Name: Thaliana ארבידופסיס פולאר Glycerolipid פרופיל ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) יחד עם כרומטוגרפיה גז נוזלי (GLC) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: למד שיטה פשוטה וחזקה לניתוח פרופיל ליפידים פולאריים ב-Arabidopsis thaliana באמצעות כרומטוגרפיה בשכבה דקה וכרומטוגרפיית גז נוזלי. מתאים לסקר מוטנטים בקנה מידה גדול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענק מטעם הקרן הלאומית למדע בארה&quot;ב כדי כריסטוף בנינג.

1. ליפידים Extraction <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין שאיבת שומן על ידי קצירת 30 מ"ג 4 שבועות בת ארבידופסיס עלים מצמחים הגדלים על אגר הקרושה בינוני או אדמה ולהעביר אותם לתוך צינורות פוליפרופילן 1.5 מ"ל התגובה. עלים טריים ניתן פלאש קפואים בחנקן נוזלי המאוחסן ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 החילוץ μL ממס מורכב מתנול, כלורופורם ו חומצה פורמית (20:10:01, V / v / v) מדגם אחד. Shake במרץ (באמצעות צבע שייקר או דומה) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 150 μL של חומצה זרחתית M 0.2 (H 3 PO 4), 1 מ כלוריד האשלגן (KCl) ו בקצרה מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 13,000 בטמפרטורת החדר למשך דקה 1. ליפידים מומס בשלב כלורופורם התחתון יהיה הבחין לצלחות TLC. </li></ol> 2. כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) 15 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין צלחות TLC, לצלול סיליקה ג'ל 20cmx20cm מצופה TLC צלחת עם פס טעינה של 30 שניות לתוך M 0.15 אמוניום סולפט ((NH 4) 2 SO 4) פתרון, לאחר השריית למשך 30 שניות, יבש את הצלחת לפחות 2 ימים מיכל מכוסה. במהלך הפעלת סובלימציה של אמוניום משאיר מאחוריו חומצה גופרתית, אשר protonates phosphatidylglycerol הכרחי ההפרדה שלה glycerolipids אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הניסוי, להפעיל TLC צלחות על ידי אפייה בתנור על 120 מעלות צלזיוס במשך 2.5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרגעות צלחות מופעל לטמפרטורת החדר, יש להשתמש בעיפרון כדי לצייר קו ישר (1.5 ס"מ משולי הצלחת) על פני הצלחת המקור של chromatogram. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף קטר, לאט לספק 3 X 20 μL של תמצית השומנים בשלב כלורופורם נמוך באמצעות פיפטה 20 μL עם 200 טיפים μL פלסטיק צהוב תחת זרם איטי של N 2. לענין זה, Tubing Tygon מחובר הרגולטור של הטנק N 2. שמרו על המקום קטן יותר מאשר 1 ס"מ קוטר. הצלחת כל יכול להכיל עד 10 דגימות (כאשר לאחר מכן ניתוח GLC מתוכנן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו שומנים הנקודות להתייבש לחלוטין בשכונה קטר, להכין את הממס פיתוח מורכב של אצטון, טולואן, מים (91 מ"ל: 30 מ"ל: 7.5 מ"ל). אם רמת הלחות באוויר הסביבה היא גבוהה יחסית, ההפרדה עשויים להיות מושפעים. במקרה זה מים צריך להיות מופחת לתת (91 מ"ל: 30 מ"ל: 7.0 מ"ל) כדי להשיג את ההפרדה הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 80 מ"ל בפיתוח ממס לתוך TLC סגר פיתוח תא (L: H: W = 27.0: 26.5: 7.0 ס"מ / ס"מ / ס"מ) ומניחים את הצלחת לתוך הטנק עם סוף מדגם כלפי מטה. חותם את הטנק באמצעות מהדק. ממס יהיה לעלות את הצלחת שומנים יופרדו. זמן הפיתוח הוא כ 50 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הגיע מול ממס 1 ס"מ מהחלק העליון של הצלחת, להסיר בזהירות את הצלחת מהטנק ויבש לחלוטין למכסה המנוע קטר במשך כ -10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליפידים מופרדות TLC יכול להיות מוכתם הפיך בקצרה עם יוד על ניתוח כמותי או מוכתמת באופן בלתי הפיך עם חומצה גופרתית או α-naphthol. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומצה גופרתית לחריכה: לרסס את הצלחת עם חומצה גופרתית 50% מים בבקבוק זכוכית ספריי בשכונה קטר ואופים בחום של 120 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> α-naphthol מכתים עבור glycolipids: לרסס את הצלחת עם 2.4% (w / v) α-naphthol ב -10% (v / v) חומצה גופרתית, 80% (v / v) אתנול ואופים בחום של 120 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות עד להקות glycolipid מוכתמות ורוד או סגול (תרשים 2B). טיפול יתר יוביל לחריכה של כל השומנים בשל נוכחותם של חומצה גופרתית ב מגיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים יוד: במנדף קטר, במקום את הצלחת לתוך טנק TLC סגור עם גבישי יוד (במגש בתחתית המוביל הרוויה של האווירה עם אדי יוד עד שומנים גלויים). אל תחשוף את צלחת יוד מדי זמן יוד עשוי לשנות קוולנטית חומצות שומן רב בלתי רווי (איור 2C). לחלופין, כדי למנוע חמצון של שומנים, רק נתיבים תקן וביניהם מסלולי מדגם צריך להיות מוכתם באמצעות צמר זכוכית פקוק פיפטה פסטר עם גבישי יוד שדרכו N 2 הוא התפוצץ מעל נתיבי תקן בודדים. </li></ol></li></ol> 3. שומן Acyl Methylester (תהילה) תגובה 16 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת כתמים סביב סיליקה מזוהה השומנים מהצלחת TLC בסכין גילוח. לגרד את השומנים המכיל סיליקה ולהעביר את אבקת סיליקה באמצעות משפך לתוך שפופרת זכוכית עם מכסה טפלון (PTFE) מצופה בורג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ"ל 1 N מימן כלורי (HCL) של מתנול anhydrous לטעום כל פיפטה על ידי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 100 מ"ל μL 50 מיקרוגרם חומצה pentadecanoic -1 (15:00) באמצעות פיפטה 200 μL לטעום כל כסטנדרט פנימי בעזרת פיפטה 200 μL עם קצה פלסטיק μL 200 צהוב. שמור צינור עם חומצה רק pentadecenoic ב methanolic HCl כביקורת. צינורות זכוכית סגור היטב עם טפלון עטורי כיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה glהתחת צינורות אמבטיה 80 מעלות צלזיוס מים במשך 25 דקות. צינורות צריך להיות אטום כדי ממס אינו להתאדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי צינורות יש התקרר, מוסיפים 1 מ"ל נתרן כלוריד 0.9% ואחריו הקסאן מ"ל 1 ו מערבולת במרץ. צנטריפוגה דגימות 1000xg במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב למכסה המנוע קטר, להסיר את שכבת הקסאן / העליון של המדגם עם פיפטה פסטר והנח אותו לתוך צינור חדש זכוכית 13x100 מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאדות הקסאן תחת זרם איטי של N 2 ללא ייבוש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את שומן וכתוצאה מכך acyl methylesters s ב הקסאן 60 μL. העברת דגימות autosampler לתוך צלוחיות כובע בחוזקה. דוגמאות ניתן לאחסן 4 ° C לטווח קצר -20 ° C למשך כמה ימים. </li></ol> 4. גז נוזלי כרומטוגרפיה (GLC) 10 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת GLC, ודא מימן הליום, מיכלי אוויר מלאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקסאן מספיק יש להוסיף את המאגר ממס מיכל הפסולת חייבת להיות ריקה. עבור הפרדה methylesters שומן acyl, לצרף DB-23 טור למכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום לתוך צלוחיות autosampler. הפעל את התוכנה Chemstation עבור GLC במחשב המערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את טמפרטורת כניסת ב 250 ° C עם קצב הזרימה הליום ב 48.6 דקות מ"ל -1 ואת הלחץ על 21.93 psi. יחס הפיצול הוא 30.0: 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמפרטורת התנור נקבע בתחילה עבור 2 דקות ב 140 מעלות צלזיוס, הועלה ל 160 מעלות בקצב של 25 ° C -1 דקות. ואז להגדיר את הטמפרטורה להגדיל מ 160 ° C עד 250 ° C בשיעור של 8 ° C -1 דקות ולהחזיק ב 250 מעלות צלזיוס במשך 4 דקות לאחר מכן ירידה עד 140 ° C בשיעור של 38 ° C דקות - 1. אחת לרוץ לוקח כ 21 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטמפרטורה של גלאי יינון הלהבה היא 270 ° C עם קצב זרימת מימן 30.0 מ"ל -1 דקות, קצב זרימת אוויר ב 400 מ"ל ו -1 דקות הליום קצב הזרימה ב 30.0 דקות -1 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את מספר צלוחיות שמות מדגם בטבלה רצף הריצה. הגדר את 10 μL מזרק להזריק 2 מדגם μL לכל בקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המכשיר מוכן ליזום את רצף הריצה. </li></ol> 5. נציג תוצאות: דוגמאות מכתים בלתי הפיך של TLC מופרד שומנים מן 4 שבועות בת שתילים ארבידופסיס מוצגות באיור 2. שומנים חומצה גופרתית צבעונית (איור 2 א) הם חרוך להופיע כתמים חומים. α-naphthol הוא העדיף כתם glycolipids כגון MGDG, DGDG, SQDG וכו Glycolipids מוכתם α-naphthol לשאת צבע ורוד סגול ואילו שומנים הקוטב השני כתם צהוב (איור 2B). מכתים יוד הוא הפיך והוא נותן שומנים צבע צהבהב זה ייעלם עם הזמן קצר כמו יוד מתאדה (איור 2C). יוד בקצרה שומנים מוכתם יכולה להיות נתונה ניתוח GLC למרות שומנים בלא כתם עדיפים להפחית לשבור של שומנים. אם נעשה בהצלחה, אותות ייחודיים המייצגים שונה שומן acyl methylester יקויימו לאחר GLC (איור 3). Methylester acyl שומן עם שרשרת פחמן קצרות יותר קשרים כפולים יש פחות זמן השמירה קצר באמצעות DB-23 טור. שומן פרופיל acyl methylester הוא כלי רגיש לזיהוי מוטציות עם הרכב השומנים שונה. באיור 4, MGDG18: 3 יחס חומצת שומן טוחנת הוא ירד מוטציה tgd4-1 לעומת סוג בר 18. על ידי חלוקת שומות של שומן acyl methylester עבור בכיתה אחת השומנים עם שומות של כל המעמדות שומנים בדם, יחס טוחנת של כל השומנים מחושבים. לדוגמה, כדי לחשב את יחס טוחנת של MGDG: (MGDG)% mol = Σ [FAMEs (MGDG)] / Σ [FAMEs (סה"כ)] x100% יחס טוחנת וכתוצאה מכך של כל שיעור השומנים מסוג שני בר מוטציה ניתן להשוות. למשל, מוטציה tgd4-1 גדל כמויות היחסי של MGDG ו PG אבל ירד סכומי DGDG ו-PE (איור 5) 18. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> 1. תרשים זרימה תרשים של ניתוח השומנים הקוטב באמצעות שתילים ארבידופסיס. שומנים סך המחולצים 4 שבועות בת שתילים ארבידופסיס ו מופרדים על ידי TLC. שומנים מופרדות ניתן מגורד מהצלחת TLC עבור transesterification ואחריו ניתוח GLC. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. ההפרדה של שומנים על צלחות TLC. תמציות של ליפידים של 35 מ"ג (משקל טרי) שתילים סוג בר מופרדות TLC ומוכתמת על ידי חומצה גופריתית (A), α-naphthol (ב) או אדי יוד (C). שלוש חוזר מוצגים כל שיטה מכתים. DGDG, digalactosyldiacylglycerol;, MGDG monogalactosyldiacylglycerol: PC, phosphatidylcholine; PE, phosphatidylethanolamine: PG, phosphatidylglyceרול; PI, phosphatidylinositol; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. ניתוח GLC Methylesters של חומצות שומן (FAMEs) נגזר MGDG מסוג בטבע. FAMEs מופרדים על עמודה מ 30 נימי זוהה על ידי יינון להבה. Pentadecanoic חומצה (15:00) משמש כסטנדרט פנימי. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. פרופיל חומצת שומן של MGDG בסוג בר col2 (עמודות לבן) ואת tgd4-1 מוטציה (עמודות שחורות). חומצות שומן מוצגים מספר פחמנים ואחריו מספר קשרים כפולים. שלוש חזרות הם ממוצעים וסטיות תקן מוצגים. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. הרכב שומנים פולאר מסוג בר col2 (עמודות לבן) ואת tgd4-1 מוטציה (עמודות שחורות). שלוש חזרות הם ממוצעים וסטיות תקן מוצגים על ידי בר שגיאה.

<ol><li>Ajjawi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+reverse+genetics+in+Arabidopsis%3A+case+studies+from+the+Chloroplast+2010+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Large-scale reverse genetics in Arabidopsis: case studies from the Chloroplast 2010 Project.</a> Plant Physiol. 152, 529-529 (2010).</li>
<li>Andersson, M. X., Kjellberg, J. M., Sandelius, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involvement+of+cytosolic+lipases+in+converting+phosphatidyl+choline+to+substrate+for+galactolipid+synthesis+in+the+chloroplast+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The involvement of cytosolic lipases in converting phosphatidyl choline to substrate for galactolipid synthesis in the chloroplast envelope.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1684, 46-46 (2004).</li>
<li>Awai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phosphatidic+acid-binding+protein+of+the+chloroplast+inner+envelope+membrane+involved+in+lipid+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A phosphatidic acid-binding protein of the chloroplast inner envelope membrane involved in lipid trafficking.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, e10817-e10817 (2006).</li>
<li>Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+lipid+transport+involved+in+organelle+biogenesis+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of lipid transport involved in organelle biogenesis in plant cells.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 25, 71-71 (2009).</li>
<li>Browse, J., McCourt, P. J., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+composition+of+leaf+lipids+determined+after+combined+digestion+and+fatty+acid+methyl+ester+formation+from+fresh+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fatty acid composition of leaf lipids determined after combined digestion and fatty acid methyl ester formation from fresh tissue.</a> Anal. Biochem. 152, 141-141 (1986).</li>
<li>Dormann, P., Balbo, I., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+galactolipid+biosynthesis+and+lipid+trafficking+mediated+by+DGD1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis galactolipid biosynthesis and lipid trafficking mediated by DGD1.</a> Science. 284, 2181-2181 (1999).</li>
<li>Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterial+photosystem+II+at+2.9-A+resolution+and+the+role+of+quinones%2C+lipids%2C+channels+and+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterial photosystem II at 2.9-A resolution and the role of quinones, lipids, channels and chloride.</a> 16, 334-334 (2009).</li>
<li>Hartel, H., Dormann, P., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGD1-independent+biosynthesis+of+extraplastidic+galactolipids+after+phosphate+deprivation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">DGD1-independent biosynthesis of extraplastidic galactolipids after phosphate deprivation in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 10649-10649 (2000).</li>
<li>James, A. T., MARTIN, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-liquid+partition+chromatography%3B+the+separation+and+micro-estimation+of+volatile+fatty+acids+from+formic+acid+to+dodecanoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Gas-liquid partition chromatography; the separation and micro-estimation of volatile fatty acids from formic acid to dodecanoic acid.</a> Biochem. J. 50, 679-679 (1952).</li>
<li>Jordan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+cyanobacterial+photosystem+I+at+2.5+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 A resolution.</a> Nature. 411, 909-909 (2001).</li>
<li>Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-B+monogalactosyldiacylglycerol+synthases+are+involved+in+phosphate+starvation-induced+lipid+remodeling%2C+and+are+crucial+for+low-phosphate+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Type-B monogalactosyldiacylglycerol synthases are involved in phosphate starvation-induced lipid remodeling, and are crucial for low-phosphate adaptation.</a> Plant J. 57, 322-322 (2009).</li>
<li>Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+ATPase+protein+of+Arabidopsis%2C+TGD3%2C+involved+in+chloroplast+lipid+import%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A small ATPase protein of Arabidopsis, TGD3, involved in chloroplast lipid import.</a> J. Biol. Chem. 282, 35945-35945 (2007).</li>
<li>Ohlrogge, J., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid biosynthesis.</a> Plant Cell. 7, 957-957 (1995).</li>
<li>Stahl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography%3B+methods%2C+influencing+factors+and+an+example+of+its+use%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmazie%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography; methods, influencing factors and an example of its use.</a> Pharmazie. 11, 633-633 (1956).</li>
<li>Stoffel, W., INSULL, W., AHRENS, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-liquid+chromatography+of+highly+unsaturated+fatty+acid+methyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Gas-liquid chromatography of highly unsaturated fatty acid methyl esters.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 99, 238-238 (1958).</li>
<li>Welti, R., Wang, X., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry+scan+modes+for+plant+chloroplast+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization tandem mass spectrometry scan modes for plant chloroplast lipids.</a> Anal. Biochem. 314, 149-149 (2003).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+trafficking+between+the+endoplasmic+reticulum+and+the+plastid+in+Arabidopsis+requires+the+extraplastidic+TGD4+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid trafficking between the endoplasmic reticulum and the plastid in Arabidopsis requires the extraplastidic TGD4 protein.</a> Plant Cell. 20, 2190-2190 (2008).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+TGD1+chloroplast+envelope+protein+affects+phosphatidate+metabolism+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Mutation of the TGD1 chloroplast envelope protein affects phosphatidate metabolism in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 17, 3094-3094 (2005).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+permease-like+protein+involved+in+ER+to+thylakoid+lipid+transfer+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A permease-like protein involved in ER to thylakoid lipid transfer in Arabidopsis.</a> EMBO J. 22, 2370-2370 (2003).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

TLC יחד עם GLC מספק כלי חזק ומהיר עבור ניתוח כמותי של שומנים קוטביים בצמחים. שינויים קטנים בהרכב השומנים ניתן לזהות, ולכן בשיטה זו נעשה שימוש להקרנה בקנה מידה גדול של מוטנטים לקויי הקוטב מסלולים מטבוליים השומנים 1,20. שיטה זו היא גם בשימוש נרחב עבור פעילויות ניטור של אנזימים ניצול שומנים קוטבי כמו המצע. 2,6,7 מלבד עלים, הרכב השומנים של רקמות הצמח אחרים כמו שורשים וזרעים או שברים subcellular כגון כלורופלסטים ואת המיטוכונדריה יכול להיות גם נקבע באותו אופן. המערכת ממיס (אצטון, טולואן, מים), המשמש כאן הוא מותאם להפרדת glycolipids ו פוספוליפידים בצמחים. עם זאת, tgd1, 2,3,4 ו מוטנטים כלורופלסטים מבודדים, TGDG פועל יחד עם PE בעוד tetragalactosyldiacylglycerol רץ עם מחשב. במקרה זה מערכת ממס עם חומצה כלורופורם, מתנול אצטית ומים (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) משמש 13. לפעמים דו מימדי TLC באמצעות שתי מערכות שונות ממס מבוצע על glycolipids נפרד נוסף פוספוליפידים 19. בנוסף, רקמות הצמח יכול להיות כפופים ישירות התגובה תהילה ואחריו GLC כדי לקבוע את פרופיל הכולל חומצת שומן ללא הפרדה ראשונית על TLC 5. לצד TLC-GLC הפגינו מערכת, שיטה נוספת המשמשת פרופיל השומנים מבוסס על יינון ישיר מסה electrospray טנדם ספקטרומטריית 17. בשיטה זו ההפרדה chromatographic ראשוני של שומנים לחלץ את מושמט. עם זאת, שיטה זו דורשת ציוד יקר וכוח אדם מנוסה, מה שהופך אותו פחות שימושי עבור ניתוחים שגרתי במעבדה או להקרנה מוטציה.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;-naphthol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1000</td><td></td></tr><tr><td>HCl מתנאלול 3N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33050-U</td><td>דילול ל-1N באמצעות מתנול</td></tr><tr><td>לוחיות TLC מסוג Si250-PA</td><td>JT Baker</td><td>7003-04</td><td>עם חומר סופח מקדים</td></tr><tr><td>תא TLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z266000</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות עם פקק הברגה</td><td>VWR international</td><td>53283-800</td><td></td></tr><tr><td>פקקי הברגה</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td></td></tr><tr><td>דיסק PTFE</td><td>Sun Sri</td><td>200 608</td><td></td></tr><tr><td>מערכת GLC</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP6890</td><td></td></tr><tr><td>עמודה מסוג DB-23</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>122-2332</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני GLC</td><td>Sun Sri</td><td>500 132</td><td></td></tr><tr><td>פקקים לבקבוקוני GLC</td><td>Sun Sri</td><td>201 828</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Chemstation</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2070AA</td><td></td></tr></tbody></table>

thaliana ארבידופסיס פולאר glycerolipid פרופיל ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (tlc) יחד עם כרומטוגרפיה גז נוזלי (glc)

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

ביולוגית ממברנות תאים נפרדים מהסביבה. מתא יחיד צמחים ובעלי חיים תאיים, glycerolipids, כגון phosphatidylcholine או phosphatidylethanolamine, bilayer טופס ממברנות אשר ישמש הן גבולות וממשקים לחילופי כימית בין התאים וסביבתם. שלא כמו בעלי חיים, בתאי צמח יש אברון מיוחד הפוטוסינתזה, הכלורופלסט. מערכת קרום המורכב של הכלורופלסט מכיל glycerolipids ייחודי, כלומר glycolipids חסר זרחן: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4. התפקידים של שומנים אלה הם מעבר מבניים פשוט. Glycolipids אלה glycerolipids אחרים נמצאו מבנים גבישיים של photosystem I ו-II המעידים על מעורבות של glycerolipids בפוטוסינתזה 8,11. במהלך רעב פוספט, DGDG מועבר ממברנות extraplastidic כדי לפצות על אובדן פוספוליפידים 9,12. רוב הידע שלנו על ביוסינתזה והתפקוד של שומנים אלה כבר נגזר משילוב של מחקרים גנטיים ביוכימיים עם 14 thaliana ארבידופסיס. במהלך מחקרים אלו, הליך פשוט לניתוח של שומנים קוטביים כבר חיוני ההקרנה וניתוח של מוטנטים שומנים יפורטו בפירוט. תמצית השומנים עלה מופרד לראשונה על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) ו glycerolipids מוכתמות הפיך עם אדי יוד. שומנים בודדים מגורד מהצלחת TLC המרה methylesters acyl שומן (FAMEs), אשר מנותחות על ידי גז כרומטוגרפיה נוזלית, יחד עם גילוי אש יינון (FID-GLC) (איור 1). שיטה זו הוכחה להיות כלי אמין להקרנה מוטציה. לדוגמה, tgd1, 2,3,4 endoplasmic reticulum-to-plastid סחר מוטנטים השומנים התגלו על בסיס הצטברות של galactoglycerolipid חריג: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) וירידה בשיעור היחסי של 18:03 (פחמנים: כפול אג&quot;ח) קבוצות acyl שומן שומנים קרום 3,13,18,20. שיטה זו היא גם רלוונטי לקביעת פעילות אנזימטית של חלבונים באמצעות שומנים כמו המצע 6.

הרכב תמציות השומנים הקוטב הרכב חומצות שומן של glycerolipids הפרט נקבעים ניסוי פשוט חזקים פרופיל השומנים. לענין זה, glycerolipids מבודדים על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה נתונה transmethylation של קבוצות acyl שלהם. Methylesters acyl שומן הם לכמת ידי כרומטוגרפיה גז נוזלי.

Thaliana ארבידופסיס פולאר Glycerolipid פרופיל ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) יחד עם כרומטוגרפיה גז נוזלי (GLC)

ממברנות ביולוגיות מפרידות בין התאים לבין הסביבה. מתא בודד ועד לצמחים ובעלי חיים רב-תאיים, גליסרוליפידים, כגון...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לקבוע את הרכב הליפידים הפולאריים של נבטי arabidopsis. מטרה זו מושגת תחילה על ידי מיצוי ליפידים מהנבטים. לאחר מכן, הליפידים הפולאריים מופרדים באמצעות כרומטוגרפיה בשכבה דקה.בשלב הבא, מבודדים כתמי ליפידים ספציפיים מלוח השכבה הדקה וממירים אותם למתילים של אסטרי חומצות שומן באמצעות טרנס-אסטריפיקציה. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא כימות ההרכב של מתילים של אסטרי חומצות שומן באמצעות כרומטוגרפיה גזית-נוזלית. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את היחס המולרי ואת פרופיל חומצות השומן של כל ליפיד פולרי בזן הבר (wild type) ובמוטנט.שלום, שמי כריסטוף בנינג. רבים מכם שאלו אותנו כיצד לבצע ניתוח כמותי של ליפידים פולריים. אנו משתמשים בשיטה פשוטה ועמידה מאוד ששירת אותנו היטב במהלך סריקה רחבת היקף של מוטנטים בצמח המודל opsis או ה-RG kilometer motors.שיטות מצוינות אחרות, כגון פרופיל ליפידים המבוסס על ספקטרומטריית מסות, דורשות ציוד יקר וניסיון והכשרה רבים. אנו משתמשים בהליך דו-שלבי הכולל כרומטוגרפיה בשכבה דקה פשוטה בשילוב עם כימות של מתיל-אסטרים של חומצות שומן לאחר בידוד המוטנטים. בדרך כלל נדרש ניתוח כמותי יותר.פעולה זו מבוצעת על ידי בידוד ליפידים של ממברנות מלוח שכבה דקה והכנת מתילים של אסטרים של חומצות שומן, הנמדדים כמותית באמצעות כרומטוגרפיה גזית-נוזלית. השיטה ניתנת לשחזור רב ותוצאותיה ניתנות להשוואה לטכניקות מורכבות יותר המבוססות על ספקטרומטריית מסות, מה שמוכיח כי הפרוצדורה תבוצע על ידי Zen Wang, סטודנט לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי. התחילו את מיצוי הליפידים על ידי איסוף של 30 מיליגרם של עלי Arabidopsis בני ארבעה שבועות מצמחים שגודלו על מצע אגר-סוליד או בקרקע. העבירו את העלים למבחנות תגובה מפרופילן בנפח 1.5 מיליליטר.הוסף 300 µL של ממס מיצוי המורכב ממטנול, כלורופורם וחומצה פורמית לכל דגימה. נער את הדגימות בעוצמה במשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף 150 µL של חומצה זרחית 0.2 M, אשלגן כלוריד 1 M, ובצע ערבול בוורטקס.בצע סבב צנטריפוגה קצר לדגימה ב-13,000 ×g למשך דקה אחת. בטמפרטורת החדר, יש להטיל את הליפידים המומסים בפאזה התחתונה של הכלורופורם על לוחות כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC). להכנת לוחות ה-TLC, טבול לוח TLC מצופה סיליקה ג'ל עם פס טעינה, בגודל 20 על 20 סנטימטר, בתמיסת אמון סולפט 0.15 מולארית.לאחר טבילה של 30 שניות, ייבשו את הפלטה למשך יומיים לפחות בתוך מכל מכוסה. במהלך ההפעלה, סובלימציה של אמוניום משאירה חומצה גופרתית, אשר פרוטונציה של פוספט וגליצרול נחוצה להפרדתם מליפידים אחרים של גליצרול. ביום הניסוי, הפעילו את פלטות ה-TLC על ידי אפייתן בתנור בטמפרטורה של 120 °C למשך שעתיים וחצי.לאחר קירור הפלטות המופעלות לטמפרטורת החדר, השתמש בעיפרון כדי לסמן קו ישר לרוחב הפלטה בנקודת ההתחלה של הכרומטוגרמה. במנדף כימיים, השתמש בצינור טיגון המחובר לווסת של מיכל החנקן כדי לספק זרם של גז חנקן; העבר לאט שלוש פעמים 20 µL של תמצית הליפידים מהפאזה התחתונה של הכלורופורם אל הפלטה, באמצעות פיפט של 20 µL עם טיפ פלסטיק צהוב של 200 µL תחת זרם איטי של גז חנקן. השתמש בפיפט של 20 µL כדי לשמור על גודל הנקודה כך שיהיה קטן מקוטר של סנטימטר אחד.כל פלטה יכולה להכיל עד 10 דגימות בזמן שנקודות הליפידים מתייבשות לחלוטין. בתוך מapay מנדף, הכין את ממס הפיתוח המורכב מאצטון, טולואן ומים. שפוך 80 milliliters של ממס הפיתוח לתוך תא פיתוח TLC הניתן לאטימה והנח את הפלטה בתוך התא.אטמו את המכל כאשר קצה הדגימה פונה כלפי מטה. באמצעות הסוגר, הממס יעלה במעלה הפלטה והליפידים יופרדו. זמן הפיתוח הוא כ-50 דקות בטמפרטורת החדר.כאשר חזית הממס מגיעה למרחק של סנטימטר אחד מהחלק העליון של הפלטה, הוצא את הפלטה בזהירות מהמיכל והייבש אותה לחלוטין במנדף במשך 10 דקות. ליפידים שהופרדו ב-TLC ניתן לצבוע באופן הפיך לזמן קצר ביוד לצורך אנליזה כמותית, או לצבוע באופן בלתי הפיך בחומצה גופרתית או ב-alpha natal. לצביעה בלתי הפיכה, צבע את הפלטה באמצעות פחם של חומצה גופרתית.יש לרסס את הפלטה ב-50% sulfuric acid במים באמצעות בקבוק ריסוס מזכוכית בתוך מКС, ולאחר מכן לחמם אותה בטמפרטורה של 120 degrees Celsius למשך 15 דקות. לעומת זאת, כאשר מבצעים צביעת alpha natal עבור glycolipids, יש לרסס את הפלטה ב-2.4% weight over volume alpha natal ב-10% volume over volume sulfuric acid ו-80% volume over volume Ethanol, ולחמם את הפלטה בטמפרטורה של 120 degrees Celsius למשך שלוש עד חמש דקות, עד שנקודות ה-glycolipid נצבעות בוורוד או סגול.ביצוע צביעה ביוד: בתוך מבתח, הכינו מיכל TLC סגור עם גבישי יוד במגש בתחתית המיכל, באופן שיוביל לרוויית האטמוספירה באדי יוד. הכניסו את לוח ה-TLC לתוך המיכל כדי לחשוף אותו ליוד עד שהליפידים יהיו גלויים. אין לחשוף ליוד זמן רב מדי, שכן היוד עלול להיקשר באופן קוולנטי.שנה חומצות שומן רב-בלתי רוויות. הסר באמצעות להב תער את הסיליקה המקיפה את כתמי הליפידים שזוהו בלוח ה-TLC וגרד את הסיליקה המכילה את הליפידים. באמצעות משפך, העבר את אבקת הסיליקה לשפופרת זכוכית בעלת פקק הברגה עם ציפוי Teflon.הוסף באמצעות פיפטת זכוכית מיליליטר אחד של חומצה הידרוכלורידית בתוך מתנול אנहाइडרי לכל דגימה. לאחר מכן, הוסף לכל דגימה 100 µL של חומצה פנטדקנוית בריכוז 50 µg/mL כסטנדרט פנימי, באמצעות פיפטה של 200 µL עם טיפ פלסטיק צהוב של 200 µL. הכן בנוסף מבחנה המכילה חומצה פנטדקנוית בלבד במתנול עם חומצה הידרוכלורידית כביקורת.סגרו את מבחנות הזכוכית היטב באמצעות פקקים עם ציפוי טפלון. דגרו את מבחנות הזכוכית באמבט מים בטמפרטורה של 80 degrees Celsius למשך 25 דקות. על המבחנות להיות אטומות כדי למנוע התאיידות של הממס לאחר קירור המבחנות.הוסיפו מיליליטר אחד של 0.9% sodium chloride ולאחריו מיליליטר אחד של hexane, ולאחר מכן ערבבו במכשיר vortex בעוצמה. סבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 1000×g למשך שלוש דקות. לאחר הצנטריפוגה, הסירו את שכבת ה-hexane העליונה של הדגימה באמצעות פיפטה בתוך מנדף, והעבירו אותה לשפורורת זכוכית חדשה במידות של 13 על 100 מילימטר. אידו את ה-hexane תחת זרימה איטית של חנקן מבלי לייבש לחלוטין, והמיסו את ה-fatty acid methyl esters שהתקבלו ב-60 µL של hexane. העבירו את הדגימות לבקבוקוני דגימה של autosampler, ואז סגרו אותם היטב.ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לטווח קצר ובמינוס 20 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים לפני תחילת ה-GLC. יש לוודא שבאללי ההליום, המימן והאוויר יש מספיק גז; יש להוסיף hexane למאגר הממס ולוודא שמיכל הפסולת ריק לצורך הפרדת fatty acid methyl esters. חברו עמודת DB 23 למכשיר.הנח את המבחנות במדגם האוטומטי. הפעל את תוכנת ה-chem station עבור GLC במחשב המערכת. הגדר את טמפרטורת הכניסה ל-250 °C עם קצב זרימה של helium של 48.6 mL/min, ולחץ של 21.93 PSI.יחס הפיצול הוא 30 ל-1. טמפרטורת התנור נקבעת בתחילה על 140 °C למשך שתי דקות ומועלית ל-160 °C בקצב של 25 °C לדקה. לאחר מכן, קבע את הטמפרטורה כך שתעלה מ-160 °C ל-250 °C בקצב של 8 °C לדקה, ותישמר ב-250 °C למשך ארבע דקות, ולאחר מכן תרד ל-140 °C בקצב של 38 °C לדקה.בשימוש בפרופיל טמפרטורה זה, ריצה אחת אורכת כ-21 דקות. טמפרטורת גלאי יינון הלהבה היא 270 °C עם קצב זרימה של מימן של 30 mL/min. קצב זרימת האוויר הוא 400 mL/min וקצב זרימת ההליום הוא 30 mL/min.הזינו את מספר המבחנות ואת שמות הדגימות בטבלת רצף ההרצה. הגדירו את המזריק של 10 µL להזרקת 2 µL של הדגימה לכל מבחנה. כאשר המכשיר מוכן, התחילו את רצף ההרצה.דוגמאות לצביעה של ליפידים שהופרדו ב-TLC מנבטי Arabidopsis בני ארבעה שבועות מוצגות כאן. הליפידים שנצבעו בחומצה גופרתית נחרכים ומופיעים ככתמים חומים. Alpha natal מועדף לצביעת גליקוליפידים כגון M-G-D-G-D-G-D-G ו-SQ dg.גליקוליפידים שנצבעו ב-alpha natal מקבלים גוון ורוד-סגול, בעוד שליפידים קוטביים אחרים נצבעים בצהוב. הצביעה ביוד היא הפיכה ומעניקה לליפידים גוון צהבהב שייעלם תוך זמן קצר עם התאיידות היוד. בקצרה, ניתן להעביר ליפידים שנצבעו ביוד לאנליזת GLC, אם כי ליפידים שלא נצבעו עדיפים כדי להפחית את פירוק הליפידים, במידה והדבר בוצע בהצלחה.אותות מובחנים המייצגים מתילים של חומצות שומן שונים ייראו לאחר GLC; למתילים של חומצות שומן עם שרשראות פחמן קצרות יותר ופחות קשרי כפולות יהיה זמן שהייה קצר יותר. בשימוש בעמודת DB 23, פרופיל של מתילים של חומצות שומן הוא כלי רגיש לזיהוי מוטנטים עם הרכב ליפידי שונה.יחס המולרי של שלושת חומצות השומן ב-MGDG 18 פחסי במוטנט TGD 4-1 נמוך יותר בהשוואה לסוג הפרא (wild type), זאת על ידי חלוקת המולים של Fatty acid methyl ester עבור מחלקת ליפיד אחת במולים של Fatty acid methyl ester. עבור כל מחלקות הליפידים, מחושבים היחסים המולריים של כל ליפיד, וכך ניתן להשוות כאן את היחסים המולריים שהתקבלו עבור כל מחלקת ליפיד הן בסוג הפרא והן במוטנט. ניכר כי במוטנט TGD 4-1 קיימות כמויות יחסיות מוגברות של MGDG ו-pg, אך כמויות מופחתות של DGDG ו-NPE. כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) מאפשרת בדיקה של דגימות רבות במקביל ומאפשרת בחינה ויזואלית של הבדלים משמעותיים בפרופילי הליפידים.יתרה מכך, בבחינת TLC, אתם בוחנים למעשה אנזימים וגנים רבים הדרושים לסנתזה של הליפידים ולפיכך את פרופיל הליפידים. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי הדרך לניתוח הרכבם של ליפידים פולריים באמצעות TOC ו-GOC. תודה שצפיתם בסרטון, ובהצלחה בניסוי שלכם.

arabidopsis-thaliana-polar-glycerolipid-profiling-thin-layer

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

לציפורן המפעל היא הכיסוי החיצוני דונגי על צמחים שיש לו תפקיד עיקרי חיסכון במים אלא גם מחסום חשוב נגד כניסתם של מיקרואורגניזמים פתוגניים. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ניתוח לציפורן מוטנטים צמח שזוהה על ידי קדימה הפוכה גישות הגנטיקה.

השימוש מוטאנטים eceriferum ארבידופסיס לחקור לציפורן ביוסינתזה הצמח

כאן אנו מתארים שיטה חזקה לחלוקה של ממברנות פלזמה צמח לקרומים מסיסים עמידים וחומרי ניקוי חומרי ניקוי המבוססת על תערובת של ללא תווית וin vivo באופן מלא 15 N תרביות תאי thaliana ארבידופסיס שכותרתו. ההליך מיושם ללימודי proteomic השוואתיים להבין תהליכי איתות.

מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

integument יונקים מכיל שומני ממס לחילוץ שיכול לספק אופייני הרכב כימי של מינים בודדים. מאמר זה מציג שיטה שגרתית להפרדת כיתות שומנים רחבות בודדו מרקמות הכסות באמצעות כרומטוגרפיה בשכבה דקה וקביעת פרופיל triacylglyceride ידי ספקטרומטריית בסיוע מטריקס לייזר desorption / יינון הזמן של הטיסה המונית.

פרופיל תוכן Triacylglyceride בשומני הכסות בת על ידי כרומטוגרפיה Preparative שכבה דקה וMALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

ידע של ההרכב של SAP השיפה כמו גם את המנגנון של התחבורה והטעינה למרחקים ארוכים שלה הוא חיוני להבנה של איתות למרחקים ארוכים בפיתוח ומתח / תגובת פתוגן צמח ולהטמיע תחבורה. כתב יד זה מתאר את האוסף של פליטות השיפה בשיטה EDTA-הקל.

איסוף וניתוח של<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; השיפה exudates שימוש בשיטת EDTA-הקלה

פוליאסטרים ליפידים מהווים את המרכיבים המבניים של שני שינויים בדופן התא, ציפורן הצמח ומחסומי דיפוזיה המכילים סוברין. בסרטון זה אנו מתארים שיטה לדה-פולימריזציה של קוטין מעלים שלמים נטולי שומן. ניתן ליישם את השיטה לחקירת מוטציות שנפגעו בביוסינתזה של קוטין או סוברין.

בידוד והלחנת ניתוח של צמח מונומרים פוליאסטר שומנים ציפורן

ליפאזות (פוספו)ליפאזות חזויות רבות מאופיינות בצורה גרועה מבחינת הספציפיות של הסובסטרט והתפקודים הפיזיולוגיים שלהן. כאן אנו מספקים פרוטוקול לייעול פעילות האנזימים, חיפוש אחר סובסטרטים טבעיים ומציעים פונקציות פיזיולוגיות לאנזימים אלה.

הגדרת מצע ספציפי עבור מועמדי lipase ו פוספוליפאז

פרוטוקול מיצוי מקיף של שומנים, מטבוליטים חלבונים מ רקמות ביולוגיות באמצעות מדגם אחד מוצג.

שיטה פשוטה הפיצול מופץ לניתוח מקיף של מטבוליטים, שומנים וחלבונים מדגם יחיד

מוצג כאן היא גישה זרחנית, כלומר לעצור וללכת מיצוי קצה מבוסס פוספופרוטומית, אשר מספק תפוקה גבוהה כיסוי עמוק של ערבידופסיס phosphoproteome. גישה זו מתווה את הסקירה של איתות מתח אוסמוטי ב Arabidopsis.

אסטרטגיה פוספוטומית ליצירת פרופיל של איתות מתח אוסמוטי ב- Arabidopsis

כאן, פרוטוקול מוצג עבור תיוג מטבולי של שמרים עם 14C-חומצה אצטית, אשר יחד עם כרומטוגרפיה שכבה דקה להפרדה של שומנים ניטרליים.

ניתוח של סינתזת שומנים נייטרלית ב cerevisiae Saccharomyces על ידי תיוג מטבולי כרומטוגרפיה שכבה דקה

פרוטוקול מהיר ויעיל מוצג לבידוד של טיפות שומנים plastoglobule הקשורים אורגניזמים פוטוסינתטיים שונים. הכנה מוצלחת של פלסטוגלובולים מבודדים היא צעד ראשון מכריע שקדם למחקרים מולקולריים מפורטים כגון ניתוחים פרוטאומיים וליפידומיים.

בידוד טיפות שומנים פלסטוגלובול מרקמת עלי הצמח וציאנובקטריה

למד שיטה פשוטה וחזקה לניתוח פרופיל ליפידים פולאריים ב-Arabidopsis thaliana באמצעות כרומטוגרפיה בשכבה דקה וכרומטוגרפיית גז נוזלי. מתאים לסקר מוטנטים בקנה מידה גדול.

Thaliana ארבידופסיס פולאר Glycerolipid פרופיל ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) יחד עם כרומטוגרפיה גז נוזלי (GLC)

גלה סרטונים נוספים