Name: צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: למד הדמיה קונפוקלית בזמן אמת של שינויי צורת תאים בעוברי Drosophila melanogaster באמצעות חלבונים מסומני GFP. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לעקוב אחר תהליכי התאצה בפיתוח עוברי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

בהכרת תודה אנו מודים אריק Wieschaus, שסיפק את הבסיס שעליו בפרוטוקול זה פותחה. העבודה שלנו היא נתמכת על ידי ורנה &amp; Marrs מקלין המחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית פרס Start-up, ביילור לרפואה.

<ol><li>Sagona, A. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis and cancer.</a> FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).</li>
<li>Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease.</a> Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).</li>
<li>Kibar, Z., Capra, V., Gros, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+understanding+the+genetic+basis+of+neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Toward understanding the genetic basis of neural tube defects.</a> Clin Genet. 71, 295-310 (2007).</li>
<li>Jazwinska, A., Ribeiro, C., Affolter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+tube+morphogenesis+during+Drosophila+tracheal+development+requires+Piopio%2C+a+luminal+ZP+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial tube morphogenesis during Drosophila tracheal development requires Piopio, a luminal ZP protein.</a> Nat Cell Biol. 5, 895-901 (2003).</li>
<li>Martin, P., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallels+between+tissue+repair+and+embryo+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis.</a> Development. 131, 3021-3034 (2004).</li>
<li>Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessing+the+role+and+dynamics+of+nonmuscle+myosin+II+during+furrow+formation+in+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 15, 838-850 (2004).</li>
<li>Lecuit, T., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+insertion+of+new+membrane+from+a+cytoplasmic+reservoir+during+cleavage+of+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polarized insertion of new membrane from a cytoplasmic reservoir during cleavage of the Drosophila embryo.</a> J Cell Biol. 150, 849-860 (2000).</li>
<li>Mavrakis, M., Rikhy, R., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+polarity+and+compartmentalization+are+established+before+cellularization+in+the+fly+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane polarity and compartmentalization are established before cellularization in the fly embryo.</a> Dev Cell. 16, 93-104 (2009).</li>
<li>Cao, J., Crest, J., Fasulo, B., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+Actin+Dynamics+Facilitate+Early-Stage+Centrosome+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cortical Actin Dynamics Facilitate Early-Stage Centrosome Separation.</a> Curr Biol. , (2010).</li>
<li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. N. uf <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Rab11+effector%2C+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> J Cell Biol. 182, 301-313 (2008).</li>
<li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+actin-dependent+endocytosis+is+zygotically+controlled+to+initiate+Drosophila+cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Local actin-dependent endocytosis is zygotically controlled to initiate Drosophila cellularization.</a> Dev Cell. 14, 775-786 (2008).</li>
<li>Fox, D. T., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abelson+kinase+%28Abl%29+and+RhoGEF2+regulate+actin+organization+during+cell+constriction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila.</a> Development. 134, 567-578 (2007).</li>
<li>Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+contractions+of+an+actin-myosin+network+drive+apical+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction.</a> Nature. 457, 495-499 (2009).</li>
<li>Bertet, C., Sulak, L., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-dependent+junction+remodelling+controls+planar+cell+intercalation+and+axis+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myosin-dependent junction remodelling controls planar cell intercalation and axis elongation.</a> Nature. 429, 667-671 (2004).</li>
<li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Dev Cell. 11, 459-470 (2006).</li>
<li>Caussinus, E., Colombelli, J., Affolter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip-cell+migration+controls+stalk-cell+intercalation+during+Drosophila+tracheal+tube+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tip-cell migration controls stalk-cell intercalation during Drosophila tracheal tube elongation.</a> Curr Biol. 18, 1727-1734 (2008).</li>
<li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr Biol. 20, 359-366 (2010).</li>
<li>Gorfinkiel, N., Blanchard, G. B., Adams, R. J., Arias, M. artinez, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+global+cell+behaviour+during+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of global cell behaviour during dorsal closure in Drosophila.</a> Development. 136, 1889-1898 (2009).</li>
<li>Solon, J., Kaya-Copur, A., Colombelli, J., Brunner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+forces+timed+by+a+ratchet-like+mechanism+drive+directed+tissue+movement+during+dorsal+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pulsed forces timed by a ratchet-like mechanism drive directed tissue movement during dorsal closure.</a> Cell. 137, 1331-1342 (2009).</li>
<li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 33, 789-801 (1975).</li>
<li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygotically+controlled+F-actin+establishes+cortical+compartments+to+stabilize+furrows+during+Drosophila+cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Zygotically controlled F-actin establishes cortical compartments to stabilize furrows during Drosophila cellularization.</a> J Cell Sci. 121, 1815-1824 (2008).</li>
<li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 15050-15055 (2001).</li>
<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).</li>
<li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול המתואר במסמך זה יאפשר הדמיה לחיות, confocal של מספר שינויים בצורת התא בעובר המתפתח לעוף. מניות ה-GFP הדמיה יכול להיות מוכן על ידי מעבדה הפרט (טבלה 2), אך מניות רבות כאלה זמינים גם בפומבי ממרכזי כגון Bloomington תסיסנית במלאי מרכז באוניברסיטת אינדיאנה ( <a href="http://flystocks.bio.indiana.edu">http://flystocks.bio.indiana.edu</a> ) ו פרח מלכודת במלאי מרכז באוניברסיטת ייל ( <a href="http://flytrap.med.yale.edu">http://flytrap.med.yale.edu</a> ). רכשה לאחר נתונים ...

<table><tbody><tr><td>שקופיות</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי 25x25</td><td>Fisher Scientific</td><td>1 2-524C</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקי התזה (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;סגירת המעגל (O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-897-11</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות פלקון (Falcon) בנפח 50 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>נבובות לשאיבה עבור פיפטות קטנות, 1 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-21</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני סינשילציה עם פקקים</td><td>VWR international</td><td>66021-533</td><td></td></tr><tr><td>ביכרי Tri-Corn, 100 מ"ל</td><td>מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית</td><td>60970</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי BD Falcon בגודל 60x15 מ"מ </td><td>Fisher Scientific</td><td>08757 100B</td><td></td></tr><tr><td>מסנן תאים BD Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>טיפי פ pipette צהובים</td><td>Rainin</td><td>L200</td><td></td></tr><tr><td>רשת פלדת אל-חלד, 304, 12x24</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150-F-01</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית 5&amp;#190; פיפטות פסטור בגודל 6 אינץ'</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון P4</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-803-6F</td><td></td></tr><tr><td>גומיות</td><td>Office Max</td><td>A620645</td><td></td></tr><tr><td>סרט דביק דו-צדדי של Scotch, &amp;frac12; אינץ'</td><td>Office Max</td><td>A8137DM-2</td><td></td></tr><tr><td>מכחולי צבע Robert Simmons Expression מסדרת E85, עגולים, מספר 2</td><td>ג'רי&amp;rsquo;Artarama</td><td>56460</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה Dumont #5, דיוק גבוה, Inox</td><td>מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית</td><td>72701-DZ</td><td></td></tr><tr><td>להבי תער</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon Oil 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H 8773</td><td></td></tr><tr><td>הפטאן</td><td>Fisher Scientific</td><td>H360-1</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Agar</td><td>VWR international</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>חומצה p-הידרוקסיבנזואית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>שמרים יבשים פעילים של Red Star</td><td>LeSaffre</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>נייר סופג, קיפולי C</td><td>Kleenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נייר אלומיניום עמיד (Heavy duty)</td><td>נייר אלומיניום (Reynolds Wrap)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומר הלבנה</td><td>אוסטון&amp;rsquo;A-1 מסחרי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% מיץ תפוחים</td><td>Ocean Spray או Tree Top</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

העובר המתפתח תסיסנית melanogaster עובר מספר שינויים בצורת התא כי הם נוחים מאוד לחיות הדמיה confocal. צורת התא שינויים לטוס מקבילים לאלה של יצורים עילאיים, והם כונן המורפוגנזה רקמות. לכן, במקרים רבים, המחקר שלהם יש השלכות ישירות להבנת מחלות אנושיות (טבלה 1) 1-5. בסולם המשנה הסלולר, אלה שינויים בצורת התא הם תוצר של פעילויות, החל ביטוי גנים על התמרה האות, קוטביות התא, שיפוץ cytoskeletal וסחר הממברנה. לכן, את העובר תסיסנית מספק לא רק את ההקשר כדי להעריך שינויים בצורת התא ככל שהם מתייחסים המורפוגנזה רקמות, אלא גם מציע סביבת פיזיולוגיים לחלוטין ללמוד את המשנה הסלולר פעילות תאים לעצב. הפרוטוקול המתואר כאן נועד תמונה תאים מסוים לשנות צורה נקרא cellularization. Cellularization הוא תהליך של צמיחה פלזמה דרמטי קרום, וזה בסופו של דבר ממיר את העובר סינסיציאלי לתוך blastoderm הסלולר. כלומר, בכל שלבי הביניים של מחזור mitotic 14, הממברנה הפלסמטית בו זמנית invaginates סביב זה של גרעינים 6000 ~ מעוגן cortically ליצור גיליון של תאים אפיתל העיקרי. בניגוד להצעות קודמות, cellularization אינו מונע על ידי contractility שרירן-2 6, אבל היא מונעת בעיקר על ידי במקום exocytosis של קרום מחנויות פנימי 7. לפיכך, cellularization היא מערכת מצוינת ללימוד סחר קרום במהלך שינויים בצורת התא הדורשים הממברנה הפלסמטית invagination או הרחבה, כגון cytokinesis או רוחבי, אבובית (T-אבובית) המורפוגנזה בשריר. שים לב שזה פרוטוקול מוחל בקלות הדמיה של אחרים שינויים בצורת התא בעובר לעוף, רק דורש הסתגלות קלה כגון שינוי בשלב של איסוף העובר, או באמצעות &quot;דבק העובר&quot; על מנת לטעון את העובר בכיוון טבלה ספציפיים ( 1) 8-19. בכל מקרה, זרימת העבודה הוא בעצם אותו דבר (איור 1). שיטות תקן שיבוט תסיסנית transgenesis משמשים להכנת מניות לעוף יציב המבטאים חלבון של עניין, התמזגו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או על גירסאותיה, וזבובים אלה מהווים מקור מתחדש של עוברים. לחלופין, חלבוני ניאון / בדיקות מוצגים ישירות באמצעות הזרקת מיקרו פשוט טכניקות 9-10 לעוברי לעוף. ואז, תלוי במקרה התפתחותיים שינוי צורת התא להיות צילמו, עוברים נאספים מבוים על ידי המורפולוגיה על מיקרוסקופ לנתח, ואת מיקומו ולבסוף ועלה הדמיה זמן לשגות על מיקרוסקופ confocal.

התפתחות מוקדמת של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מאופיינת במספר שינויים בצורת התא כי הם גם מתאים גישות הדמיה. מאמר זה יתאר כלים בסיסיים ושיטות הדרושים הדמיה confocal חיים של עוברים תסיסנית, יתמקד בשינוי צורת התא הנקרא cellularization.

העובר של *Drosophila melanogaster* בשלבי התפתחותו עובר מספר שינויים במורפולוגיית התאים, אשר ניתנים לדימות יעיל מאוד באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים חיים. צורת התא...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים שינויים במבנה התא בעוברים חיים של דרוזופילה. מטרה זו מושגת תחילה על ידי יצירה והרחבה של מאגרי זבובים טרנסגניים המבטאים גששי חלבון המסומנים ב-GFP. השלב השני של הפרוצדורה הוא העברת זבובים אלו לכוסות לאיסוף עוברים.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא איסוף העובריים. השלב הרביעי הוא ציפוי והרכבה של העובר. לבסוף, ניתן לקבל תוצאות המראות שינויים במבנה התאים, כגון שינויים תאיים, באמצעות דימות קונפוקאלי בשיטת time-lapse של העובריים המורכבים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דימוי רקמות מקובעות, הוא שניתן ללכוד את ההיבטים הדינמיים של שינויים בצורת התאים בהקשר של עוברים חיים. אף על פי שהשיטה המתוארת כאן מותאמת ליצירת הוושאון (esophagus ization), ניתן להתאימה ולהחילה על שינויים אחרים בצורת התאים הנלווים להתפתחות מוקדמת של הזבוב, כגון היווצרות התלם הגבי (ventral furrow), התארכות פס הנבט (germ band extension), תהליך ה-trache agenesis וסגירה גבית (dorsal closure). אנשים שאינם מכירים את הטכניקה הזו חווים לעיתים קושי במניפולציה ובקיבוע של העוברים תחת מיקרוסקופ המשקף.המדריכה שלי לתואר המתקדם, Anna Marie Soki, ואני נדגים את ההליך הזה. ההליך מתחיל בהכנת כוס לאיסוף עוברים; בעזרת תער, חתכו את התחתית של כוס tricorn בנפח 100 milliliter, והקפידו להפוך את השפה לחלקה ככל האפשר. חתכו את שלוש הפינות מהחלק העליון כדי להקל על הטיפול בכוס.בשלב הבא, גזרו ריבוע של רשת חוטים בגודל שש סנטימטרים על שש סנטימטרים בעבודה תחת מזהם. הניחו חתיכת נייר אלומיניום עמיד על פלטה חימום שחוממה מראש, והניחו את ריבוע רשת החוטים מעל נייר האלומיניום. הצמידו בחוזקה את הקצה התחתון הגזור של הכוס אל הרשת החמה.המתינו מספר שניות והרימו את הכוס כשהרשת מחוברת אליה כעת. אם גם הרדיד נצמד, קלפו אותו. השאירו את הכוס למשך לילה עד למחרת.הסיר רשת מיותרת בעזרת מספריים ושייף פינות חדות בעזרת נייר זכוכית בעל גרעין עדין. השלב הבא הוא הכנת משחת שמרים, שתעודד ייצור עוברים על ידי הזבובים הנקבות. מלא כוס קטנה בחלקים שווים בערך של שמרים יבשים פעילים (Red Star) ומים מזוקקים, וערבב עד להמסת השמרים.על העיסה להיות בעקביות הדומה לזו של חמאת בוטנים רטובה. כאשר עיסת השמרים מוכנה, הוצא את צלחות האגר עם מיץ התפוחים מאחסון בטמפרטורה של 4 °C. תיאור של אופן הכנת צלחות האגר עם מיץ התפוחים מופיע בכתב היד הנלווה.שפוך את מיץ התפוחים לצלחות עם משחת השמרים והמתן לפחות שעה עד שהצלחות יגיעו לטמפרטורת החדר. קפל נייר סינון עגול לחצי, ואז שוב לחצי.גזרו את הנייר לקוטר של שמונה עד תשעה סנטימטרים. צרו קיפולי אקורדיון ברבע עיגול. פתחו את העיגול, הפכו אותו, והכניסו אותו לכוס איסוף עד שייגע ברשת.וודאו שהנייר מקובע היטב בכלי כך שלא ייפול וימעך את הזבובים. כעת הגיע הזמן להעביר את הזבובים. קחו בקבוק מלאי של זבובים שהושא לשבועיים להתרבות. בבקבוק זה צריכים להיות מספיק זבובים כדי למלא כלי אחד לאיסוף עוברים עם מינימום של 50 נקבות ו-30 זכרים.לקבלת ביצים מיטביות, השתמשו בזבובים שחלפו פחות מחמישה ימים מרגע הבקיעה. סמנו את כוס האיסוף בשם המאגר ובתאריך. הפכו את בקבוק הזבובים ונערו אותו בעדינות מעל כוס האיסוף כדי להעביר את הזבובים לתוך הכוס, וכסו מיד את הכוס בצלחת מיץ תפוחים שהוכנה מראש.הדק את הפלטה לכוס באמצעות גומייה. הנח את הכוס עם מיגון הרשת בטמפרטורת החדר באזור עם תאורה ישירה. ודא שאין צללים הנופלים על הכוס, שכן הזבובים לא יטילו ביצים ביעילות בחשכה. לאחר שעתיים, אסוף את העוברים על ידי החלפת פלטת מיץ התפוחים בפלטה חדשה לאספנו בטמפרטורת החדר.מתאים לדימות תאי. בשלב הבא, הכינו תא קיבוע עבור העובריים. לשם כך, גזרו חתיכה של סרט דביק דו-צדדי באורך של שניים עד שלושה סנטימטרים והניחו אותה על סרטית, כאשר ציר הסרט והסרטית מיושרים.חתוך חתיכה שנייה של סרט דביק דו-צדדי באורך של שניים עד שלושה סנטימטרים והנח אותה מעל חתיכת הסרט הראשונה, תוך כדי ודואגים שהקצוות שלהן מיושרים. באמצעות להב תער, בצע שתי חתכים במרכז הסרט, במרווח של כ שלושה מילימטרים זה מזה ובמאוך לציר האורכי של הזריגה. הסר את הסרט שבין החתכים כדי ליצור תעלה, וטפטף בעזרת פיפטה שמן halo carbon 27 אל תוך התעלה.בתוך תעלה זו יורכבו העובריים. חטאו את העובריים על ידי כיסוי פלטת מיץ התפוחים בבליצ' (bleach) בריכוז 50% למשך 30 עד 60 שניות. אספו את העובריים למסנן תאים ושטפו אותם בעוצמה במים מזוקקים באמצעות בקבוק נטף.ספגו את המסננת בנייר סופג. השתמשו במברשת צבע לחה כדי להעביר 10 עד 50 עוברים מצופים לצלחת מיץ תפוחים נקייה ללא משחת שמרים. ספגו את העודפי המים בעזרת קצה קרוע של נייר סופג וכסו מיד את העוברים בכמות קטנה של שמן halo carbon 27.העבירו את צלחת מיץ התפוחים למיקרוסקופ דיסקציה המשתמש באור חודר. דרגו את העוברים על פי ההנחיות המורפולוגיות של bounds. השתמשו בפינצטה כדי להעביר חמישה עוברים בשלב מחזור מיטוטי 11 או 12, התואמים לשלב bound ארבע, לתעלה של תא הקיבוע.סדרו את העוברים בקו כך שהצדדים הגבי (dorsal) והבטני (ventral) גלויים והצד הצידי שלהם פונה כלפי מטה. ניתן לסדר את העוברים בקלות באוריינטציה זו בשמן בלבד. כדי למנוע דחיסות של העוברים, השאירו רווח של לפחות חצי מאורך עובר בין עובר לעובר.הניחו קצה אחד של כיסוי זכוכית (cover slip) בגודל 25 על 25 מילימטר על הסרט בעל הצד הכפול באחד מצדי התעלה, תוך יישור של קצה כיסוי הזכוכית עם אחד מקצות הסרט. הניחו את כיסוי הזכוכית כך שיכסה את התעלה. אם נלכד אוויר מתחת לכיסוי הזכוכית, מרחו כמות קטנה של שמן בקצה הכיסוי.פעולת נימיות תמשוך את השמן אל תוך התעלה ותדחף החוצה את האוויר. הנח את תא ההרכבה על המיקרוסקופ הקונפוקאלי ואתר את העובריים באמצעות אור חדירה. לאחר מכן, עבור לדימיון קונפוקאלי כדי למקד אזור עניין עבור תמונה תאית במישור בודד הקרוב למרכז העובר.כדי לעקוב אחר דינמיקת ההשכפלה (Invagination), השתמשו ברווחים שבין 30 ל-62 לצילומי time-lapse. לאחר רכישת התמונות, נתחו אותן באמצעות חבילת ניתוח תמונות, כגון חבילת התוכנה החינמית של NIH הנקראת ImageJ. את הנתונים ניתן להציג לאחר מכן כסרטונים, רצפים או גרפי CH. כדי לצלם שינוי בצורת תא שאינו תאי, ייתכן שיהיה צורך להרכיב את העובריים an orientation ספציפי שאינו נשמר בקלות בשמן בלבד.על מנת לעשות זאת, השתמשו בשיטת קיבוע חלופית לזו שתוארה קודם לכן. התחילו בהכנת דבק לעובריים על ידי שילוב של 20 סנטימטרים של סרט דבק דו-צדדי עם 250 microliters של heptane בתוך מבחנה. הניחו מבחנה זו על מכשיר ערבול או פלטפורמה מסתובבת וערבבו למשך לילה.ביום למחרת, טבול טיפ פיפטה צהוב בדבק לעוברים ולאחר מכן העבר את טיפ הפיפטה לאורך תבנית, כך שייוותר נתיב של דבק בזמן שההפטן מהדבק לעוברים מתאדה. יישר את העוברים המוכנים על גוש של אגר, כך שהחלק של העובר שיידגם יהיה פונה אל האגר. לדוגמה, לצורך דימוג שינוי בצורת התא.במהלך יצירת ה-farrow, מקמו את העובריים כאשר הצד הגבתי שלהם פונה כלפי האגר. הפכו את השקופית עם דבק העוברים והצמידו בעדינות את פס הדבק אל העובריים שעל בלוק האגר. כעת הפכו את השקופית שוב.רוב העובריים צריכים להיות דבוקים למשקף בכיוון המתאים. לאחר מכן, הניחו שתי שכבות של סרט דביק דו-צדדי משני צדי העובריים. כסו אותם בשמן halo carbon 27 והניחו זכוכית כיסוי.העוברים מוכנים כעת לדימות. תמונות אלו מציגות דימות בשיטת time-lapse של עוברים בשלב הבלולית (cellular), כאשר הצדדים הגבי (dorsal) והבטני (ventral) גלויים בבירור, והדימות מתבצע סמוך למרכזם. כדי לעקוב אחר ממבנה קרום התא (plasma membrane) בהשקupas (cross-section), העובר המוצג כאן מבטא גש Probe של GFP myosin two, אשר ריכוזו גבוה בקצות ההשקפולים (invaginations) של קרום התא. מעקב אחר התקדמות חזית זו לאורך זמן מאפשר לקבוע את הקצב שבו קרום התא מבצע השקפל. נקודת הזמן של דקה 0 תואמת לתחילת השלב הבלולית, זמן קצר לאחר נקודת הזמן של דקה 56, שבה מתחילה הגסטרולציה בצדו הבטני של העובר.סרט time lapse זה של תאים התחיל במחזור המיטוטי הקודם, 13, ותיעד cleavage מדומה, נסיגת התלם (furrow regression), ונמשך עד שנצפו תנועות גסטרומציה בצד הגבתי (ventral) של העובר. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע את הקיבוע והדימוי תוך 60 עד 90 דקות במידה שהם מבוצעים כהלכה. כמובן שאיסוף העוברים דורש זמן נוסף ויש לתאם אותו עם הקיבוע והדימוי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לעשות כל שניתן כדי לשמור על בריאותם של העוברים. לדוגמה, אין להבליץ את העוברים יתר על המידה ויש להגביל את חשיפתם ללייזר במהלך הדמיה לאחר פרוצדורה זו. ניתן להשתמש בטכניקות הדמיה מתוחכמות יותר, כגון photo bleaching ו-photo switching, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון: מהי הדינמיקה של השלד התאי והממברנה הנלווית לשינוי נתון במורפולוגיית התא?

imaging-cell-shape-change-in-living-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

כאן אנו מציגים פרוטוקול הרכבה...

הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים

כאן אנו מתארים שיטה יעילה ללימוד דינמיקה של פינוי תאים...

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

מסמך זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ confocal סריקה מהירה לתמונת התנהגות תא ישירות דרך הגולם. מאת עוזב את המקרה גלמי שלם, שיטה זו מאפשרת תצפית ומדידה של תהליכים בתא דינמיים בשלב של פיתוח דרוזופילה שקשה ללמוד באופן ישיר.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

כאן אנו מתארים הליך ללכידת תמונות חיות של גסטרולציה של דרוזופילה. זה אפשר לנו להבין טוב יותר את ההתכווצות האפיקלית הכרוכה בהתפתחות מוקדמת ולנתח עוד יותר מנגנונים השולטים בתנועות התאים במהלך שינוי מבנה הרקמה.

הדמיה של שינוי צורה של התא ותנועתו ב תסיסנית Gastrulation שימוש Reporter DE-cadherin זבובים טרנסגניים

פרוטוקול זה מיועד הדמיה וניתוח של הדינמיקה של כיוון התאים ואת צמיחת רקמות בתוך הבטן הדרוזולה epithelia כמו זבוב הפרי עובר מטמורפוזה. המתודולוגיה המתוארת כאן ניתנת להחלה על חקר שלבים, רקמות ומבנים תת-סלולאריים שונים בדרוזופילה או באורגניזמים אחרים במודל.

הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

המטרה של פרוטוקול זה היא להזריק רודמין מצומד אקטין כדורי לתוך עוברים Drosophila ואת התמונה הרכבה מוט actin תוך גרעיני בעקבות עומס חום.

הדמיה מוטות Actin תוך-גרעיניים בחום חי הדגישו עוברי דרוזופילה

פרוטוקול זה מתאר תיוג פלואורסצנטי מותאם אישית מבוסס נוגדנים והזרקה לעוברים מוקדמים של דרוזופילה כדי לאפשר הדמיה חיה של חלבונים בשפע נמוך או שינויים לאחר תרגום שמאתגרים לזיהוי באמצעות גישות GFP/mCherry-tag מסורתיות.

הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה חיה של החלוקה הא-סימטרית של תאי גזע של קו הנבט (GSCs) בנישת השחלות של דרוזופילה. אנו משתמשים בקו טרנסגני המבטא בכל מקום היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של חלבון הספקטרוזום Par-1.

הדמיה חיה מורחבת של נישות תאי גזע נקבות Drosophila melanogaster

כאן, מוצג פרוטוקול להדמיה חיה ארוכת טווח של רגל הדרוזופילה בשלב הגולם, הכולל הסרה מלאה של הגולם. ניתן ליישם פרוטוקול זה גם על רקמות אחרות.

הדמיה חיה לטווח ארוך של התפתחות רגל גולם דרוזופילה לאחר הסרת פופריום

למד הדמיה קונפוקלית בזמן אמת של שינויי צורת תאים בעוברי Drosophila melanogaster באמצעות חלבונים מסומני GFP. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לעקוב אחר תהליכי התאצה בפיתוח עוברי.

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

גלה סרטונים נוספים