה למילוי כלים.
- שימוש במניפולטור Corning Stack לטיפול בכלים.
- ריתוך צינורות לחיבור מדיה וצינורות טיפול.
תוצאות עיקריות
- מילוי וחסינת הכלים HYPERStack בהצלחה.
- חילוף גזים יעיל שנצפה במהלך גידול התאים.
- קטיף תאים משופר שהוכח דרך המערכת הסגורה.
- הפרוטוקול מאפשר מניפולציה קלה ושמירה על סטריליות.
מסקנות
- כלי ה-Corning HYPERStack יעילים לתרבית תאים בתפוקה גבוהה.
- פרוטוקולי מערכת סגורה משפרים משמעותית את יעילות קטיף התאים.
- חומרים חדירים לגז יתרונם לגידול תאים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Closed system adherent cell culture using gas permeable vessels addresses scalability challenges in biologics manufacturing by increasing yield per footprint while maintaining sterility. This approach supports process intensification for cell therapy and vaccine production where closed systems are critical for regulatory compliance. The technology enables higher cell densities without expanding facility footprint, improving capital efficiency in upstream bioprocessing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables scalable adherent cell expansion for target validation assays requiring high cell numbers.
- Operational Value: Reduces media and reagent consumption per cell yield through minimized headspace and efficient gas exchange.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides reproducible adherent cell layers for consistent assay readouts in drug screening campaigns.
- Operational Value: Standardizes cell seeding density across layers via liquid manifold distribution, improving assay-to-assay variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports generation of clinical-grade adherent cells for preclinical efficacy and safety testing under closed conditions.
- Operational Value: Facilitates seamless transition from research-scale to GMP-compatible processes using identical vessel architecture.
Pipeline & Workflow Integration
The HYPERStack system integrates into adherent cell production workflows from expansion through harvest, supporting continuous processing in vaccine and therapeutic protein pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing in adherent cell models at scales relevant to target engagement studies.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible cell outputs for assay standardization in hit-to-lead progression.
- Analytics: Supports oxygen and metabolite monitoring via gas permeable film to assess culture health and metabolic activity.
- Translational Research: Maintains phenotypic fidelity during scale-up, critical for translational consistency in cell-based therapies.
- Enterprise Reuse: Modular design allows reuse across multiple cell lines and processes, reducing capital expenditure per campaign.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive culture performance through stable gas exchange and reduced gradient effects compared to traditional stacked plates.
- Operational Value: Closed fluid paths minimize operator intervention, lowering contamination risk and labor intensity.
- Strategic Value: Higher yield per run improves batch consistency and reduces cost of goods in biologics manufacturing.
- Portfolio Impact: Enables risk-advanced allocation of adherent cell resources across multiple projects from a single platform.
Implementation Considerations
- Training in aseptic tubing welding and manifold handling for closed system integrity.
- Integration with standard incubators and biosafety cabinets using Corning Stack Manipulator for vessel positioning.
- Validation of gas diffusion rates to match metabolic demands of specific adherent cell lines.
- Adaptation of harvesting protocols (enzymatic or mechanical) to vessel geometry and layer accessibility.
- Monitoring of liquid handling tubing pressure and flow rates to prevent shear stress during scale-up.
