טוען תסיסנית מסופי עצב עם אינדיקטורים סידן

שלום, שמי גרג מקלאוד. המעבדה שלי חוקרת את ויסות הסידן בטרמינלי עצב ואת השפעתו על התמסורת העצבית. אנו מבצעים זאת ב-Oph Melanogaster.

זבוב הפירות מהווה מודל אטרקטיבי עבור חוקרי מערכת העצבים בשל הגמישות הגנטית שלו ומערכת העצבים הפשוטה והנגישה שלו. במערכת עצבים זו, קיימים אינדיקטורים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית לזיהוי שינויים בריכוז הסידן בקצות העצבים. עם זאת, לאינדיקטורים אלו רגישות מוגבלת לסידן ולעתים קרובות הם מראים תגובה לא ליניארית.

אינדיקטורים סינתטיים מתאימים יותר למדידת שינויי סידן מהירים הקשורים לפעילות עצבית. נדגים טכניקה להחדרת אינדיקטורים סינתטיים לסידן המצומדים לדקסטרין אל תוך טרמינלים עצביים חיים ב-oph lava. הצמידה לדקסטרין מסייעת במניעת ספיגה של אינדיקטורי הסידן אל תוך אברונים כגון מיטוכונדריה.

ניתן להחיל את טכניקת הטעינה באופן שווה על עוברים של זחלים ועל בוגרים. נבצע דיסקציה לזחל באמבט סיגריה קטנה על גבי למסת זכוכית. שעוות שיניים כחולה תתמוך במיטת טעינה מזכוכית.

קחו זחל שלישי נודד מתוך לבה של כוכב מצד של מבחנה שאינה צפופה. העבירו את הזחל למספר טיפות של תמיסת Schneider קרה והקבעו אותו באמצעות סיכות דרך הראש והזנב, כאשר קו האמצע הגבי נמצא למעלה. השתמשו במספרי מיקרו חדים כדי לבצע חתך.

בצעו חתך קטן בין הטרכיאה, גדול מספיק כדי לאפשר להב התחתון של המספריים לחדור. גזרו דרך הקוטיקולה לאורך קו האמצע הגבי בין הטרכיאות עד לראש. סובבו את הזחול ב-180 מעלות והרחיבו את החתך עד לזנב.

חשוב להקפיד שהלהב התחתון לא יחדור עמוק מדי אל תוך האיברים הפנימיים, אלא רק אל הלרבה, שכן הדבר יגרום לנזק לשרירים ולעצבים שברצוננו לבחון. מרבית האיברים הפנימיים יידחפו כלפי מעלה דרך החתך; גזרו את הנתיב כאן קרוב לזנב, נתיב אחד כאן, וגזרו דרך הקנה שמתחת לכל אורכו עד לראש. חזרו על הפעולה בצד השני.

הסיר את רוב האיברים הפנימיים על ידי חיתוך והוצאה מהאמבטיה. הפסק לרגע את השימוש במספריים והשתמש בזוג פינצטות שני. תפוס את הקצה החתוך של העטיפה (cuticle) והצמד אותו לצד אחד.

חזור על הפעולה בצד השני. התקדם ארבעה פלחים לכיוון הראש כדי לחזור על הפרוצדורה. נקה שאריות של איברים פנימיים בשלב זה. ודא שלא נגרם נזק לשרירים 7, 6, 13 או 12 באף אחד מהפלחים.

אם חלקם ניזוק, נתח לבה אחר, שכן נזק זה מוביל ללא היסס להתכווצויות גניות שיהפכו כל דימוי עוקב לבעייתי. המיספרות של המוח, הגנגליון הוונטרלי ועצבי הסגמנטים גלויים כעת בשלבים הבאים. נמשוך את קצה החיתוך תחת לחץ אל תוך עצב הסגמנט במיטת FOP מזכוכית, ונשתמש בסיב מילוי פלסטי כדי להחיל אינדיקטור סידן על הקצה החשוף של העצב.

אך תחילה, נדגים כיצד להכין את חוט המילוי ואת אפקט המילוי ליצירת חוט המילוי. טכניקת משיכה דו-שלבית תיושם על פגם צהוב, שיחומם לאט לאורך מחצית מאורכו עד שהפלסטיק יהפוך לרך ושקוף. הפסיקו את החימום בנקודה זו ומשכו מיד את הקצה כלפי מעלה כדי להוציאו כחוט דק.

זהו קוטר של כחצי מילימטר. חתכו את הסיב לאורך של 50 מילימטרים. כעת הניחו את הסיב תחת מיקרוסקופ דיסקציה וקבעו את הקצה החתוך.

סיימו עם ציפורן האגודל ומשכו את הקצה השני כדי להוציא חוט דק באורך של one centimeter. יש לחתוך אותו בעזרת להב תער חדש על נייר רקמה כדי למנוע מעיכה, ולהבטיח שהחיתוך יהיה חד כדי להכין את המילוי. התחילו עם קפילרית בעלת דפנות דקות ללא שום חוט.

משוך את הקצה עד להשגתו של חוד דק ומסוגנן באמצעות מושך פט (pet puller). העבר את החלק שהוכן למיקרוסקופ נתיחה ושרוט את החלק המתוצר באמצעות נייר זכוכית. דחף את הקצה המרוחק (distal) מהשריטה בכיוון ההפוך לצד השריטה, כך שהקצה יישבר בצורה ישרה.

הקוטר הפנימי של השבירה צריך להיות גדול מהקוטר החיצוני. בקצה סיב המילוי, השתמש במיקרו-מלקחים כדי להמיס בחום את השבירה אל תוך הזכוכית עד להגעה לקוטר פנימי של כ-12 microns. השתמש במבער בנזן כדי להחליק את הקצה הבלתי מחודד של האלקטרודה.

ניתן להפעיל לחץ שלילי בקצה הבלתי חתוך של האפקטור באמצעות צינור קלטיק (Celtic tube) המותאם להודק, המחובר לצינור פולילין קשיח ולמזרק. אותו צינור ואותו מזרק ישמשו לשאיבה ולהזרקה של אינדיקטור הסידן מהפילמנט. יש להמיס את אינדיקטור הסידן במים מזוקקים עד לריכוז של חמישה מילי.

חלקו את התמיסה הזו לאליקוויטים של 5 µL. שמרו אותם בטמפרטורה של 4 °C. אין להקפיא את האליקוויטים הללו כדי לשמרם במצב לא קפוא עד לשימוש.

כעת, שאבו לסליל כמות של 1-2 סנטימטרים של אינדיקטור הסידן, וכעת אתם מוכנים להמשיך לשלב הקריטי ביותר בטכניקת טעינה זו. קחו את המספריים והפינצטה וחתכו את עצבי הסגמנט הקדמיים ביותר באופן פרטני ובסמיכות לגנגליונים הוונטרליים. את מסת עצבי הסגמנט AOR ביותר מהוונטר הוונטרלי.

גזמו את כל השאריות. הניחו את פילמנט המילוי על שיפוע שעוות השיניים כאשר הקצה נמצא במרכז הזחלה. חברו את הפחית השולסטית ואת המזרק.

שאבו כמות מסוימת של תמיסת שנאיידר (Schneider's solution) לתוך טיפ מדויק (perfect tip). כעת, הכניסו את קצה העצב לתוך הטיפ. ההתאמה חייבת להיות הדוקה אך לא לחוצה מדי.

יש למנוע חדירה נוספת של ה-Schneiders אל תוך המגן. בדרך כלל יש להסיר את הפואת הזכוכית והמזרק ולחבר אותם אל פילמנט F. יש להשקיע את צד הפילמנט ב-Schneiders שבתוך האמבט כדי לפרוק חשמל סטטי, ולהכניס מיד את קצה הפילמנט למרחק של 50 microns מחיתוך העצב מבלי לגעת בו בפועל.

יש להוסיף באיטיות אינדיקטור סידן כדי להגדיל את נפח התמיסול של שנידר (Schneider) בכשליש. ריכוז סופי של אינדיקטור הסידן יהיה מעט פחות מ-2 mM. יש להניח את התכשיר במקום חשוך ולח כך, בטמפרטורת החדר, למשך כ-40 דקות. ברצוני להדגיש כאן שתי נקודות חשובות.

ראשית, יש להבטיח נוכחות של תמיסה פיזיולוגית בקצה כדי לדלל את אינדיקטור הסידן, מכיוון שאינדיקטור הסידן הומס במים בלבד. התמיסה הפיזיולוגית חייבת להכיל סידן בריכוז של מספר מילימולרים, כיוון שאיטום האקסון (axon sealing) הוא תהליך תלוי סידן, ואיטום האקסון חיוני לשמירה על בריאותן של מסופי העצב.

הנקודה השנייה היא שאין להמתין יותר מחמש דקות בין חיתוך העצבים לבין החלת הצבע על הקצה החתוך של העצב. לאחר חמש דקות, קצוות התקרה של האקסונים ימנעו חדירה של אינדיקטורים לסידן המצומדים לדקסטרין בעלי משקל מולקולרי של 10,000. עמידה במגבלת זמן זו תדרוש תרגול.

אין לנסות לעכב את גדילת תקרת האקסון על ידי הפחתת רמות הסידן, שכן הדבר רק יפגע בתפקוד הפיזיולוגי העתידי של העצב הפגוע. לאחר דגירה של 40 דקות, כאשר התכשיר נמצא בתמיסת Schneiders, יש להבקיע את צד חוט המילוי עם האמבט ולהחזירו פנימה כדי להוציא את רוב תמיסת מדד הסידן מקצה המילוי ומההתחלה. שוב, באמצעות החוט, יש לשאוב תמיסת Schneiders רעננה מהאמבט ולמלא את המיטה לחלוטין ב-Schneiders.

אסור שיהיו בועות במיטה כיוון שתמיסתו של Schneider תשמש כאחד המוליכים המבודדים מהאמבט בעוד זכוכית ה-pet תעורר את העצב; שוב, מקם את הדגימה במקום חשוך למשך 60 דקות לפחות, אך לא יותר מארבע שעות, ובצע שטיפות (RINs) בתמיסת Schneider טרייה מדי 30 דקות במהלך הדגירה; מדד הסידן מועבר למטה. האקסון מרכז את עצמו בקצה העצב 20 דקות לפני שברצונך לבחון את הדגימה. שטוף אותה בתמיסת HL six.

שמרו על רמת הסידן הרצויה כאשר רמת הסידן היא מעל כ-0.4 millimolar, והוסיפו גלוטמט או חומצה L-גלוטמית ל-HL6 בריכוז של 7 millimolar כדי לעצור התכווצות שרירים המופעלת על ידי עצבים. תמיסת שנידר (Schneider's solution) אינה מתאימה לדימות סידן כיוון שהיא כבר מכילה רמות גבוהות הן של גלוטמט והן של סידן. תרצו להתאים רמות אלו.

Tate נוכח גם הוא, מה שמאפשר לבצע טעינה אוטופלורסצנטית של Schneider וכן דימיון ב-HL six, כל עוד קיים סידן בריכוז של לפחות 2 מיליון במהלך הטעינה. בעת הגדרת ההכנה על מיקרוסקופ קומפואונד לצורך דימיון, הקפידו שוב לפרוק את כל החשמל הסטטי מעצמכם. לאחר מכן, געו באמצעות פינצטה הן בתמיסה באמבט והן בעדשה.

אם מדובר בעדשה לטבילה, הורידו אותה אל האמבט, ולאחר מכן הארקו לרגע את הבסיס באופן מעורר, או הכניסו אחת לאמבט והחדירו את השנייה פנימה תוך מילוי המצע. פולסים של DC במתח נמוך מ-3 V ובמשך 300 µs יעוררו באופן מהימן פוטנציאל פעולה בעצב. כאן אנו רואים כי שתי קבוצות של סיומי עצבים בחריץ שבין שריר 6 ל-7 הפכו גלויות באמצעות הנעה של ביטוי ציטוסולי של GFP. הן מולאו בנוסף ב-Rod Dextrin, אינדיקטור לסידן, בעל ספקטרי עירור ופליטה השונים מאלו של GFP.

שדה ראייה זה עדיין מכיל את סופי העצב, אך ל-Rod Rin יש זיקה נמוכה לסידן והוא כמעט בלתי נראה כאשר העצב במצב מנוחה. עם זאת, הוא מגיב מאוד לסידן שנכנס לסופים במהלך פוטנציאלי פעולה בודדים או רכבות קצרות של גירויים באורך שני שניות. כפי שמוצג כאן בניתוח הפלואורסצנציה של רכבות ה-80 hertz הצפופות שהוצגו זה עתה, התגובות בסופי type one S הן בדרך כלל גבוהות יותר מאלו שבסופי type one B.

אינדיקטורים לסידן בעלי זיקה נמוכה כגון rod dextrin ו-flu. Rod dextrin הראה תגובה כמעט ליניארית לתדרי גירוי של עצבים בטרמינלים אלו בטווח של 10 עד 80 hertz. הדוגמה המוצגת כאן מקורה בטרמינל עצבי בשריר מספר ארבע, שהוטען ב-Rod Dextrin.