כלי אנליטי תיבת להערכת ביוכימיים, מבנית Transcriptome מקיף של Biofilms אוראלי בתיווך Mutans streptococci

ביופילמים הנוצרים על משטחי שיניים הם מורכבים ומובנים ביותר. קהילות מיקרוביאליות כלואות במטריצה חוץ-תאית, החשופות לאתגרים סביבתיים מתמידים. המטרה הכוללת כאן היא להראות שני מרכיבים ספציפיים של ארגז כלים אנליטי שנועד להקל על מחקרים מבניים ומולקולריים, בהתחשב באופי המורכב של ביופילמים אוראליים על ידי שילוב טכניקת הדמיה פלואורסצנטית חדשה עם תוכנה מותאמת אישית לעיבוד וניתוח נתונים.

זה מושג על ידי בחירה תחילה של בדיקות ספציפיות לניתוח ביופילם, טרנסקריפטום ומבנה, כולל גישת הדמיה קונפוקלית חדשה להדמיה בו-זמנית של EPS וחיידקים. השלב השני של ההליך הוא איסוף הנתונים הגולמיים מהבדיקות הביולוגיות. השלב השלישי הוא לעבד את הנתונים הגולמיים באמצעות תוכנה ספציפית, כולל ה-duo stat החדש שפותח לניתוח לוקליזציה.

השלב האחרון הוא ניתוח נתוני התהליך, כולל שימוש במיקרו-מערך כריית נתונים ומיקרו-מערך תוכנה לארגון, ויזואליזציה של נתונים או MDV. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות כיצד פתוגנים אוראליים משנים את הטרנסקריפטום שלהם ואת הארכיטקטורה של הביופילמים בתגובה לתזונה מורכבת, מארחים אינטראקציות מיקרוביאליות באמצעות ארגז הכלים האנליטי המשולב הייחודי שלנו, המספק ניתוח ביופילם מקיף יותר ופרשנות נתונים. היי, שמי מישל קו, פרופסור חבר במרכז לביולוגיה פוראלית כאן במרכז הרפואי יוניברסל אוף רוצ'סטר.

היום אנו מציגים ארגז כלים אנליטי לניתוח ביופילם. ארגז כלים זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר הביופילם כמו כיצד תאי הביופילם בנויים, מסודרים עם מטריצה חוץ-תאית וכיצד הם מגיבים לאתגרים סביבתיים מורכבים ברמת הטרנסקריפטומיקה. שמי ג'ין, היא, אני פוסט-דוקטורנטית במעבדת ד"ר ק.

היום אני הולך להדגים את חלק ההדמיה בארגז הכלים שלנו. היי, אני אייס קליין. אני עוזר פרופסור מחקר במעבדת Dr.Ks.

היום אציג את תוכנת MDV לניתוח נתוני מיקרו-קרניים. בהליך זה, דיסקי תיאבון הידרוקסיים מצופים רוק משמשים כתחליפים על פני השן שעליהם מגדלים ביופילמים. ראשית, הוסף 2.8 מיליליטר של מדיום תרבית מחוסן במוטציות S בכל באר של צלחת 24 בארות המגנה על הצלחת מפני אור בצבע LOR 6 47 מצומד דקסטרין לכל באר לריכוז סופי של מיקרומולר אחד ופיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב את הצבע לתוך מדיום התרבית.

לאחר מכן, באמצעות טבילת מלקחיים סטריליים, שטפו את דיסקיות ההידרוקסיאפטיט הסטריליות המצופות רוק פעמיים במאגר AB סטרילי כדי להסיר עודפי רוק או רכיבי רוק לא קשורים. לאחר מכן הנח את הדיסקים אנכית במדיום התרבית בתוספת הצבע, וודא שכל דיסק שקוע במלואו. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום ודוגרים אותה בחום של 37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו חמצני של 5% למשך 20 שעות כדי לאפשר לביופילם להיווצר ולשלב את המרקם המצומד בפוליסכרידים האקסו המיוצרים על ידי תאי החיידקים.

כדי לתייג תחילה את תאי החיידקים, הכינו צלחת של 24 בארות עם 2.8 מיליליטר מים סטריליים של מילי Q לבאר. הוסף 1.5 מיקרוליטר של צבע cyto nine לכל באר לריכוז סופי של מיקרומולר אחד והגן על הצלחת מפני אור. לאחר היווצרות הביופילם, הוציאו את הצלחת המכילה את הדיסקים מטבילת האינקובטור.

שוטפים כל דיסק בתמיסה של 0.89% נתרן כלורי. לאחר מכן העבירו אותם לצלחת החדשה המכילה את צבע הציטו תשע. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום ומדגרים אותה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר שהתאים הוכתמו, שטפו את הביופילמים והנתרן הכלורי כמו קודם. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, שחררו את הביופילמים מהחוט לתוך צלחת פטרי המכילה נתרן כלורי. עוטפים את צלחת הפטרי בנייר אלומיניום.

הביופילמים מוכנים כעת להדמיה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. סרוק כל ביופילם בחמישה עד 10 מיקומים שנבחרו באופן אקראי וצור סדרת Z בכל מיקום. כדי לאפשר שחזורים תלת מימדיים, פתח את התמונות הקונפקוליות ועבד אותן באמצעות תוכנת מראה.

עיבוד תלת מימדי זה של תמונות קונפוקליות שהופקו באמצעות התוכנית, אמירה מציגה ביופילם מוטנטי S שנוצר על פני השטח האפאתי באמצעות ההליך המודגם. תאי חיידקים ומושבות מיקרו נראים בירוק ומשובצים במטריצת הביופילם המכילה פוליסכרידים אקסו. באדום, ניתן ליצור מבט מקרוב על אזור נבחר, הממחיש את הקשר המבני של חיידקים ספציפיים EPS בקנה מידה מיקרו.

השתמש בתוכנית הסטטיסטיקה של duos כדי לכמת את כמות הקולוקליזציה של רכיבי ביופילם נפרדים כגון החיידקים והפוליסכרידים האקסו. ראשית, הגדר את הנתיב של הסטטיסטיקה הכפולה החדשה שפותחה ב-MATLAB גרסה 5.1 ופתח את תיקיות התמונות המכילות את התמונות מסדרת Z של שני רכיבי הביופילם. לאחר מכן, בחר שני ערוצים שיתואמו וינותחו.

שתי אוסמות התמונות חייבות להיות בגודל פיקסלים זהה בכל הממדים ומספר זהה של תמונות בכל אוסף. הגדר את הספים עבור כל ערוץ ופעל לפי ההוראות בממשק התוכנה והזן את הנתונים לקובץ עיבוד הנתונים לניתוח. איור זה מראה כיצד Duo stack מפרש כמותית את הקשר המרחבי בין חיידקים ל-DBS.

בתוך הביופילם Duo stack מחשב את ההתפלגות האנכית של חיידקים ו-DPS ממשטח הדיסק לשלב הנוזל כפי שניתן לראות כאן בקו הירוק עבור חיידקים והקו האדום עבור EPS. הוא גם מחשב את הקולוקליזציה של חיידקים ו-DPS על פני עובי הביופילם. כפי שמוצג בקו הצהוב, הנתונים מראים פרופורציות גבוהות יותר של EPS מאשר חיידקים על פני עומק הביופילם, ורוב תאי החיידקים קשורים ל-EPS, במיוחד מהשכבות האמצעיות ומעלה Duo stat עם עיבוד תלת מימד מספק הבנה משופרת של הארגון המבני והאינטראקציה של חיידקים ו-DPS בביופילמים.

על מנת להבטיח ש-RNA באיכות גבוהה מתקבל מביופילמים, אנו ממליצים לבצע מיצוי RNA על פי הפרוטוקול הספציפי לביופילם המתואר במאמר של Curian KU שפורסם ב-2007. בכתב העת, פרוטוקולים סטנדרטיים של ביוכימיה אנליטית משמשים להכנת מיקרו-מערך CD NA ומבחני PCR כמותיים בזמן אמת. על מנת להקל על ניתוח מערכי הנתונים הגדולים שנוצרו על ידי ניסויי מיקרו-מערך, עיצבנו תוכנת כריית נתונים וארגון, ה-microarray data visualizer או MDV, הזמינה באינטרנט ב-www.oralgen.anl.gov.

לפני הגשת הנתונים ל-MDV, בצע ניתוח סטטיסטי כמו מבחן T מזווג עם מודל שונות אקראית באמצעות תוכנת כלי המערך BRB הזמינה באינטרנט עם ערך P חתך של 0.001 להשוואת מחלקות. בניתוח דוגמה זו של בשר כבש, בוצעו ביופילמים שגדלו בשלושה ריכוזי סוכר שונים וארבע נקודות זמן. השוואות זוגיות בוצעו שמקורן בשלושה קבצי BRB, מצב של 0.5% סוכרוז בתוספת 1% עמילן לעומת 1% סוכרוז B, 0.5% סוכרוז בתוספת 1% עמילן לעומת 0.5% סוכרוז ומצב C 0.5% סוכרוז לעומת 1% סוכרוז

פאנל זה מייצג את מספר הגנים שזוהו כמתבטאים באופן דיפרנציאלי בכל מצב ונקודת זמן המוערכים על ידי השוואת מחלקות סטנדרטיות באמצעות כלי מערך BRB, מה שמביא למספר רב של גנים בשם BRB נתונים גולמיים. להדגמה של MDV, נתמקד בנקודת זמן של 30 שעות באמצעות Excel. המר את הנתונים הגולמיים של BRB לקבצי טקסט מוגבלים בכרטיסיית MDV.

הקפד להסיר את כל האותיות המצורפות למספר כרטיסיית מיקום הגן, למשל בשם SMU נקודה 1432 C.מחק את האות C, פתח את MDV. פתח את תפריט הקובץ ובחר בחר מקור הערות. בחר באפשרות הקובץ השטוח כאשר מופיעה תיבת דו-שיח.

השתמש בלחצני העיון כדי לבחור את הקבצים המכילים ביאורים עבור אונטולוגיה של גנים, מסלול, מסלול, נתוני סיווג פונקציונלי ושם גן. עבור לקובץ וייבא כל אחד מהקבצים שהומרו לפורמט MDV. כל קובץ מייצג תנאי ניסוי.

השווה את הגנים המתבטאים בכל מצב ניסוי A לעומת B לעומת C.In דוגמה זו, באמצעות תכונת דיאגרמת ון. לצורך הדגמה זו, אנו מתמקדים בגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי הקשורים באופן ייחודי להשפעות של סוכרוז ועמילן בשילוב. התכונה המבוססת על דיאגרמת ון משמשת להמחשת מספר הגנים הייחודיים והמשותפים המתבטאים בתנאים שונים אלה ומסייעת לנו בזיהוי אלה שייבחרו לניתוח נוסף.

כאן אנו בוחרים רק את הגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי שהם ייחודיים במצב A ו-או B, אך לא את אלה שזוהו ב-C כפי שמוצג באפור כפי שמוצג כאן. MDV הפחית מאוד את המספר הכולל של הגנים שיש לנתח, ובמקביל סינן החוצה את הגנים הלא רלוונטיים למקרה הניסוי. מתפריט הקובץ, בחר באפשרות הייצוא לשמירת הנתונים.

כקבצים מוגבלים בכרטיסיות, ניתן לפתוח את הקבצים באקסל שם ניתן לארגן ולהמיר את פלט הנתונים לתצוגות הגרפיות הרצויות. ארגון הנתונים באקסל מאפשר תצוגה גרפית של פלט MDV. גרף זה מציג סקירה כללית של הביטוי הדיפרנציאלי של תת-קבוצות פונקציונליות ייחודיות של גנים המושפעים משילוב של עמילן וסוכרוז בשלבים שונים של התפתחות ביופילם.

ההשפעות על הטרנסקריפטום של מוטציות S בולטות יותר ב-30 שעות של התפתחות ביופילם מאשר בנקודות זמן אחרות. הפלט עזר לנו לזהות במדויק תת-קבוצות פונקציונליות ספציפיות של גנים הרלוונטיים להשערת העבודה שלנו, בהתחשב בהשפעות הזמניות שהקלו על בחירת הגנים ותהליך אימות נוסף. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע גם שיטות ביוכימיות ופרוטאומיות כדי לענות על שאלות נוספות כגון מהן התגובות הפיזיולוגיות והמטבוליות הספציפיות של האורגניזמים בתוך ביופילמים.

ניתוח מקיף ומשולב כזה בהחלט יעזור להבין עוד יותר כיצד הביופילמים מווסתים את הפתוגניות בחלל הפנימי, סביבה דינמית ומורכבת ביותר. לפרטים נוספים, אנא בדוק את קובץ ה-PDF המצורף למאמר וידאו זה.