בידוד של תאים אפיתל עכבר הנשימה וחשיפה לעשן סיגריות בבית ניסויית ממשק האוויר נוזלי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי אפיתל של דרכי הנשימה על מנת לחקור את ההשפעות הרעילות של חשיפה לעשן סיגריות. זה מושג תחילה על ידי ניתוח קנה הנשימה של העכבר ולאחר מכן עיכול קנה הנשימה בתמיסת פרונאז. השלב השני של ההליך הוא איסוף תאי אפיתל והפצת תרבית המטבעות.

השלב השלישי הוא להבדיל בין התרבויות בממשק נוזל אוויר. השלב האחרון של ההליך הוא חשיפת תאי אפיתל לעשן סיגריות אפיקליות בממשק נוזל האוויר. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות שכבה חד-שכבתית מובחנת לחלוטין של תאי אפיתל על ידי מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלות ריאה חסימתיות כרוניות, כגון ההשפעות של חשיפה לעשן סיגריות על מורפולוגיה של CLIA וסמנים ביוכימיים הנגרמים מעשן סיגריות לפגיעה בתאים. התחל בהכנות להליך זה יום לפני הנתיחה על ידי הכנת בשר חזיר. F 12 מדיה המכילה אנטיביוטיקה Hams F 12 מדיה המכילה אנטיביוטיקה ו-20% F-B-S-M-T-E-C, מדיום בסיסי המכיל אנטיביוטיקה.

מדיום MTEC עם תמיסה אחת של 5% FBS DNA תמיסות מלאי חומצה רטינואית ומדיום התפשטות MTEC על פי ההוראות בפרוטוקול הכתוב. עקר את כל הכלים הכירורגיים שישמשו בדיסקציה ביום הדיסקציה. ודא שאזור החיתוך נקי ושכל כלי החיתוך נמצאים בהישג יד.

עקר את מכסה המנוע של תרבית הרקמות. ואז עובד במכסה המנוע של תרבית רקמות. הכן תמיסה של 0.15% פרונאז.

הוסף 15 מיליגרם פרונאז ל -10 מיליליטר בשר חזיר. F12 חומר המכיל אנטיביוטיקה בשפופרת חרוטית של 50 מיליליטר. מניחים על קרח עד השימוש.

קנה הנשימה של עכברים מנותח מעכברים באמצעות פרוצדורות כירורגיות סטנדרטיות, מחטאים את הצינור המכיל את קנה הנשימה ומניחים במכסה המנוע של תרבית הרקמות. העבירו את רקמת קנה הנשימה לצלחת פטרי בגודל 100 מילימטר עם בשר חזיר F 12 המכיל אנטיביוטיקה. השתמש במלקחיים כירורגיים סטריליים כדי להסיר את רקמת החיבור מקנה הנשימה.

לאחר מכן העבירו את קנה הנשימה הנקי לצלחת הפטרי השנייה בגודל 100 מילימטר המכילה בשר חזיר. F 12 מדיה עם אנטיביוטיקה. השתמש במספריים לדיסקציה כדי לחתוך את קנה הנשימה לאורך הציר האנכי ולחשוף את הלומן.

העבירו את קנה הנשימה לצינור החרוטי של 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר תמיסת פרונאז והכניסו למקרר לדגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לבסוף, הכינו צלחות טרנסוול שטופלו בקולגן אחד לשימוש. למחרת, הוסף 50 מיליגרם קולגן, אחד למיליליטר של 0.02 N חומצה אצטית פיפטה מיליליטר אחד של תמיסה זו לכל באר של 12.

ובכן צלחת באר טרנס. עטפו את הצלחת בניילון פרה ובואו נעמוד לילה בטמפרטורת החדר במכסה המנוע של תרבית הרקמה. למחרת.

הפוך בעדינות את הצינור המכיל את קנה הנשימה של העכבר 10 עד 12 פעמים. לאחר מכן אפשר לתכולת הצינור לדגור למשך 30 עד 60 דקות נוספות בארבע מעלות צלזיוס. עבודה במכסה המנוע של תרבית הרקמה 10 מיליליטר של בשר חזיר F 12 מדיה המכילה אנטיביוטיקה ב-20% FBS לתוך הצינור החרוטי המכיל את רקמת קנה הנשימה המעוכלת ולהפוך 12 פעמים.

לאחר מכן פיפטה 10 מיליליטר של בשר חזיר F 12 מדיה המכילה אנטיביוטיקה ב-20% FBS לכל אחד משלושה צינורות חרוטיים של 15 מיליליטר. השתמש בפיפטה פסטה סטרילית כדי להעביר את רקמת קנה הנשימה מתמיסת הפרונאז לראשונה מבין הצינורות המכילים בשר חזיר משלים. מדיה F 12.

הנח את תמיסת הפרונאז על מכסה הקרח את הצינור המכיל את רקמת קנה הנשימה והפוך בעדינות 12 פעמים לערבוב. לאחר מכן בעזרת פיפטת הפסטה, העבירו את רקמת קנה הנשימה לצינור החרוטי השני של 15 מיליליטר והפכו את הצינור הזה 12 פעמים. חזור על הליך ההעברה וההיפוך באמצעות הצינור החרוטי הסופי של 15 מיליליטר.

לבסוף, השתמש בפיפטת הפסטה כדי להסיר ולהשליך את רקמת קנה הנשימה. לאחר מכן שלף את תמיסת הפרונאז מהקרח ושלב את שלושת נפחי ה-15 מיליליטר של מדיה F-12 בתוספת עם תמיסת הפרונאז. צנטריפוגה הדגימה בצנטריפוגה המצוננת בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב-1,400 סיבובים לדקה לאחר הצנטריפוגה השליכה את הסופנה, ואז פיפטה כ-100 עד 200 מיקרוליטר של DNA, תמיסה אחת לכל קנה הנשימה על הגלולה וראוס.

השעו בהקשה עדינה. דגרו את התאים על קרח למשך חמש דקות. צנטריפוגה של הצינור ב-1,400 סיבובים לדקה למשך חמש דקות של ארבע מעלות צלזיוס והשליכו את הסופינאט.

לאחר מכן פיפטה שמונה מיליליטר של מדיום MTEC המכיל 10% FBS על הגלולה ותלייה מחדש. מתלה התא על צלחת פאריה מודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 95% אוויר ו-5% פחמן דו חמצני למשך חמש עד שש שעות. זהו שלב בחירה שלילי להסרת פיברובלסטים.

לאחר הדגירה, יש לאסוף את תרחיף התאים מלוח הפריה ולהכניס פיפטה לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר מכן שטפו את הצלחת פעמיים עם ארבעה מיליליטר מדיום MTEC המכיל 10% FBS. העבירו את שתי השטיפות לצינור החרוטי של 50 מיליליטר המכיל את מתלה התאים.

פיפטה מיליליטר אחד של תרחיף התא לתוך צינור עינור. שמור את האליקוט הזה לניתוח ספין ציטו וצנטריפוגה לספירת תאים. הצינור החרוטי של 50 מיליליטר המכיל את 15 המיליליטר הנותרים של תרחיף התאים הם 1,400 סיבובים לדקה בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

במהלך הצנטריפוגה, הסר והשליך את תמיסת הקולגן מצלחת הטרנסוול שהוכנה בעבר. השאירו את הצלחת לייבוש מתחת למכסה המנוע למשך חמש דקות, ולאחר מכן שטפו פעמיים עם PBS לאחר הכביסה הסופית. שאפו את כל ה-PBS והפיפטה 1.5 מיליליטר של אמצעי התפשטות לתוך התא הבסיסי של באר הטרנס לאחר צנטריפוגה.

השליכו את ה-supinate והשעו מחדש את גלולת התא בנפח מתאים של אמצעי התפשטות כדי להקל על ציפוי של 7.5 פעמים 10 לארבעה עד אחד כפול 10 לחמשת התאים ב-500 מיקרוליטר תרחיף לבאר. פיפטה 500 מיקרוליטר של תרחיף תאים על פני השטח האפיקליים של קרום הפוליקרבונט הטרנס-עולמי. להוסיף. דגרו את תרביות ה-MTEC השקועות ב-37 מעלות צלזיוס בחממה לחה המכילה 95% אוויר ו-5% פחמן דו חמצני למשך שבעה עד 10 ימים עם החלפת מדיה כל יומיים.

מדוד את התנגדות תאי האפיתל הטרנס באמצעות אינטרוולומטר. כאשר התנגדות האפיתל מגיעה ל-1000 אוהם לסנטימטר בריבוע והתרבויות נראות מתלכדות. המר לתרבות LI על ידי הסרת המדיה האפיקלית.

החלף גם את החומר הבסיסי בחומר בסיסי MTEC המכיל 2% סרום חדש וחומצה רטינואית. דגרו על התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 10 עד 14 ימים כדי לאפשר בידול עם החלפת מדיה כל יומיים. ראשית, הגדר את מכונת העישון על פי הוראות היצרן.

רשום את המשקל של מסנן מוט גמיש שאינו בשימוש. לאחר מכן הנח את המסנן במחזיק הנירוסטה המוטבע על צינור הדגימה המוביל מיציאת הדגימה בתא העישון למשאבת הזרימה הקבועה. חבר את יחידת הדגימה למד הגז באמצעות צינור יציאה באמצעות מערכת חשיפה לתאי CS.

חשוף את הצד האפיקלי של תרבויות טרנס-עולם לעשן סיגריות מיינסטרים משלוש סיגריות פילטר ייחוס מחקריות R ארבע F. חשוף את התאים לעשן מסיגריה אחת עד שתיים. חשוף תרביות בקרה לאוויר החדר לתקופת חשיפה שווה ערך לאחר עלייה במשקל של דגימת גז.

מסנן הבריכה הגמיש, החומר הכולל המופקד על המסנן במיליגרם מנורמל. עבור נפח האוויר הכולל שנדגם, העשן מסיגריה אחת עד שתיים מניב בדרך כלל 100 עד 200 מיליגרם למטר מעוקב של TPM. לאחר חשיפה לסיגריות, קצור את התאים ואת המדיה הבסיסית לניתוחים נוספים.

זוהי דוגמה לשכבה חד-שכבתית בריאה של תאי אפיתל נשימתיים של עכברים, כתם צבוע לתאי אפיתל גרעיניים, וסמני C. בידוד, התפשטות והתמיינות אפיתל מוצלחים משתמשים בשכבה חד-שכבתית שלמה עם מורפולוגיה מרוצפת אבן. התרביות הן למעשה נטולות פיברובלסטים.

תמונות מיקרוגרף אלקטרונים אלה מייצגות תרביות MTEC בריאות ומתארות את מבנה האולטרה של סוגי התאים השונים ואת המורפולוגיה של CELIA. סרטון הדמיית תאים חיים זה מציג מורפולוגיה בריאה של C של תרביות MTEC. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאי אפיתל קנה הנשימה של העכבר, להבדיל אותם בממשק נוזל אוויר ולחשוף אותם לעשן סיגריות מיינסטרים.