Name: טוען תסיסנית מסופי עצב עם אינדיקטורים סידן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: למד טכניקה לטעינת אינדיקטורי סידן סינתטיים לתסיסניות עצב ב-Drosophila melanogaster. שיטה זו מאפשרת מדידת שינויים מהירים בסידן וחקר תהליכי העברה עצבית בזבוב הפירות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מנה לנתיחה נקי כי לא נחשף כל fixatives. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח נודד 3 rd instar הזחל תסיסנית בינוני של שניידר תסיסנית המכילה Ca 2 + ו-L-גלוטמין, (לא לחתוך שום עצבים או שרירים סיבי נזק מס &#39;7, 6, 13 או 12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר זכוכית מילוי-פיפטה עם טיפ 12 מיקרון (קוטר פנימי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק צינורות (להפעיל לחץ שלילי פיפטה) להבטיח את קצה פיפטה אינו חסום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פלסטיק דק מילוי-נימה שניתן להוסיף לאורך פיפטה מזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר ~ 1 ס&quot;מ של 5 מ&quot;מ dextran-מצומדות Ca 2 +-אינדיקטור לתוך חוט הפלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את כל העצבים קטע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיכה פיפטה על הרמפה שיאפשר את קצה פיפטה הגישה קו האמצע הגחון של הזחל גזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את הקצוות של עצב קטע מספר 4, בלי לצבוט את העצב, לתוך סוף פיפטה (כולל כמות קטנה של המדיום של שניידר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינורות והכנס את חוט הניילון לתוך פיפטה עד סוף החוט בתוך 50 מיקרון של סוף לחתוך של העצב (אל תיגע עצב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא מספיק Ca 2 +-חיווי על עצב את הסוף כדי להגביר את עוצמת הקול של המדיום של שניידר על ידי כ -33% (הריכוז הסופי צריך להיות &lt;2 מ&quot;מ). חשוב - זה חייב להסתיים תוך 5 דקות של חיתוך העצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכנת בחושך בטמפרטורת החדר בעוד המון עצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 40 דקות להסיר את Ca 2 +-אינדיקטור באמצעות חוט להט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את פיפטה במקום ולמלא אותו לחלוטין עם המדיום שניידר טריים, כמו זה ישמש ליישם פולסים מגרה לעצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר Ca 2 +-אינדיקטור לאזן בתוך העצב במשך לפחות 60 דקות, אך לא יותר מ 4 שעות, לפני תחילת Ca 2 + הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את ההכנה עם מדיום חדש של שניידר כל 30 דקות בזמן שהוא equilibrating. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 דקות לפני הדמיה להחליף בינוני של שניידר עם פתרון No.6 Hemolymph-Like (HL6; מקלאוד et al 2002;. 2003). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> L-חומצה גלוטמית או גלוטמט ניתן להוסיף פתרון HL6 ב 7mm כדי להרדים קולטני גלוטמט postsynaptic למנוע העצבים עורר התכווצות שרירים (מקלאוד et al 2004;. רייף et al 2002;. 2005). </li></ol>

<ol><li>Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+calcium+signals+in+Drosophila+motor+neuron+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals.</a> J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).</li>
<li>Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neuron+activity+in+the+Drosophila+larval+CNS+detected+with+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators.</a> J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).</li>
<li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles%3A+test+for+a+role+in+presynaptic+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation.</a> J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).</li>
<li>Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+active+zone+density+during+long-term+strengthening+of+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).</li>
<li>Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

<table><tbody><tr><td>מצע חרקים של Schneider&amp;rsquo;s (Schneider's Insect Medium)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td>חייב להכיל L-glutamine וסידן</td></tr><tr><td>מלח מונו-נתריום של חומצה L-גלוטמית הידרטית (L-glutamic acid monosodium salt hydrate)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr></tbody></table>

טוען תסיסנית מסופי עצב עם אינדיקטורים סידן

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

סידן משחק תפקידים רבים במערכת העצבים אבל אף מרשים יותר כמו ההדק לשחרור נוירוטרנסמיטר, ואף אחד עמוק יותר כשליח חיוני הפלסטיות הסינפטית התומכת בלמידה ובזיכרון. כדי להמשיך להבהיר את הבסיס המולקולרי של Ca 2 + תלויי מנגנוני הסינפטי, מערכת מודל נדרש כי הוא גם נזיל גנטית נגיש מבחינה פיזיולוגית. תסיסנית melanogaster מספק מודל כזה. במערכת זו, מקודדים גנטית אינדיקטורים פלורסנט זמינים לזהות Ca 2 + שינויים מסופי העצב. עם זאת, אינדיקטורים אלה מוגבל רגישות Ca 2 + ולעתים קרובות להראות תגובה שאינו ליניארי. האינדיקטורים פלורסנט סינתטי מתאימים יותר למדידת Ca מהירה 2 + שינויים הקשורים לפעילות עצבית. כאן אנו להפגין טכניקה לטעינת dextran-מצומדות סינתטי Ca 2 + אינדיקטורים לתוך מסופי העצב לחיות הזחלים תסיסנית. דגש מיוחד מושם על אותם היבטים של פרוטוקול הקריטי ביותר להצלחה של טכניקה, כמו למשל איך להימנע הפרשות חשמל סטטי לאורך עצבים מבודדת, בשמירה על בריאות הכנת בתקופות טעינה ממושכת, והבטחת הישרדות האקסון ידי מתן Ca 2 + כדי לקדם את האיטום של קצות האקסון ניתק. זיקה נמוכה dextran-מצומדות Ca 2 +-אינדיקטורים, כגון fluo-4 ו rhod, זמינים אשר מראים יחס גבוה אות לרעש בזמן מינימלית לשבש presynaptic Ca 2 + דינמיקה. Dextran-נטיה מסייע במניעת Ca 2 + אינדיקטורים להיות מוחרם לתוך אברונים כגון מיטוכונדריה. הטכניקה הטעינה יכול להיות מיושם באופן שווה, הזחלים עוברים ומבוגרים.

סידן הוא שליח בכל מקום במערכת העצבים, חיוני מפעילה שחרור הנוירוטרנסמיטר ושינויים חוזק סינפטי. כאן אנו להפגין טכניקה לטעינת Ca 2 +-אינדיקטורים לתוך מסופי תסיסנית עצב. אנחנו גם מדגימים המצאה של המנגנון הנדרש ולהדגיש נקודות קריטיות להצלחת הטכניקה.

הסידן ממלא תפקידים רבים במערכת העצבים, אך אף אחד מהם אינו מרשים יותר מתפקידו כגורם המפעיל את שחרור המוליכים העצביים, ואף אחד אינו עמוק יותר מ...

שלום, שמי גרג מקלאוד. המעבדה שלי חוקרת את ויסות הסידן בטרמינלי עצב ואת השפעתו על התמסורת העצבית. אנו מבצעים זאת ב-Oph Melanogaster.זבוב הפירות מהווה מודל אטרקטיבי עבור חוקרי מערכת העצבים בשל הגמישות הגנטית שלו ומערכת העצבים הפשוטה והנגישה שלו. במערכת עצבים זו, קיימים אינדיקטורים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית לזיהוי שינויים בריכוז הסידן בקצות העצבים. עם זאת, לאינדיקטורים אלו רגישות מוגבלת לסידן ולעתים קרובות הם מראים תגובה לא ליניארית.אינדיקטורים סינתטיים מתאימים יותר למדידת שינויי סידן מהירים הקשורים לפעילות עצבית. נדגים טכניקה להחדרת אינדיקטורים סינתטיים לסידן המצומדים לדקסטרין אל תוך טרמינלים עצביים חיים ב-oph lava. הצמידה לדקסטרין מסייעת במניעת ספיגה של אינדיקטורי הסידן אל תוך אברונים כגון מיטוכונדריה.ניתן להחיל את טכניקת הטעינה באופן שווה על עוברים של זחלים ועל בוגרים. נבצע דיסקציה לזחל באמבט סיגריה קטנה על גבי למסת זכוכית. שעוות שיניים כחולה תתמוך במיטת טעינה מזכוכית.קחו זחל שלישי נודד מתוך לבה של כוכב מצד של מבחנה שאינה צפופה. העבירו את הזחל למספר טיפות של תמיסת Schneider קרה והקבעו אותו באמצעות סיכות דרך הראש והזנב, כאשר קו האמצע הגבי נמצא למעלה. השתמשו במספרי מיקרו חדים כדי לבצע חתך.בצעו חתך קטן בין הטרכיאה, גדול מספיק כדי לאפשר להב התחתון של המספריים לחדור. גזרו דרך הקוטיקול

loading-drosophila-nerve-terminals-with-calcium-indicators

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו תיאר תכונות מבניות של גליה-neuromuscular הסינפסות הכנה בתוך-out רקמת הרומן של זחלי זבוב חי באמצעות צבעי ניאון עם מיקרוסקופיה confocal. אנחנו שכותרתו מסופי נוירון לחיות עם נוגדנים העיקרי ניאון HRP, וגם דמיינו את החלל perisynaptic עם Dextrans ניאון.

לדמיין את חיים תסיסנית גליה-neuromuscular צומת עם צבעי ניאון

אנו מתארים טכניקה הוקמה כדי למדוד ולנתח ריח עוררו תגובות סידן באונה מחושים...

סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה

סרטון זה מתאר הדמיית סידן in vivo בנוירונים דרוזופילה באמצעות GCaMP. סרטון הפרוטוקול המוצג מראה כיצד לתעד שינויים בפלואורסצנטיות GCaMP מנוירונים בגוף פטריות במהלך ניסוי מיזוג ריח.

דרוזופילה אין ויוו דימות סידן: שיטה לדימות פונקציונלי של פעילות עצבית

סרטון זה מדגים שיטה לזיהוי תגובות נוירונים חושיים בדרוזופילה באמצעות קשירת ליגנדים והדמיה פלואורסצנטית. ליגנדות נקשרות לקולטני נוירונים, וגורמות לזרם סידן. הסידן נקשר למתחמי אינדיקטור, מה שמוביל לפליטת פלואורסצנטיות, המאשרת את התגובה העצבית לליגנד.

זיהוי תגובות פיזיולוגיות מתאי עצב חושיים בדרוזופילה

בסרטון זה, סיבי עצב של זחלי דרוזופילה שקועים בצבע FM, אשר נקשר לשומנים בקרום התא. מיקרואלקטרודת יניקה ופולסים חשמליים מעוררים את תהליך האנדוציטוזה, ומשלבים את צבע FM בשלפוחיות אנדוציטיות שזה עתה נוצרו. שיטה זו, אשר מדמיינת שלבים presynaptic של neurotransmission, שימושי לחקר תפקוד סינפטי ושחרור נוירוטרנסמיטר.

העמסה ופריקה של צבע FM בתיווך מיקרואלקטרודה בתאי עצב של זחלי דרוזופילה

סרטון זה מדגים פרוטוקול לחקר מחזור שלפוחית סינפטית בצמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה המבטאים צ'נלרודופסין באמצעות צבע פלואורסצנטי. אור כחול מפעיל את הצ'אנלרודופסינים, גורם לזרימת סידן ולאקסוציטוזה של שלפוחית סינפטית. הצבע משתלב בקרומים העצביים ומופנם במהלך אנדוציטוזה, וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות מוגברת. גירוי נוסף של אור כחול גורם לאקסוציטוזה ולשחרור צבע, אשר מוצג על ידי פלואורסצנטיות מופחתת.

ניתוח מחזור שלפוחית סינפטית וקליטת צבע פלואורסצנטי בזחלי דרוזופילה

סרטון זה מדגים שיטה להדמיית סידן in vivo באמצעות חיישני סידן סינפטיים מקומיים בזבובים. הוא מתאר את השלבים להכנת הזבובים למיקרוסקופיה, ביצוע מיזוג חוש הריח, והדמיית זרימת סידן הנגרמת על ידי ריח.

ב Vivo הדמיית סידן באמצעות חיישני סידן סינפטיים מקומיים בדרוזופילה מלנוגסטר

מקור: Ishimoto, H. et. al., הדמיית סידן ex vivo להמחשת תגובות המוח לאיתות אנדוקריני בדרוזופילה. J. Vis. exp. (2018)}{{}}} {{}}} סרטון זה מדגים הדמיית סידן למחקרDrosophila תגובות מוח לנוירופפטידים. נוירונים המבטאים אינדיקטור סידן פלואורסצנטי חושפים דינמיקת סידן תוך תאית ותגובות תפקודיות למולקולות איתות.

הדמיית סידן ex vivo לחקר תגובות המוח של דרוזופילה לנוירופפטידים

הרגליים הקדמיות והפרובוסקיס של דרוזופילה מכילים רפרטואר עשיר של נוירונים חושיים טעמיים. כאן, אנו מציגים שיטה המשתמשת בהדמיית סידן כדי למדוד תגובות פיזיולוגיות מנוירונים חושיים ברגל הקדמית וחוטם של זבובים חיים ביישום אקסוגני של פרומון טעם.

מדידת תגובות פיזיולוגיות של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עצב סנסורי כדי ליפידים פרומונים שימוש סידן הדמיה חיה

כאן, אנו מתארים שיטה לטעינת צבע סידן רגיש דרך גדם העצב הצפרדע לתוך קצות העצבים. כמו כן, אנו מציגים פרוטוקול להקלטת וניתוח של טרמינטים סידן מהיר בקצות העצבים ההיקפיים.

טעינת צבע סידן לתוך צפרדע עצב צפרדע דרך גדם עצב: סידן חולף הרשמה צפרדע Neuromuscular צפרדע

פרוטוקול זה מעריך פעילות סינפטית פונקציונלית בין שותפים נוירונליים מוגדרים במערכת העצבים המרכזית של זחלי דרוזופילה מלנגסטר באמצעות כלים מקודדים גנטית. גירוי אופטוגנטי בתיווך CsChrimson של נוירונים סנסוריים פרה-סינפטיים cIVda מעורר פוטוקונברנסציה תלויה בסידן של CaMPARI באינטרנוירונים פוסט-סינפטיים של Basin-4.

אפיון פונקציונלי של שותפים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים במערכת העצבים המרכזית של זחל הדרוזופילה באמצעות CaMPARI

למד טכניקה לטעינת אינדיקטורי סידן סינתטיים לתסיסניות עצב ב-Drosophila melanogaster. שיטה זו מאפשרת מדידת שינויים מהירים בסידן וחקר תהליכי העברה עצבית בזבוב הפירות.

טוען תסיסנית מסופי עצב עם אינדיקטורים סידן

גלה סרטונים נוספים