Name: בידוד של תאים אפיתל עכבר הנשימה וחשיפה לעשן סיגריות בבית ניסויית ממשק האוויר נוזלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-21T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: למדו לבודד תאים אפיתליים מקנה הנשימה של עכברים ולגדלם בממשק אוויר-נוזלי לחקר השפעות עשן הסיגריות. שיטה זו מאפשרת ניתוח תגובות תאיות לרעלים סביבתיים ומספקת מודל לחקר מחלות ריאה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Emeka Ifedigbo לקבלת סיוע טכני ד&quot;ר Shivraj Tyagi עבור המומחיות יקר. כמו כן, אנו מודים מרכז NeuroDiscovery הרווארד לסיוע עם מיקרוסקופ. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי איגוד הלב האמריקני Predoctoral מענק 09PRE2250120 אל הילר לם, ו-NIH מענקים, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, הוענק AMK צ&#39;וי.

פרוטוקול הכולל דורש 2 ימים isolations תאים מרקמות בעלי חיים, 5-10 ימים עבור התפשטות תאים, ו נוסף 10-14 ימים התמיינות תאים על הממשק אוויר נוזלי. יום נוסף נדרש עבור חשיפות תא והקציר של דגימות. 1. בידוד של תאים עכבר Tracheobronchial אפיתל (MTEC). הערה: כל הנהלים המתוארים להלן נבדקו ואושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש ב בריגהאם ובית החולים לנשים / שטח בית הספר לרפואה של הרווארד. לפני שתתחיל: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן F12 של שינקין מדיה המכילה אנטיביוטיקה. F12 כדי 250 מ"ל של Ham התקשורת הבסיסי (Cellgro) להוסיף 2.50 מ"ל של 100 X פניצילין / סטרפטומיצין (10 2 U/mL-10 2 מ"ג / מ"ל) פתרון 250 μL של פתרון X Fungizone 1000. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של Pronase 0.15%. הוסף Pronase 15 מ"ג ל 10 מ"ל של מדיה F12 של שינקין המכילות אנטיביוטיקה. בצע טרי ולשמור על הקרח עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו משטח עבודה נקי מכשירי ניתוח סטרילי המתאים לניתוח בעלי חיים קטנים, רקמה lamellar תרבות ברדס עבור isolations התא. כל הציוד אחרים נחשב סטנדרטי עבור התרבות התא החי כולל humidified 2 חממות CO, חדר קר, תא השולחן צנטריפוגות, מיקרוסקופ הפוכה, ועל פיפטה פלסטיק חד פעמיות כלי התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קולגן אני הפתרון (50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב 0.02 N חומצה אצטית). פיפטה 1.0 מ"ל פתרון קולגן לתוך הבאר כל אחד 12 גם transwell צלחת (קורנינג). עטוף parafilm ולתת לעמוד במשך הלילה על משטח שטוח בטמפרטורת החדר. </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש זן, זמין מסחרית העכבר (כלומר, C57Bl / 6, זכר 6-8 שבועות), להרדים עכברים באמצעות שיטה המאושר של המתת חסד כגון CO 2-Induced הרדמה. בדרך כלל 6 עכברים תניב מספיק תאים (1.5-2.0 x 10 5 תאים / עכבר) כדי זרע צלחת 12-transwell היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רסס את פגרי בעלי חיים עם פתרון EtOH 70% לעקר את השדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מספריים כירורגיות נקי אזמל, להסיר את העור מסביב לאזור קנה הנשימה, ולחשוף את קנה הנשימה. פתח את הבטן, חותכים לאורך עצם החזה, ולהסיר את כלוב הצלעות. הסרה של רקמת עד תום את הקנה חשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום וקנה הנשימה לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 30 מ"ל של Ham F12 מדיה המכילה אנטיביוטיקה, על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך מכסה המנוע לזרום סטרילי lamellar, העברת רקמות קנה הנשימה אל צלחת פטרי 100 מ"מ סטרילי המכיל 10 מ"ל של Ham F12 מדיה המכילה אנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לנתח רקמת החיבור עם מלקחיים ומספריים כירורגי סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רקמות קנה הנשימה אל צלחת פטרי חדש 100 מ"מ המכילים 10 מ"ל של Ham F12 מדיה המכילה אנטיביוטיקה לשטוף. גזור וקנה הנשימה לאורך ציר אנכי לחשוף לומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת וקנה הנשימה לצינור 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל פתרון Pronase 0.15% ו דגירה לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום השני, יש להכין: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון אני DNAse. כדי mL 18 של Media F12 של חם המכיל אנטיביוטיקה להוסיף 2 מ"ל של 10 מ"ג / מ"ל ​​שור פתרון סרום (BSA) אלבומין מניות, ו -10 מ"ג הגולמי בלבלב DNAse I. הפיכת aliquots 1 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C (מופשר על קרח לפני השימוש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן F12 של שינקין מדיה המכילה אנטיביוטיקה עם סרום 20% שור העובר (FBS). F12 כדי 200 מ"ל של Ham התקשורת הבסיסי (Invitrogen) להוסיף 50 מ"ל חום FBS מומת, 2.5 מ"ל של 100 X פניצילין / סטרפטומיצין (10 2 U/mL-10 2 מ"ג / מ"ל) פתרון, ו 250 μL של פתרון X Fungizone 1000 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני MTEC בסיסי המכיל אנטיביוטיקה. כדי 475.5 מ"ל DMEM/F12 התקשורת הבסיסית (Cellgro) להוסיף 7.5 מ"ל 1 M פתרון HEPES, 10 מ"ל של תמיסת 200 mM גלוטמין, 2 מ"ל של פתרון 7.5% NaHCO 3, 5 מ"ל של 100 X פניצילין / פתרון סטרפטומיצין, 500 μL של פתרון X Fungizone 1000 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן MTEC medium/10 FBS%. עד 45 מ"ל של מדיום MTEC הבסיסי המכיל אנטיביוטיקה, מוסיפים 5 מ"ל FBS חום מומת. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות את הסלע צינור (מ שלב 1.8) 10-12 פעמים, ואחר כך לתת לזה לעמוד 30-60 דקות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ"ל של Ham F12 מדיה המכילה 20% FBS ואנטיביוטיקה אל הצינור רוק 12 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 3 צינורות חרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של Ham F12 מדיה המכילה 20% FBS ואנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר וקנה הנשימה מפתרון Pronase, נתעלם פתרון זה על הקרח. העברת וקנה הנשימה אל צינור חרוטי first המכיל F12 של נקניק להפוך צינור 12 פעמים. חזור על תהליך זה פעמיים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שילוב הפתרון Pronase עם שלושת supernatants משלב 1.13 לתוך צינור one 50 מ"ל. בטל רקמות הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה על 1400rpm (390 XG; Eppendorf צנטריפוגות 5810R מצויד הרוטור A-4-62) עבור 10 דקות ב 4 ° C, וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend גלולה בפתרון DNAse 1 מ"ל (100-200 μL / קנה הנשימה)ו דגירה 5 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה על 1400rpm (390 XG) במשך 5 דקות ב 4 ° C, וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה במדיום 8 MTEC מ"ל המכיל 10% FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא פלייט השעיה על צלחות Primaria (Falcon). לדגור על 37 מעלות צלזיוס באווירה של אוויר 95%, 5% CO 2 למשך 5 שעות (הערה: זהו צעד סלקציה שלילית עבור פיברובלסטיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ההשעיה התא צלחות לשטוף צלחות פעמיים עם 4 מ"ל MTEC המכיל 10% FBS. תא בריכת ההשעיה ושוטף יחד צינור חרוטי 50 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסוך 1 מ"ל עבור cytospin והספירה התא. ספין בצנטריפוגה השולחן במשך 5 דקות ב 5000 סל"ד (Eppendorf 5415D). הסר μL 500 ו resuspend גלולה ב supernatant הנותרים. השתמש 100 μL עבור ספירת תאים בשיטת כחול Trypan מכתים חיוני. לחסוך 4 aliquots של μL 100 לניתוח cytospin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הנותרים 15 תא ההשעיה מ"ל ב 1400rpm (390 XG), ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li></ol> 2. ריבוי והתמיינות של MTEC בממשק אוויר נוזלי הכן retinoic מניות פתרונות חומצה. פתרון במלאי: לשקול את החומצה הרטינואית בחושך (מר 300.44 g / mol) לעשות 5 מניות פתרון מ"מ EtOH 95%. חנות בתוך שפופרת עטוף בנייר ב -80 ° C. לפי הצורך, להכין פתרון במלאי B (5 מיקרומטר) על ידי הוספת 50 μL במלאי, 500 μL פתרון BSA (100 מ"ג / מ"ל) ו 49.5 פתרון מאוזן מ"ל של האנק מלח (HBSS). חנות בנייר כסף עטוף צינור ב -80 ° C עד 4 שבועות. הכן בינוני MTEC התפשטות המכילים חומצה רטינואית. כדי 45.7 מ"ל התקשורת MTEC הבסיסי המכיל אנטיביוטיקה, להוסיף חום מומת 2.5 FBS מ"ל, 1 מ"ל retinoic חומצה במלאי B, 250 פתרון אינסולין μL (2 מ"ג / מ"ל ​​אינסולין 4 מ"מ HCl), 250 גורם μL עוריות צמיחה פתרון (5 מיקרוגרם / מ"ל ב EGF בהרוורד המכילה 1 מ"ג / מ"ל ​​BSA), 200 μL לחלץ יותרת המוח שור (15 מ"ג / מ"ל ​​ב בהרוורד המכילה 1 מ"ג / מ"ל ​​BSA), 50 μL פתרון transferrin (5 מ"ג / מ"ל ​​transferrin ב בהרוורד המכילה 1 מ"ג / מ"ל ​​BSA ), 50 μL פתרון כולרה טוקסין (100 מ"ג / מ"ל ​​ב בהרוורד המכילה 1 מ"ג / מ"ל ​​BSA). סנן לעקר הסופי הכנה התקשורת ולהשתמש בתוך 2 ימי הכנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון קולגן מהצלחות transwell, בואו לעמוד מתחת למכסה המנוע של 5 דקות, לשטוף עם PBS 2 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, resuspend התא גלולה בהיקף מתאים של הפצת מדיה (500 μL) כדי להקל על ציפוי של 7.5 x 10 4 -1.0 x10 5 תאים לכל טוב. פיפטה 500 תא ההשעיה μL על פני השטח של apical להכניס את קרום transwell פוליקרבונט. הוסף 1.5 מ"ל של התקשורת התפשטות לתא הבסיסי של transwell. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התרבויות MTEC שקוע ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified אוויר המכיל 95%, 5% CO 2 עבור 70-10 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו שלושה ימים לפני שינוי התקשורת בפעם הראשונה. שינוי התקשורת בכל יום אחר. צג תרבויות על ידי בדיקה ויזואלית של מדידת התנגדות תא transepithelial באמצעות אלקטרודה (EVOM Ohmvoltometer, מכשירים Precision העולם, סרסוטה, פלורידה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים להופיע ומחוברות והתנגדות אפיתל מגיע Ω 1000 / 2 ס"מ, התאים מוכנים לבדל את עלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התקשורת הבסיסי המכיל MTEC NuSerum 2%. הוסף NuSerum עד בינוני MTEC בסיסית ריכוז סופי של 2% V / V. הוסף B retinoic מלאי חומצה בריכוז הסופי של 1 מ -7 X 10 לפני השימוש. הכן טרי ולהשתמש בתוך 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר להבדיל בין תא עבור 10-14 ימים, על ידי הסרת התקשורת apical והחלפת התקשורת הבסיסי עם 750 התקשורת μL הבסיס MTEC המכילים חומצה רטינואית Nuserum ו 2%. שינוי בתקשורת הבסיס לשטוף את הצד apical עם MTEC NuSerum המכיל 2% בכל יום אחר. </li></ol> 3. יישום של עשן סיגריות כדי לתאי האפיתל Cultured <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הצד apical של התרבויות transwell לעשן סיגריות המיינסטרים באמצעות חשיפת תא CS המערכת (EMI מכשירים, פיטסבורג, פנסילבניה). ראה איור 1 עבור תצלום של המנגנון. ראה טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד מפרטים טכניים. בקיצור, המנגנון מורכב משאבה peristaltic אשר כל מעשן סיגריה ~ 7-8 פחזניות, ציור בעשן המיינסטרים לקו פוליפרופילן שמחובר לחדר חשיפה פרקו. החדר חשיפה נשמר 37 ° C על ידי במחזור מים, שמרו על אווירה של 5% CO 2 על קו גז. התאים יכולים להיות חשופים לעשן באמצעות קנטאקי 3R4F מחקר התייחסות סיגריות פילטר (טבק מכון המחקר, אוניברסיטת קנטאקי, לקסינגטון, KY). בדרך כלל התאים נחשפים לעשן סיגריות 1-2, מניב 100-200 מ"ג / מ 3 של חומר חלקיקי הכולל (TPM). תרבויות בקרה נחשפים לאוויר החדר לתקופה המקבילה חשיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TPM נמדדת על פי פרוטוקול של היצרן המסופק עם TE-10c מכונת עישון (Enterprises טיג). בקיצור, פילטר (Pallflex) ממוקם מחזיק פלדה מוטבעות חלד על צינור דגימה המובילים מנמל הדגימה על חדר עישון להזרים זרם קבוע (יחידת דגימה). יצוא צינור המחבר את יחידת דגימה של מטר גז (גז יבש Meter, ONM61, 67, AEM). המסנן נשקל לפני ואחרי הדגימה גז. החומר הכולל שהונח על המסנן מ"ג הוא מנורמל עבור מהנפח הכולל של האוויר שנדגמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לאחר מכן ניתן לקצור בכל נקודת זמן (כלומר, 0-24 שעות) חשיפה לפרסם נהלים אנליטיים תא רגיל (כלומר, המערבי ניתוח immunoblot, ניתוח ה-mRNA, וכו ') או במיקרוסקופ (כלומר, מיקרוסקופיה confocal או אלקטרון). התקשורת יכולה להיות גם תרבות ניתח עבור ציטוקינים או לשחרר LDH עבור מבחני cytotoxicity. </li></ol> 4. נציג תוצאות בידוד אפיתל ריבוי מוצלח, והבחנה ב עלי צריך להניב monolayer שלם עם מורפולוגיה המרוצף. עמידות תא Transepithelilal של תרבויות בריא צריך להיות בערך 1000-2000 Ω / 2 ס"מ. איור 2 מתאר monolayer של תאים אפיתל הנשימה עכבר מוכתם עבור תא אפיתל סמנים cilia בתנאים מלאה אחרי חשיפה לעשן סיגריות. איור 3 מראה micrographs אלקטרונים מייצג של תרבויות MTEC בריאה, המתארים ultrastructure ומורפולוגיה cilia. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. הכנת התמורה לתאי האפיתל באמצעות שלושה שלבים, שלב הבידוד, שלב התפשטות, ואת שלב התמיינות בממשק אוויר נוזלי (ערכת). תאים אפיתל מבודדים העכבר קנה הנשימה, seeded על transwells שם הם מתרבים בתרבות שקוע, ולאחר מכן להמיר לתוך ממשק האוויר מלא נוזל שבו הם מבחינים. הניסויים נערכים בדרך כלל ביום ה -24 של התרבות רציפה. התמונה מתארת ​​מערכת מודל לחשיפה של תאים בתרבית לעשן סיגריות המיינסטרים. מערכת עלי transwell תרבות ממוקם בתוך מערכת מודולרית המותאמת אישית עשן סיגריות משלוח הנשלטת על טמפרטורה, לחות ו-CO 2. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2 בתרביות תאים אפיתל קובעו ונצבעו עבור גרעינים (Hoechst 33,258), F-אקטין (ירוק; אלקסה פלואוריד Phalloidin-488-מצומדות). וכן את הסמן cilia acetylated-α טובולין (אדום; Cy3-מצומדות נוגדנים משני). לוחות נמוך להראות תמונות שוות ערך לתאי האפיתל נלקחו 4 שעות אחרי חשיפה לעשן סיגריות (2 סיגריות, 150 מ"ג / מ 3). (ב) לקטט דהידרוגנז LDH () שחרור נמדדה בינוני הבסיס 24 שעות לאחר החשיפה מינונים שונים של עשן סיגריות כפי שצוין. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. אוויר נוזלי תרבויות ממשק של תאים אפיתל מבודד אפיתל העכבר קנה הנשימה להבחין ב תת מספר על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (TEM) יש את המאפיינים של התאים הבזליים ריסי, ולא ריסי 1. תאים אלה מאפיינות אפיתל הנשימה pseudostratified. תוויות איור מתאימות: bb: הגוף הבסיסיים,: axoneme, מ ': המיטוכונדריה, n: גרעין, s: המצע (פוליקרבונט ממברנה), mv: microvili

<ol><li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells%3A+selection+of+a+proliferative+population%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1315-L1320 (2002).</li>
<li>Davidson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+epithelial+cells%3A+isolation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cyst.+Fibros%22%5BJournal%5D)">Murine epithelial cells: isolation and culture.</a> J. Cyst. Fibros. 2, Suppl 3. 59-62 (2004).</li>
<li>Davidson, D. J., Kilanowski, F. M., Randell, S. H., Sheppard, D. N., Dorin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+culture+model+of+differentiated+murine+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A primary culture model of differentiated murine tracheal epithelium.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279, L766-L778 (2000).</li>
<li>Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.%3B+Global+Initiative+for+Chronic+Obstructive+Lung+Disease.+Global+strategy+for+the+diagnosis%2C+management%2C+and+prevention+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease%3A+GOLD+executive+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">et al.; Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary.</a> Am. J Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).</li>
<li>Macnee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chest+Med%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease.</a> Clin. Chest Med. 28, 479-513 (2007).</li>
<li>Tuder, R. M., Yoshida, T., Arap, W., Pasqualini, R., Petrache, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art.+Cellular+and+molecular+mechanisms+of+alveolar+destruction+in+emphysema%3A+an+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thorac.+Soc%22%5BJournal%5D)">State of the art. Cellular and molecular mechanisms of alveolar destruction in emphysema: an evolutionary perspective.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 3, 503-510 (2006).</li>
<li>Yao, H., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+on+the+role+of+inflammation+in+COPD+and+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Current concepts on the role of inflammation in COPD and lung cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 375-383 (2009).</li>
<li>van der Toorn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+irreversibly+modifies+glutathione+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke irreversibly modifies glutathione in airway epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, L1156-L1162 (2007).</li>
<li>Slebos, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+localization+and+function+of+heme+oxygenase-1+in+cigarette+smoke-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial localization and function of heme oxygenase-1 in cigarette smoke-induced cell death.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 36, 409-417 (2007).</li>
<li>Kim, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+proteins+regulate+cigarette+smoke+induced+apoptosis%3A+protective+role+of+heme+oxygenase-1%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagic proteins regulate cigarette smoke induced apoptosis: protective role of heme oxygenase-1.</a> Autophagy. 4, 887-895 (2008).</li>
<li>Chen, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egr-1+regulates+autophagy+in+cigarette+smoke-induced+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease.</a> PLoS ONE. 3, e3316-e3316 (2008).</li>
<li>Okuwa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+micronucleus+assay+for+cigarette+smoke+using+a+whole+smoke+exposure+system%3A+A+comparison+of+smoking+regimens%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">In vitro micronucleus assay for cigarette smoke using a whole smoke exposure system: A comparison of smoking regimens.</a> Exp Toxicol Pathol. , Forthcoming (2009).</li>
<li>St-Laurent, J., Proulx, L. I., Boulet, L. P., Bissonnette, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+in+vitro+models+of+cigarette+smoke+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Inhal.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two in vitro models of cigarette smoke exposure.</a> Inhal. Toxicol. 21, 1148-1153 (2009).</li>
<li>Watson, A. M., Benton, A. S., Rose, M. C., Freishtat, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+alters+tissue+inhibitor+of+metalloproteinase+1+and+matrix+metalloproteinase+9+levels+in+the+basolateral+secretions+of+human+asthmatic+bronchial+epithelium+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig.+Med%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke alters tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and matrix metalloproteinase 9 levels in the basolateral secretions of human asthmatic bronchial epithelium in vitro.</a> J Investig. Med. 58, 725-729 (2010).</li>
<li>Rennard, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+in+research%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke in research.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 479-480 (2004).</li>
<li>Shapiro, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoke+gets+in+your+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Smoke gets in your cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 481-482 (2004).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הפרוטוקול מתאר בידוד של תאים אפיתל העכבר קנה הנשימה מותאמת הפרוטוקולים של אתה et al., 1, ועוד 2-3 עם שינויים. כמו בכל isolations פרוטוקול המתאר התא, ההיבט הקריטי ביותר הוא להימנע זיהום חיידקי או פטרייתי פתוגנים על ידי שימוש בטכניקות aseptic קפדנית. הצעד השני הוא קריטי כדי למנוע זיהום פיברובלסטים של תרבויות, אשר יכול להימנע על ידי דיסקציה זהירה של וקנה הנשימה, ואת סלקציה שלילית כמתואר שלב 1.19. ובלבד התרבויות מנוטרים, שטף, והתקשורת תרבות מתחדש בכל יום...

* מכונת עישון סיגריות הוא מנהג תוכנן מפוברק 14 &quot;x14&quot; X20 &quot;Dual החדרים ואור במעיל מים גוון הוכחה ברורה 1 / 2&quot; קאמרית עבה פוליקרבונט Lexan לחשיפה עשן סיגריות עם חיישן טמפרטורה מבוקרת, מים מבוקרת לכבות המערכת. עישון סיגריה / ומתנשף יחידה מותקן סיגריה משתנה שיעורי ומתנשף. כאשר המכשיר נמצא בשימוש, היא מחקה באינקובטור במובן זה טמפרטורה, לחות ופחמן דו חמצני נשלטים במערכת. המערכת כוללת: (I) כפול יחידת אישית תא / מים במעיל השומרת על סביבה מבוקרת ניסויים בתרבית רקמה. (II) חובה כבדה דיגיטלית, דיוק גבוהה כפול משאבת מים בטמפרטורה circulator מערכת עם חיישן מים ברמת בקרת טמפרטורה (III) עישון סיגריות יחידת מפמפם עם המשאבה. (IV) מחזור משאבת חיישן לשלוט בקצב Cycler (IV) דיוק נירוסטה גבוה-Line בעל מסנן. (V) מכסה נתיק רכוב 11 / 2 &quot;אחידות צירית גודל עשן סיגריות אוהד ערבוב. (ו &#39;) בגודל בינוני מי האמבט עם סוגר הרכבה circulator המים. (ז) 1 / 2&quot; מגש פלסטיק עבה עם סוגריים עבור משב המשאבה ואת מחזיק עבור אספן אפר סיגריות. מכונה זו כפי שתואר ניתן להחליף עם, זמין מסחרית מכונות דומות עישון כגון סוג זמינים TSE מערכות ( <a href="http://www.tse-systems.com">www.tse-systems.com</a> ).

בידוד של תאים אפיתל עכבר הנשימה וחשיפה לעשן סיגריות בבית ניסויית ממשק האוויר נוזלי

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface  

תאים אפיתל ריאתי יכול להיות מבודד דרכי הנשימה של עכברים תרבותי בממשק אוויר נוזלי (עלי) כמודל של אפיתל הנשימה מובחן. פרוטוקול מתואר לבידוד וחשיפת תאים אלה לעשן סיגריות המיינסטרים (CS), כדי ללמוד התגובות תא אפיתל חשיפה CS. פרוטוקול מורכב משלושה חלקים: בידוד של תאים אפיתל דרכי הנשימה של העכבר קנה הנשימה, את culturing של תאים אלה על הממשק אוויר נוזלי (עלי) כמו בתאי אפיתל הבדיל באופן מלא, ועל אספקת הזרם המרכזי CS מכויל תאים אלה בתרבית. מערכת התרבות עלי מאפשר התרבות של epithelia הנשימה בתנאים דומים יותר ההגדרה הפיזיולוגית שלהם מאשר מערכות תרבות נוזלי רגיל. המחקר של תגובות תאית ומולקולרית ריאות לחשיפה CS הוא מרכיב קריטי להבין את ההשפעה של זיהום אוויר איכות הסביבה על בריאות האדם. ממצאי המחקר בתחום זה עשוי בסופו של דבר לתרום להבנת האטיולוגיה של מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), ועוד מחלות הקשורות לטבק, המייצגים העיקריים לבעיות בריאות העולמי.

תאים אפיתל ריאתי יכול להיות מבודד דרכי הנשימה של עכברים תרבותי בממשק אוויר נוזלי כמודל של אפיתל הנשימה מובחן. פרוטוקול מתואר לבידוד, culturing וחשיפת תאים אלה לעשן סיגריות המיינסטרים, כדי ללמוד התגובות מולקולרית רעלן זה סביבתיים.

ניתן לבודד תאי אפיתל ריאתיים מדרכי הנשימה של עכברים ולגדלם בממשק אוויר-נוזל (ALI) כמודל של... מובחנים

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד תאי אפיתל של דרכי הנשימה כדי לחקור את ההשפעות הרעילות של חשיפה לעשן סיגריות. הדבר משיג תחילה על ידי נתיחת קשקשים של קשקשעי עכביש (tracheas) של עכברים, ולאחר מכן על ידי עיכול הקשקשים בתמיסת pronase. השלב השני של ההליך הוא איסוף תאי האפיתל והנחלת תרבית הנוזל.השלב השלישי הוא בידוע גדילה של התרביות בממשק אוויר-נוזל (air liquid interface). השלב הסופי של הפרוצדורה הוא חשיפת התאים האפיתליאליים לעשן סיגריות מהצד האפקלי בממשק האוויר-נוזל. לבסוף, ניתן לקבל תוצאות המראות שכבה אחת (monolayer) של תאים אפיתליאליים מובחנים באופן מלא באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום של מחלת ריאות חסימה כרונית, כגון השפעות החשיפה לעשן סיגריות על מורפולוגיית CLIA וסממנים ביוכימיים של פגיעה תאית המושרים על ידי עשן סיגריות. התחילו בהכנות להליך זה יום אחד לפני הניתוח על ידי הכנת מצעי hams F 12 המכילים אנטיביוטיקה, ו-20% F-B-S-M-T-E-C, מצע בסיסי המכיל אנטיביוטיקה.מדיום MTEC עם 5% FBS, תמיסות מלאי של retinoic acid מ-DNA's one solution ומדיום proliferation ל-MTEC בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב. סטריליזציה של כל כלי הניתוח שבהם ייעשה שימוש ביום הניתוח. ודאו שאזור הניתוח נקי ושכל כלי הניתוח נמצאים בהישג יד.סטריליזציה של מC-hood לתרביות רקמה. לאחר מכן, יש לעבוד בתוך ה-hood לתרביות רקמה. הכין תמיסה של 0.15% pronase.הוסיפו 15 milligrams של pronase ל-10 milliliters של מצע hams. F 12 המכיל אנטיביוטיקה בתוך מבחנה קונית של 50 milliliter. שמרו על קרח עד לשימוש.קשייות של עכברים מבודלות מעכברים באמצעות הליכים כירורגיים סטנדרטיים; חטא את המבחנה המכילה את הקשייות והנח אותה בתא תרביות רקמה. העבר את רקמת הקשייות לצלחית פטרי בקוטר 100 מילימטר עם מצע hams F 12 המכיל אנטיביוטיקה. השתמש בפינצטות כירורגיות סטריליות כדי להסיר את רקמת החיבור מהקשייות.לאחר מכן, העבירו את הקנה הנקי לכלי פטרי שני בנפח 100 מילימטר המכיל מצע hams. F 12 עם אנטיביוטיקה. השתמשו במספרי ניתוח כדי לחתוך את הקנה לאורך הציר האנכי ולחשוף את הלומן.העבירו את הקשראות לפסולת קונית של 50 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של תמיסת Pronase והניחו במקרר לדגירה למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לבסוף, הכינו פלטות Transwell שעברו טיפול בקולגן one לשימוש. למחרת, הוסיפו 50 מיליגרם של קולגן one לכל מיליליטר של 0.02 N acetic acid והעבירו באמצעות פיפטה מיליליטר אחד מתמיסה זו לכל באר ב-12.יש להעביר את התמיסות לבארות של פלטת בארות. עטוף את הפלטה ב-para film והשאר אותה למשך הלילה בטמפרטורת החדר בתוך מramed התרביות (tissue culture hood). למחרת.הפוך בעדינות את המבחנה המכילה את קשקשי הנשימה (tracheas) של העכברים 10 עד 12 פעמים. לאחר מכן, השאר את תוכן המבחנה להדגרה למשך 30 עד 60 דקות נוספות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. בעבודה תחת מ covered tissue culture hood, פפט 10 milliliters של מצע hams F 12 המכיל אנטיביוטיקה ו-20%FBS אל תוך המבחנה הקונית המכילה את רקמת הקנה שעברה עיכול, והפוך אותה 12 פעמים.לאחר מכן, העבירו בעזרת פיפטה 10 milliliters של מצע hams F 12 המכיל אנטיביוטיקה ב-20%FBS לתוך כל אחת משלוש מבחנות קוניות של 15 milliliter. השתמשו בפיפטת פסטור סטרילית כדי להעביר את רקמת הקנה מתמיסת ה-pronase למבחנה הראשונה המכילה מצע hams F 12 מועשר.הניחו את תמיסת ה-Pronase על קרח, סגרו את המכסה של המבחנה המכילה את רקמת הקנה והפכו אותה בעדינות 12 פעמים כדי לערבב. לאחר מכן, באמצעות פיפטת פסטור, העבירו את רקמת הקנה למבחנה קונית שנייה בנפח 15 מיליליטר והפכו מבחנה זו 12 פעמים. חזרו על פעולת ההעברה וההפיכה באמצעות המבחנה הקונית האחרונה בנפח 15 מיליליטר.לבסוף, השתמשו בפיפטת פסטה כדי להסיר ולהשליך את רקמת הקנה. לאחר מכן, הוציאו את תמיסת ה-pronase מהקרח וערבבו את שלושת הנפחים של 15 milliliter של מצע hams F 12 מועשר עם תמיסת ה-pronase. סבבו את הדגימה בצנטריפוגה מקוררת בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות ב-1,400 rotations per minute; לאחר הסבוב, השליכו את העל-משקע (supena), ולאחר מכן העבירו בפיפטה כ-100 עד 200 µL של תמיסת DNA's one לכל קנה על המשקע וערבבו.שַׁהֶה את התאים על ידי תיפוף עדין. דגירה של התאים בקרח למשך חמש דקות. סובב את המבחנה בצנטריפוגה במהירות של 1,400 סל"ד למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C והסר את העילוי.לאחר מכן, טפטפו שמונה מיליליטר של מצע MTEC המכיל 10% FBS על המשקע והחזירו לסביבה של תרחף. את תרחף התאים בצלחת paria דגרו בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה של 95% אוויר ו-5% carbon dioxide למשך חמש עד שש שעות. זהו שלב ברירה שלילית להסרת פיברובלסטים.לאחר הדגירה, אספו את תרחיף התאים מהצלחת פטרי והעבירו באמצעות פיפטה לשפופרת קונית של 50 מיליליטר. לאחר מכן, שטפו את הצלחת פעמיים עם ארבעה מיליליטר של מצע MTEC המכיל 10%FBS. העבירו את שני השטיפות לשפופרת הקונית של 50 מיליליטר המכילה את תרחיף התאים.העבירו בעזרת פפטה 1 mL של תגלי התאים למבחנה מסוג einor. שמרו מנה זו לצורך ניתוח cyto spin וספירת תאים בצנטריפוגה. את המבחנה הקונית בנפח 50 mL המכילה את 15 mL הנותרים של תגלי התאים סובבו במהירות של 1,400 rpm בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות.במהלך הסנטריפוגציה, הסירו והשליכו את תמיסת הקולגן מלוח ה-transwell שהוכן קודם לכן. השאירו את הלוח להתייבש תחת המבתור למשך חמש דקות, ולאחר מכן שטפו פעמיים עם PBS; לאחר השטיפה האחרונה, שאבו את כל ה-PBS והעבירו בעזרת פיפט 1.5 milliliters של מצע פרוליפרציה אל התא הבסיסי של ה-transwell לאחר הסנטריפוגציה.שפכו את הנוזל העליון ותלוו מחדש את משקע התאים בנפח מתאים של מצע גידול להתרבות, כדי לאפשר זריעה של 7.5 times 10 to the four עד one times 10 to the five תאים ב-500 microliters של תרחף לכל באר. העבירו בפיפט 500 microliters של תרחף התאים אל פני השטח האפיקליים של ממברנת הפוליקרבונט של ה-transworld. דגרו את תרביות ה-MTEC השקועות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בתוך דגרה לחיתה המכילה 95% air ו-5% carbon dioxide למשך שבעה עד 10 ימים, עם החלפת מצע בכל יום שני.מדוד את ההתנגדות התאי-אפיתליאלית באמצעות אינטרוולומטר (intervalometer). כאשר ההתנגדות האפיתליאלית מגיעה ל-1000 ohms per centimeter squared והתרביות נראות קונפלואנטיות (confluent), העבר אותן לתרבית LI על ידי הסרת המצע האפיקלי.בנוסף, החליפו את המצע הבסיסי במצע MTEC בסיסי המכיל 2% סרום חדש וחומצה רטינואית. דגרו את התרביות בטמפרטורה של 37 °C ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 10 עד 14 ימים כדי לאפשר התמיינות, עם החלפת מצעים בכל יום שני. ראשית, הגדירו את מכונת העישון בהתאם להוראות היצרן.רשמו את משקלו של פילטר pole flex שאינו בשימוש. לאחר מכן, מקמו את הפילטר במחזיק נירוק הכסתי המקוון (inline) על גבי צינור הדגימה המוביל מפתח הדגימה של תא העישון אל משאבת הזרימה הקבועה. חברו את יחידת הדגימה למד-הגז באמצעות צינור פליטה המשתמש במערכת חשיפה של תאי CS.חשפו את הצד האפיקלי של תרביות ה-transworld לעשן סיגריות מהזרם המרכזי משלוש סיגריות פילטר למחקר מסוג R four F. חשפו את התאים לעשן של אחת עד שתיים סיגריות. חשפו תרביות ביקורת לאוויר החדר למשך פרק זמן חשיפה שווה לאחר עליית משקל של דגימת הגז.במסנן גמיש (pool flex filter), כמות החומר הכוללת שהשקיעה על המסנן במיליגרמים עוברת נורמליזציה. עבור הנפח הכולל של האוויר שנדגם, עשן של סיגריה אחת עד שתיים מניב בדרך כלל 100 עד 200 מיליגרם למטר מעוקב של TPM. לאחר החשיפה לסיגריה, קצרו את התאים ואת המצע הבסיס (basal media) לצורך ניתוחים נוספים.זוהי דוגמה לשכבה אחת (monolayer) בריאה של תאי אפיתל נשימתיים של עכבר, הצבועות עבור גרעין התא האפיתלי וסמני C. בידוד אפיתליאלי, פרוליפרציה ודיפרנציאציה מוצלחים מתבטאים בשכבה אחת שלמה בעלת מורפולוגיה של "cobblestone" (מראה רצפת אבנים). התרביות הן למעשה נקיות מפיברובלסטים.תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים אלו מייצגות תרביות בריאות של MTEC ומתארות את העל-מבנה של סוגי התאים השונים ואת המורפולוגיה של CELIA. סרטון הדמיה של תאים חיים זה מראה מורפולוגיית C בריאה של תרביות MTEC. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים תאי אפיתל של קנה הנשימה של עכבר, מבצעים להם דיפרנציאציה בממשק אוויר-נוזל (air liquid interface), וחשיפתם לעשן סיגריות בזרם הראשי.

isolation-mouse-respiratory-epithelial-cells-exposure-to-experimental

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

הכנה מטוהרים של ריאות תאים דנדריטים עכבר מתואר. דגש ספציפי ניתנת הבידוד של תת קונבנציונאלי תאים דנדריטים.

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

מטרת פרוטוקול זה היא לספק שיטות אוטומטיות לכימות פתולוגיות ריאה כרוניות במודל עכברי של COPD. הפרוטוקול כולל חשיפת עכברים לעשן סיגריות (CS), מדידת תפקוד ריאתי, ניפוח הריאות ושימוש בשיטות מורפומטריה למדידת אמפיזמה ושיפוץ דרכי נשימה קטנות בעכברים.

מדידה אוטומטית של הריאות נפחתו וקטן Airway Remodeling בעכברים שנחשפו לעשן סיגריות

מטרת פרוטוקול זה היא לחשוף מודלים תלת-ממדיים של רקמות הסימפונות והאף האורגנוטיפיים האנושיים לעשן סיגריות מיינסטרים (CS) בממשק אוויר-נוזל. לאחר מכן נחקרת ההשפעה של CS על הרקמות באמצעות בדיקת פעילות ציטוכרום P450, מדידת פעימות ריסים וגישה של ביולוגיה מערכתית.

הערכת השפעה של חשיפה חוזרת ונשנית של דוגמניות תרבות רקמות Organotypic 3D הסימפונות ובאף לעשן סיגריות שלמות

מתואר כאן הוא פרוטוקול כדי ללמוד כיצד תמצית עשן סיגריות משפיעה על קולוניזציה חיידקים בתאי אפיתל ריאות.

מחקר השפעות של עשן סיגריות על זיהום פסאודומונס בתאי אפיתל ריאות

פרוטוקול זה מדגים את המחקר של ההשפעות הפתופיסיולוגיות של עשן סיגריות (CS) עם מערכת חשיפה לכל הגוף (WBIS) (WBIS) מובנית בתוך הבית. מערכת זו יכולה לחשוף בעלי חיים CS בתנאים חוזרים מבוקרים למחקר של השפעות בתיווך CS על אמפיזמה ריאות hematopoiesis.

חשיפה לעשן סיגריות בעכברים באמצעות מערכת שאיפה לכל הגוף

במאמר זה, תאי אנדותל ריאתיים ראשוניים בודדו וגודלו בתרבית מעכברים ילודים.

בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

מוצגת כאן שיטה ניתנת לשחזור, משתלמת וחזקה לבידוד והרחבה של תאי אפיתל סימפונות ראשוניים עבור ביו-בנקאות לטווח ארוך ויצירת תאי אפיתל ממוינים על ידי תרבית בממשק אוויר-נוזל.

בידוד תאי אפיתל של הסימפונות מרקמת ריאה שנכרתה לצורך ביו-בנקאות והקמת תרביות ממשק אוויר-נוזל ממוינות היטב

במאמר זה אנו מתארים מודל במבחנה לבידוד והתמיינות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה, תוך התמקדות בהתאקלמותם לתמצית עשן סיגריות כרונית (CSE). ניתן להשתמש במודל כדי לאפיין באופן מקיף את ההשפעה הרב-אומית של CSE, מה שעשוי לספק תובנות לגבי התגובות התאיות תחת חשיפה כרונית לעשן.

מודל In Vitro לחקר התמיינות ושינויים של מולטי-אומיקה בתאי אפיתל של דרכי הנשימה של מורין המגורות באמצעות תמצית עשן סיגריות

פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של אוכלוסיות חיסוניות ולא מחוסנות מריאות העכבר במצב יציב ובעקבות זיהום בשפעת. הוא גם מספק אסטרטגיות שער לזיהוי תת-קבוצות של תאים אפיתל ומיאלואידים.

בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר

פרוטוקול זה מציג שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה לבידוד תאי אפיתל אלוואולריים מסוג II (AECII) חיוניים מריאות עכבריות יילודים, צעירות או בוגרות (נגועים או לא נגועים). גישה זו מאפשרת מחקרים מולקולריים ו/או פונקציונליים במורד התהליך של AECII לזהות את תפקידם במהלך דלקת וזיהום בריאותיים.

בידוד תאי אפיתל אלוואולריים מסוג II מריאות עכבריות יילודים, צעירים ובוגרים המתאימים לסביבות ניסוי זיהומי

למדו לבודד תאים אפיתליים מקנה הנשימה של עכברים ולגדלם בממשק אוויר-נוזלי לחקר השפעות עשן הסיגריות. שיטה זו מאפשרת ניתוח תגובות תאיות לרעלים סביבתיים ומספקת מודל לחקר מחלות ריאה.

בידוד של תאים אפיתל עכבר הנשימה וחשיפה לעשן סיגריות בבית ניסויית ממשק האוויר נוזלי

גלה סרטונים נוספים