בידוד של תאים אפיתל עכבר הנשימה וחשיפה לעשן סיגריות בבית ניסויית ממשק האוויר נוזלי

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד תאי אפיתל של דרכי הנשימה כדי לחקור את ההשפעות הרעילות של חשיפה לעשן סיגריות. הדבר משיג תחילה על ידי נתיחת קשקשים של קשקשעי עכביש (tracheas) של עכברים, ולאחר מכן על ידי עיכול הקשקשים בתמיסת pronase. השלב השני של ההליך הוא איסוף תאי האפיתל והנחלת תרבית הנוזל.

השלב השלישי הוא בידוע גדילה של התרביות בממשק אוויר-נוזל (air liquid interface). השלב הסופי של הפרוצדורה הוא חשיפת התאים האפיתליאליים לעשן סיגריות מהצד האפקלי בממשק האוויר-נוזל. לבסוף, ניתן לקבל תוצאות המראות שכבה אחת (monolayer) של תאים אפיתליאליים מובחנים באופן מלא באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה.

שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום של מחלת ריאות חסימה כרונית, כגון השפעות החשיפה לעשן סיגריות על מורפולוגיית CLIA וסממנים ביוכימיים של פגיעה תאית המושרים על ידי עשן סיגריות. התחילו בהכנות להליך זה יום אחד לפני הניתוח על ידי הכנת מצעי hams F 12 המכילים אנטיביוטיקה, ו-20% F-B-S-M-T-E-C, מצע בסיסי המכיל אנטיביוטיקה.

מדיום MTEC עם 5% FBS, תמיסות מלאי של retinoic acid מ-DNA's one solution ומדיום proliferation ל-MTEC בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב. סטריליזציה של כל כלי הניתוח שבהם ייעשה שימוש ביום הניתוח. ודאו שאזור הניתוח נקי ושכל כלי הניתוח נמצאים בהישג יד.

סטריליזציה של מC-hood לתרביות רקמה. לאחר מכן, יש לעבוד בתוך ה-hood לתרביות רקמה. הכין תמיסה של 0.15% pronase.

הוסיפו 15 milligrams של pronase ל-10 milliliters של מצע hams. F 12 המכיל אנטיביוטיקה בתוך מבחנה קונית של 50 milliliter. שמרו על קרח עד לשימוש.

קשייות של עכברים מבודלות מעכברים באמצעות הליכים כירורגיים סטנדרטיים; חטא את המבחנה המכילה את הקשייות והנח אותה בתא תרביות רקמה. העבר את רקמת הקשייות לצלחית פטרי בקוטר 100 מילימטר עם מצע hams F 12 המכיל אנטיביוטיקה. השתמש בפינצטות כירורגיות סטריליות כדי להסיר את רקמת החיבור מהקשייות.

לאחר מכן, העבירו את הקנה הנקי לכלי פטרי שני בנפח 100 מילימטר המכיל מצע hams. F 12 עם אנטיביוטיקה. השתמשו במספרי ניתוח כדי לחתוך את הקנה לאורך הציר האנכי ולחשוף את הלומן.

העבירו את הקשראות לפסולת קונית של 50 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של תמיסת Pronase והניחו במקרר לדגירה למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לבסוף, הכינו פלטות Transwell שעברו טיפול בקולגן one לשימוש. למחרת, הוסיפו 50 מיליגרם של קולגן one לכל מיליליטר של 0.02 N acetic acid והעבירו באמצעות פיפטה מיליליטר אחד מתמיסה זו לכל באר ב-12.

יש להעביר את התמיסות לבארות של פלטת בארות. עטוף את הפלטה ב-para film והשאר אותה למשך הלילה בטמפרטורת החדר בתוך מramed התרביות (tissue culture hood). למחרת.

הפוך בעדינות את המבחנה המכילה את קשקשי הנשימה (tracheas) של העכברים 10 עד 12 פעמים. לאחר מכן, השאר את תוכן המבחנה להדגרה למשך 30 עד 60 דקות נוספות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. בעבודה תחת מ covered tissue culture hood, פפט 10 milliliters של מצע hams F 12 המכיל אנטיביוטיקה ו-20%FBS אל תוך המבחנה הקונית המכילה את רקמת הקנה שעברה עיכול, והפוך אותה 12 פעמים.

לאחר מכן, העבירו בעזרת פיפטה 10 milliliters של מצע hams F 12 המכיל אנטיביוטיקה ב-20%FBS לתוך כל אחת משלוש מבחנות קוניות של 15 milliliter. השתמשו בפיפטת פסטור סטרילית כדי להעביר את רקמת הקנה מתמיסת ה-pronase למבחנה הראשונה המכילה מצע hams F 12 מועשר.

הניחו את תמיסת ה-Pronase על קרח, סגרו את המכסה של המבחנה המכילה את רקמת הקנה והפכו אותה בעדינות 12 פעמים כדי לערבב. לאחר מכן, באמצעות פיפטת פסטור, העבירו את רקמת הקנה למבחנה קונית שנייה בנפח 15 מיליליטר והפכו מבחנה זו 12 פעמים. חזרו על פעולת ההעברה וההפיכה באמצעות המבחנה הקונית האחרונה בנפח 15 מיליליטר.

לבסוף, השתמשו בפיפטת פסטה כדי להסיר ולהשליך את רקמת הקנה. לאחר מכן, הוציאו את תמיסת ה-pronase מהקרח וערבבו את שלושת הנפחים של 15 milliliter של מצע hams F 12 מועשר עם תמיסת ה-pronase. סבבו את הדגימה בצנטריפוגה מקוררת בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות ב-1,400 rotations per minute; לאחר הסבוב, השליכו את העל-משקע (supena), ולאחר מכן העבירו בפיפטה כ-100 עד 200 µL של תמיסת DNA's one לכל קנה על המשקע וערבבו.

שַׁהֶה את התאים על ידי תיפוף עדין. דגירה של התאים בקרח למשך חמש דקות. סובב את המבחנה בצנטריפוגה במהירות של 1,400 סל"ד למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C והסר את העילוי.

לאחר מכן, טפטפו שמונה מיליליטר של מצע MTEC המכיל 10% FBS על המשקע והחזירו לסביבה של תרחף. את תרחף התאים בצלחת paria דגרו בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה של 95% אוויר ו-5% carbon dioxide למשך חמש עד שש שעות. זהו שלב ברירה שלילית להסרת פיברובלסטים.

לאחר הדגירה, אספו את תרחיף התאים מהצלחת פטרי והעבירו באמצעות פיפטה לשפופרת קונית של 50 מיליליטר. לאחר מכן, שטפו את הצלחת פעמיים עם ארבעה מיליליטר של מצע MTEC המכיל 10%FBS. העבירו את שני השטיפות לשפופרת הקונית של 50 מיליליטר המכילה את תרחיף התאים.

העבירו בעזרת פפטה 1 mL של תגלי התאים למבחנה מסוג einor. שמרו מנה זו לצורך ניתוח cyto spin וספירת תאים בצנטריפוגה. את המבחנה הקונית בנפח 50 mL המכילה את 15 mL הנותרים של תגלי התאים סובבו במהירות של 1,400 rpm בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות.

במהלך הסנטריפוגציה, הסירו והשליכו את תמיסת הקולגן מלוח ה-transwell שהוכן קודם לכן. השאירו את הלוח להתייבש תחת המבתור למשך חמש דקות, ולאחר מכן שטפו פעמיים עם PBS; לאחר השטיפה האחרונה, שאבו את כל ה-PBS והעבירו בעזרת פיפט 1.5 milliliters של מצע פרוליפרציה אל התא הבסיסי של ה-transwell לאחר הסנטריפוגציה.

שפכו את הנוזל העליון ותלוו מחדש את משקע התאים בנפח מתאים של מצע גידול להתרבות, כדי לאפשר זריעה של 7.5 times 10 to the four עד one times 10 to the five תאים ב-500 microliters של תרחף לכל באר. העבירו בפיפט 500 microliters של תרחף התאים אל פני השטח האפיקליים של ממברנת הפוליקרבונט של ה-transworld. דגרו את תרביות ה-MTEC השקועות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בתוך דגרה לחיתה המכילה 95% air ו-5% carbon dioxide למשך שבעה עד 10 ימים, עם החלפת מצע בכל יום שני.

מדוד את ההתנגדות התאי-אפיתליאלית באמצעות אינטרוולומטר (intervalometer). כאשר ההתנגדות האפיתליאלית מגיעה ל-1000 ohms per centimeter squared והתרביות נראות קונפלואנטיות (confluent), העבר אותן לתרבית LI על ידי הסרת המצע האפיקלי.

בנוסף, החליפו את המצע הבסיסי במצע MTEC בסיסי המכיל 2% סרום חדש וחומצה רטינואית. דגרו את התרביות בטמפרטורה של 37 °C ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 10 עד 14 ימים כדי לאפשר התמיינות, עם החלפת מצעים בכל יום שני. ראשית, הגדירו את מכונת העישון בהתאם להוראות היצרן.

רשמו את משקלו של פילטר pole flex שאינו בשימוש. לאחר מכן, מקמו את הפילטר במחזיק נירוק הכסתי המקוון (inline) על גבי צינור הדגימה המוביל מפתח הדגימה של תא העישון אל משאבת הזרימה הקבועה. חברו את יחידת הדגימה למד-הגז באמצעות צינור פליטה המשתמש במערכת חשיפה של תאי CS.

חשפו את הצד האפיקלי של תרביות ה-transworld לעשן סיגריות מהזרם המרכזי משלוש סיגריות פילטר למחקר מסוג R four F. חשפו את התאים לעשן של אחת עד שתיים סיגריות. חשפו תרביות ביקורת לאוויר החדר למשך פרק זמן חשיפה שווה לאחר עליית משקל של דגימת הגז.

במסנן גמיש (pool flex filter), כמות החומר הכוללת שהשקיעה על המסנן במיליגרמים עוברת נורמליזציה. עבור הנפח הכולל של האוויר שנדגם, עשן של סיגריה אחת עד שתיים מניב בדרך כלל 100 עד 200 מיליגרם למטר מעוקב של TPM. לאחר החשיפה לסיגריה, קצרו את התאים ואת המצע הבסיס (basal media) לצורך ניתוחים נוספים.

זוהי דוגמה לשכבה אחת (monolayer) בריאה של תאי אפיתל נשימתיים של עכבר, הצבועות עבור גרעין התא האפיתלי וסמני C. בידוד אפיתליאלי, פרוליפרציה ודיפרנציאציה מוצלחים מתבטאים בשכבה אחת שלמה בעלת מורפולוגיה של "cobblestone" (מראה רצפת אבנים). התרביות הן למעשה נקיות מפיברובלסטים.

תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים אלו מייצגות תרביות בריאות של MTEC ומתארות את העל-מבנה של סוגי התאים השונים ואת המורפולוגיה של CELIA. סרטון הדמיה של תאים חיים זה מראה מורפולוגיית C בריאה של תרביות MTEC. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים תאי אפיתל של קנה הנשימה של עכבר, מבצעים להם דיפרנציאציה בממשק אוויר-נוזל (air liquid interface), וחשיפתם לעשן סיגריות בזרם הראשי.