Name: מניפולציה מכני של נוירונים שליטה פיתוח axonal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: למד מניפולציה מכנית של נוירונים לבקרת התפתחות אקסונלית באמצעות מחטי זכוכית כיוליות. שיטה זו מאפשרת מדידת כוחות בטווח המיקרודין והבנת הביופיזיקה של הארכת אקסונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו בתודה להכיר התרומות החשובות של ד&quot;ר רוברט בוקסבאום בפיתוח מתודולוגיה זו.

<ol><li>Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+growth+cone+adhesion+to+culture+surfaces+by+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation.</a> J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).</li>
<li>Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+neurite+outgrowth+from+chick+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons.</a> J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeidemann%2C+SR+%22The+Neuron+in+Tissue+Culture%22">The Neuron in Tissue Culture</a>. Haynes, L. W. , J. Wiley and Sons. 105-119 (1999).</li>
<li>Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+is+required+for+growth+cone+function+but+not+neurite+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rac is required for growth cone function but not neurite assembly.</a> J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).</li>
<li>Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+can+specify+axonal+fate+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons.</a> J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+the+mechanical+behaviors+of+the+cytoskeleton+in+living+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts.</a> J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).</li>
<li>Yoneda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Exerted+by+a+Single+Cilium+of+Mytilus-Edulis+.1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1.</a> Journal of Experimental Biology. 37, (1960).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Tension+Produced+by+Nerve-Cells+in+Tissue-Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture.</a> Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Fass, J. N., Odde, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+force-dependent+neurite+elicitation+via+anti-beta1+integrin+antibody-coated+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads.</a> Biophys J. 85, 623-636 (2003).</li>
<li>Yang, S., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+Force+Sensors+and+Their+Applications+in+the+Study+of+Cell+Mechanical+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mech%22%5BJournal%5D)">Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response.</a> Exp Mech. 49, 135-151 (2009).</li>
<li>Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drag+Force+as+a+Tool+to+Test+the+Active+Mechanical+Response+of+PC12+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites.</a> Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+that+growth+cones+pull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct evidence that growth cones pull.</a> Nature. 340, 159-162 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+behavior+and+production+of+traction+force%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth cone behavior and production of traction force.</a> J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-dish+incubator+for+live+cell+imaging+with+an+inverted+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope.</a> Biotechniques. 35, 708-708 (2003).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

טכניקות ליישם ולמדוד כוחות הסלולר יש היסטוריה ארוכה 9. השיטה שלנו נבעה במקור על ידי העבודה של דניס בריי, שהשתמשו במחטים זכוכית דומה לשלנו לנוירונים &quot;גרירה&quot; בקצב קבוע באמצעות מכשיר הידראולי ממונע 10. ישנם אמצעים חלופיים רבים של החלת כוחות תאים הכוללים: stepper מנועים 11, 12 חרוזים מגנטיים, קורות microfabricated 13 ו - 14 זורם נוזל. האחרון דומים הגישה שלנו כי בדיקה הסלולר הוא מכויל בסופו של דבר נגד קרן כיפוף של קשיחות ...

<table><tbody><tr><td>צינור קפילרי R-6</td><td>Drummond Scientific</td><td>9-000-3111</td><td>זכוכית R-6, קוטר חיצוני 0.9mm, קוטר פנימי 0.6 mm, אורך 8&quot;</td></tr><tr><td>מכשיר מתיחה BB-CH puller</td><td>Mecanex S.A., Geneva, Switzerland</td><td>BB-CH puller</td><td>השתמש במצב 4 Alt עם CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000</td></tr><tr><td>חוט Chromel בעובי 0.001&quot;</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCH-001-50</td><td>חוט תרמוקפל ללא בידוד, סליל של 50ft, כיום נקרא Chromega</td></tr><tr><td>חוט Constatan בעובי 0.003&quot;</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCI-003-50</td><td>חוט תרמוקפל ללא בידוד, סליל של 50 ft</td></tr><tr><td>פינצטה עדינה</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Dumont Inox #5</td></tr><tr><td>מעמד זרוע אוניברסלי למיקרוסקופ</td><td>Nikon Instruments</td><td>76135 or 90430</td><td>מרבית המותגים או הסוגים של מעמדי זרוע יתאימו לשימוש זה</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור מכני</td><td>Narishige International</td><td>M-152</td><td>מיקרומניפולטור גס בעל הנעה ישירה בשלושה צירים</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור הידראולי</td><td>Narishige International</td><td>MO-203</td><td>זמין כעת כ-MMO-203, מסוג שלושה צירים נעים</td></tr><tr><td>מחזיק מחטים</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520145</td><td>סט של 3</td></tr><tr><td>מחזיק מכשיר בודד</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520142</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מכשירים כפול</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520143</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור מכני</td><td>Leica Microsystems</td><td>39430001</td><td>הרכבת מוט, מחזיק פרובה אחד, דגם RH 430001</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור מכני עם ג'ויסטיק</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520137</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM IRB</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>מיקרוסקופ הפוך</td></tr><tr><td>שולחן בידוד Vibraplane</td><td>Kinetic Systems</td><td>1200 series</td><td>הדגם שברשותנו הוא 1201-02-12</td></tr><tr><td>Ringcubator</td><td>בנייה עצמית (ראו סימוכין 19)</td><td></td><td>סימוכין 19, דורש בקר מעודכן המופיע להלן</td></tr><tr><td>בקר טמפרטורה ניתן לתכנות</td><td>Instrumart.com</td><td>Fuji Electric PXR3</td><td>מחליף את בקר הטמפרטורה PXV3 שהוצא משימוש</td></tr><tr><td>Nikon Diaphot TMD</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>מיקרוסקופ הפוך, משנת 1980 בערך</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה דו-עדשתי Nikon SMZ-10</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>מיקרוסקופי דיסקציה אחרים יתאימו</td></tr></tbody></table>

מניפולציה מכני של נוירונים שליטה פיתוח axonal

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

מניפולציות תאים הרחבה של אקסונים עצבי יכול להתבצע עם זכוכית מכויל מיקרו סיבי מסוגל למדוד וליישם כוחות 1,2 μdyne 1-10 טווח. מדידות חיל מתקבלים באמצעות תצפית של Hookean כיפוף של מחטים זכוכית, אשר מכויל על ידי שיטה ישירה אמפירי 3. דרישות ציוד ונהלים בודה, כיול, טיפול, ושימוש במחטים על תאים מתוארים באופן מלא. כוח המשטרים סוגי תאים המשמשים בעבר השונים אשר טכניקות אלה יושמו להדגים את הגמישות של המתודולוגיה ומקבלים כדוגמאות לחקירה בעתיד 4-6. היתרונות הטכניים של ראיה &#39;מתמדת של כוחות המיוצר על ידי המניפולציות ואת היכולת להתערב באופן ישיר במגוון רחב של אירועים הסלולר. אלה כוללים גירוי ישיר ורגולציה של צמיחה axonal לבין הפתיחה 7, כמו גם ניתוק מדידות מכניות על כל סוג של תאים בתרבית 8.

יישום ישיר מדידות של כוחות על הנוירונים בטווח 2000-1000 microdyne מושגות עם דיוק גבוהה באמצעות מחטים זכוכית מכויל. מתודולוגיה זו ניתן להשתמש כדי לשלוט ולמדוד כמה היבטים של התפתחות axonal, לרבות ייזום axonal, מתח axonal, מהירות של התארכות axonal ו וקטורים כוח.

ניתן לבצע מניפולציות של תאים והארכה של אקסונים עצביים באמצעות מיקרו-סיבים מזכוכית מכויילים, המסוגלים למדוד ולהפעיל כוחות ב...

מטרת ניסוי זה היא להאריך אקסון תוך כדי מדידה מדויקת של כוחות. מטרה זו מושגת על ידי יצירת מחט ייחוס מחוט המכוילת באופן ישיר; לאחר כיול מחט ייחוס המחוט, מוכנות מחטים מכוילת, ביניים ועבודה בטווח הכוחות הרצוי. לאחר מכן, תאים של קונוסי צמיחה נגררים באמצעות מחט עבודה כדי להאריך אקסון.ההארכה האקסונלית המתקבלת נרשמת והכוחות נמדדים על בסיס כיפוף המחט המכוילת. שיטה זו יכולה להשיב על שאלות מפתח בנוגע לביופיזיקה של הארכת אקסונים. התחילו את ההליך באמצעות שובר מיקרו-מחטים (microneedle puller) מתכוונן וצינורות קפילריה מזכוכית כדי לייצר מחטים עם קצוות קוניים באורך של כארבעה מילימטרים.אחסן את המחטים בצלחת פטרי מכוסה בקוטר 160 מילימטר. לאחר מכן, הכן מחט כיול מחוט על ידי השחלת חוט כרומאל בעובי 0.001 אינץ' אל תוך מחט זכוכית שקצֵה שלה שבור. משוך את החוט מהקצה עד לאורך של 26 מילימטרים והדבקו במקומו בעזרת דבק מהיר.כופפו את המילימטר המרוחק (distal) של התיל לצורת וו. לאחר מכן, הכינו משקולות מיקרו ממטר אחד של תיל בעובי קבוע של 0.003 inches. כדי למדוד את התיל, הדביקו אותו בסרט דביק לסרגל מטר.כדי לסייע בהשגתו במצב ישר ככל האפשר. שקלו את חוט המתכת באורך מטר אחד וגזרו אותו במדויק לחתיכות של 1 cm. כופפו מספר חתיכות מהחוט לצורת אגרטל.כיול מחטי התיל דורש מיקרוסקופ דיסקסיה עם סרגל מדידה אנכי ומיקרו-מניפולטור. המיקרוסקופ מוטה ב-90 מעלות הצידה. השתמש במעמד בומי (boom stand) אוניברסלי, כדי שניתן יהיה לצפות בהסטה כלפי מטה של מחט התיל.התקן את מחט התיל בתוך מחזיק כלים על מיקרו-מניפולטור כך שתהיה ניצבת לציר האופטי של המיקרוסקופ. יישר את וו מחט התיל עם סימון רדיאלי. תלה את המיקרו-משקולת של 1 cm על הוו ורשום את הסטייה.קבוע הכפיפה של תיל הייחוס שווה למסה של המשקל המיקרוסקופי חלקי הסטייה שנצפתה. לאחר הכיול, הכינו את המחט לשלב הבא על ידי חיתוך הוו בנקודת הציון באמצעות להב תער, כדי לכייל את מחטי הזכוכית הביניים. נדרש מיקרוסקופ הפוך עם עדשה אוקולרית.בצד אחד של משטח המיקרוסקופ נמצא מיקרו-מניפולטור מכני המשמש להחזקת מחט התיל. בצד השני נמצא מיקרו-מניפולטור הידראולי המשמש להזזת מחט הזכוכית הבינונית. יש לכייל את המיקרו-מניפולטורים ולהביא את שתי המחטים יחד למרכז השדה האופטי בזווית של 45 מעלות, בתוך צלחת פטרי עם מים בגודל 160 מילימטר על 30 מילימטר, בשדה הגדלה של 10x. לאחר מכן, בצע סדרה של הסטות עבור כל אחת מהסטות אלו.יש להבחין בכמות הסטייה הראשונית ובמיקום אפס העומס הסופי של מחט הזכוכית לאחר השחרור. פעולה זו יוצרת 10 זוגות של נקודות נתונים. כדי להכין את 10 זוגות הנתונים עבור רגרסיה לינארית, יש להפחית את הסטייה הראשונית מהמספר השני של הזוגות הרשומים.הוסיפו חמישה זוגות בקרה של אפס-אפס ל-10 זוגות הנתונים הניסיוניים כדי לעגן את הרגרסיה הליניארית באפס, המהווה סטייה אפסית בכיול של כוח אפס. חשבו את הרגרסיה הליניארית עם 15 זוגות נתונים אלו.קבוע הקפיץ של מחט הזכוכית הביניים שווה לקבוע הכפיפה הידוע של מחטי התיל חלקי השיפוע של קו הרגרסיה. לאחר מכן, כייל את מחט הזכוכית העובדת מול מחט הזכוכית הביניים כפי שתיארנו acabado. ניתן לקצר מעט מחט זכוכית שקוטרה קטן משני מיקרון למיקרומטר כדי להביאה לטווח קשיחות מתאים.לחצו את המחטים המיועדות לציפוי לתוך גוש חימר המוחזק מעל כוס כימית של 10 מיליליטר המכילה את תמיסת גורם ההצמדה, כך שרק קצה המחט יטבול בתמיסה באופן סיקוונציאלי. טבלו את המחטים בתמיסת 0.1% polylysine למשך 30 דקות. לאחר מכן, טבלו את המחטים ב-conval and a למשך 30 דקות, תוך כדי טיפול במחטים בגורמי הצמדה.הפעילו את האינקובטור או את מערכת החימום של בסיס המיקרוסקופ, כך שהבסיס יגיע לשיווי משקל תרמי. תחנת העבודה למתיחה על שולחן בידוד רעידות מורכבת ממיקרוסקופ הפוך המצויד במניפולטור הידראולי המחזיק זרוע הארכה מותאמת עם משקל נגדי, שבה מוכנס מחזיק הכלים הכפול.הכנס מחט ייחוס שאינה מכוילת למחזיק מחטים כך שתבלוט באופן מקסימלי. הנח מכלול זה בצד ימין של מחזיק הכלים הכפול. לאחר מכן, הכנס את מחט העבודה המטופלת למחזיק מחטים כך שתבלוט למחצית מהמרחק של מחט הייחוס, והנח אותה בצד שמאל של מחזיק הכלים הכפול.כווננו מראש את המיקרו-מניפולטור ההידראולי כך שהבקרה האנכית תהיה במצב הגבוה ביותר. לאחר מכן, קרבו את שני קצות המחטים זה לזה באמצעות בורג הכיוון הצידי. מקמו את המחט.לכן, יש לבחון את הצמד מהצד בעין ולהשתמש בבורג הכיוון למעלה-למטה כדי להביא את הקצוות לאותו מישור. סובב את מחזיק הכלי והנח את קצוות המחטים בנתיב האור מעל פני המצע. הורד אותם בזווית תקיפה.הדקו את בורג מפרק הכדור בבסיס. התמקדו כלפי מעלה מעל התאים בתחתית הכלי בעזרת עדשה של 10x. הורידו את המחטים אל תוך המצע כדי למצוא את קצות המחטים בשדה הראייה של המיקרוסקופ.לפני שמורידים אותם עמוק מדי אל תוך צלחת התרבית, הזיזו את המחט מצד לצד, לאחור או קדימה, וחפשו את הצל שלה. ברגע שמחט נראית בשדה הראייה, סובבו את בורג התנועה מצד לצד כדי לזהות באיזו מחט מדובר.אם המחט זזה יחד עם הבורג, זוהי מחט הייחוס. אם היא אינה זזה, זוהי המחט המכוילת. לאחר איתור שתי המחטים, השתמשו בבקרים העדינים של מחזיק הכלי הכפול כדי ליישר אותן.המטרה היא שהמרחק בין קצות המחטים יהיה כ-50 µm, או כאינץ' אחד על המסך. הסימן לייחוס צריך להיות גבוה יותר מעל כלי התרבית ולכן מעט מחוץ למיקוד. כאשר מחט הגרירה נמצאת במיקוד על הכלי, הקליטו את התמונה של מיקום כיוון סופי זה.המרחק שבו המחטים מופרדות מהשנייה הוא מרחק הייחוס אפס. הרם את המחטים מעל מישור הדגימה והנח אותן בשולי השדה הראוי. בחר אקסון לניסוי בהתאם להנחיות בפרוטוקול הכתוב.העבירו את המחטים קרוב לאפית הצמיחה של האקסון ורשמו שוב את מרחק האפס. לאחר מכן, הרימו את שולחן בידוד הרעידות כדי להניח אפית צמיחה על המחט. מקמו את מחט הגרירה לצד אפית הצמיחה מתחתיה, ולאחר מכן הורידו את המחט אל תחתית הצלחת.פעולה זו תגרום למחט להטות כלפי מעלה, להתכופף ולהחליק לאורך הצלחת אל תוך קו הצמיחה (growth cone), ולאחר מכן להוציא את קו הצמיחה ממקומו ולהסיטו כלפי מעלה. לחץ את המחט אל תחתית הצלחת רק במידה מספיקה כדי שקו הצמיחה יינעל סביב קצה המחט, אך לא עד כדי כך שיהחליק מעל המחט ויגליש לאחור. המתן 20 דקות כדי לאפשר לאחיזה להתבסס.כאשר קונו הגדילה נמצא על המחט, הפעילו עליו מתח קל. על ידי הזזת המחט ימינה והרמה קלה שלה, פצו על תנועת המחט כלפי מטה על ידי הזזתה מעט קדימה בזמן ההרמה. הרמו את המחט בשלבים עד שהבליטה המחוברת נמתחת בניצב למחט ומעל פני השטח של הצלחת. הגרירה מתבצעת על ידי הזזת המחט הרחק מגוף התא.במרווחי זמן קטנים, הכוחות נצפים כרווח גדל בין המחטים תוך הגברת הדרגתית של המתיחה. יש לעקוב בזהירות אחר כל סימן לניתוק של קו הצמיחה מהמחט. יש לשמור על מפלס המצע בצלחת על ידי הוספת מים מדי שעה כדי למנוע התאיידות.השתמשו בסימון בצד הכלי כדי לציין את העומק ההתחלתי, והוסיפו לאט מים לצד הכלי, הרחק מהמחטים, באמצעות פיפטה. לפני הרמת המחטים מהכלי, בדקו שוב את מרחק האפס. קראו את מיקומי המחטים לאורך הציר האופקי שעל המסך.תעדו בנוסף את מיקום גוף התא ואת הזמנים שבהם מרחק ההפרדה של המחטים פחות מרחק האפס ללא עומס, כשהם מוכפלים בקבוע הכפיפה של המחט, שווים למיקרונים של הכוח המופעל. מוצג כאן דוגמה לשדה של תאים עם מספר אפשרויות אפשריות לשליטה על התפתחות אקסונית. האקסון האופקי עם קונית צמיחה גדולה הוא בחירה טובה.גוף התא ממוקם סמוך לקצה המסך והמחטים מובאות קרוב לקיסוט הצמיחה (growth cone). נלקחת תמונה של המרחק בין המחטים לפני ההעמסה, המהווה את נקודת אפס של המרחק. לפני תחילת הניסוי, מחט הגרירה מונחת כנגד קיסוט הצמיחה כדי לבחון אם ניתן להשיג היצמדות ספונטנית.לאחר מכן, דוחפים את המחט מעט יותר לתוך קו הגדילה. תמרון הדחיפה כלפי מעלה מבוצע על ידי הורדת המחט לעבר תחתית הצלחת, מה שגורם למחט להתכופף ולהחליק לתוך קו הגדילה ולנתקו. כמו כן, נוספה כמות קטנה של מתיחה קדימה.לאחר 15 דקות, נראה כי האקסון התארך בעקבות תנועת המחט קדימה. לאחר מכן, מתווסף מתח נוסף למחט הגרירה ומתחיל תהליך הרמת המחט. מתח נוסף מתווסף, כפי שניתן לראות מהריחוק הגדל בין המחטים.בשלב זה, ניתן לראות בבירור שהאקסון מתארך. מחט הייחוס לא זזה קדימה, אך האקסון גדל לכיוונה, ובכך הפחית את המתיחות. כמו כן, המחטים הועלו מעט.כאן, מתווסף מתח נוסף למחט הגרירה. צמיחה משמעותית התרחשה בתגובה למתח שהופעל על מחט הגרירה הכפופה. בסיום הניסוי, מבוצעת בדיקת אפס סופית.התהליך כולו מוצג ברצף time-lapse זה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן כיול המחטים, העברת קוניות גדילה אל על מחט ומדידת הכוחות במהלך הארכת אקסון.

mechanical-manipulation-of-neurons-to-control-axonal-development

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שיטה ייחודית בהנדסת רקמות פותחה כדי להאריך סיבי עצב רבים בתרבות ידי משחזרת למתוח צמיחה האקסון, סוג של גידול במערכת העצבים לפיה עצבים להאריך בשילוב עם צמיחה של הגוף והרחבת.

אקסון צמיחה מתיחה: Mechanotransduction הצמיחה העצבית

המחקר הגנטי של הדור הבא אקסון עם נוירונים בתרבית למבוגרים הגנגליון הגב שורש

המורפוגנזה ונדידת נוירונים הן אירועים מכריעים שבבסיס התפתחות מוח תקין. כאן אנו מתארים שיטות לתמרן גנטי נוירונים בתרבית המוח הקטן גרגיר והמוח קטן מתפתח להערכה של מורפולוגיה ומאפייני נדידה של תאי עצב.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

שני פוטונים הדמיה, מצמידים את nanodissection לייזר, הם כלים שימושיים ללמוד תהליכים ניווניים ומשובים במערכת העצבים המרכזית עם הרזולוציה subcellular. פרוטוקול זה מראה כיצד לתייג, תמונה, ולנתח סיבי טיפוס בודדים בקליפת המוח הקטן in vivo.

Nanosurgery הלייזר של האקסונים Cerebellar<em&gt; בVivo</em

טכניקות מיקרוסקופ אור בשילוב עם מבחנים ביוכימיים מבהירים את המעורבות של אקסוציטוזיס בתיווך SNARE בהסתעפות אקסונים תלויי נטרין. שילוב טכניקות זה מאפשר זיהוי של מנגנונים מולקולריים השולטים בהסתעפות האקסון ובשינוי צורת התא.

ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של נוירונים של גנגליון שורש הגב (DRG) שבודדו מחולדות ואת התרבית של נוירוני DRG על מערכת תרבית תאים סטטית מתוחה מראש כדי לשפר את יישור האקסונים, עם תרבית משותפת של תאי שוואן (SCs) כדי לקדם מיאלינציה.

גישת שפר מערך myelination של נוירונים שורש הגבה גנגליון

כתב היד הזה מפרט את ייצור של רקמות מיקרו- רקמות מהונדסות ברשתות עצביות: מבנים תלת-מימדיים בגודל מיקרון המורכבים משטחים אקסונליים ארוכי טווח המקיפים אוכלוסייה נוירונית מצטברת (s), המצופים בהידרוגול צינורי. אלה הפיגומים החיים יכולים לשמש ממסרים תפקודית לשחזר או לווסת מעגלים עצביים או כמו מיטות בדיקה ביופידלית מחקה נוירונטומי חומר אפור לבן.

אנטומיה השראה תלת מימדי מיקרו רקמות מתוכנן רשתות עצביות עבור שחזור מערכת העצבים, אפנון, דוגמנות

הליך זה מתאר כיצד במהירות ליזום, להרחיב ולחבר neurites מאורגן בתאי microfluidic באמצעות poly-D- ליזין מצופה חרוזים קבוע micropipettes כי מדריך התארכות neurite.

Reiring מעגלים נוירונים: שיטה חדשה להארכה Neurite מהיר חיבור פונקציונלי העצבית

מבחני צמיחת עצבים מספקים ערך כמותי על תהליכים עצביים רגנרטיביים. היתרון של תוכנה חצי אוטומטית זו הוא שהיא מחלקת גופי תאים ונוירוטים בנפרד על ידי יצירת מסכה ומודדת פרמטרים שונים כגון אורך נוירוט, מספר נקודות הסתעפות, שטח אשכול תא-גוף ומספר אשכולות תאים.

סטנדרטיזציה של תוכנה חצי-אוטומטית חדשנית למדידת צמיחת עצבים 

פרוטוקול זה מתאר מערכת מיקרופלואידית המדגמנת דינמיקה מטבולית עצבית לאחר פגיעה אקסונלית, המאפשרת הדמיה, ניתוח מולטי-אומיקס ומחקרים מכניסטיים של שיפוץ מטבולי מהותי.

שבב מיקרופלואידי עבור מודלים של פגיעות אקסונליות בנייה ומאפשר ניתוח מולטי-אומיקס

למד מניפולציה מכנית של נוירונים לבקרת התפתחות אקסונלית באמצעות מחטי זכוכית כיוליות. שיטה זו מאפשרת מדידת כוחות בטווח המיקרודין והבנת הביופיזיקה של הארכת אקסונים.

מניפולציה מכני של נוירונים שליטה פיתוח axonal

גלה סרטונים נוספים