טרנספורמציה של DNA פלסמיד לתוך החיידק שימוש בשיטה הלם חום

היי, אני אלכס הוג. אני עובדת במעבדת חדר כושר במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה באוניברסיטת קליפורניה באירווין. והיום אני הולך להראות לכם כיצד להפוך אי קולי מוכשר חשמלית בשיטה של כל שוק.

אז היום אני משתמש בטכניקה הזו כדי להפוך קולי עם תוצר הלציה שלי כי אני עושה בדיקה כדי לבצע איזציה שלמה של דג הזברה. אוקיי, אז נתחיל לעשות את השינוי. אז קודם כל אתה צריך שיהיה לך אמבט מים או אוטובוס יבש ב-42 מעלות.

אתה צריך שיהיו לך חיידקים שזה עתה הוצאת מהעיר המרכזית בקרח. כיום אנו משתמשים בתאי כשירות חשמלית מ-ities וגם ב-DNA שלך בקרח. כמו כן, אתה צריך שפופרת של מדיה SOC בטמפרטורת הבית או 37 וצלחות ה-LV שלך בתוספת מדיה אנטיביוטית.

אז עכשיו אני הולך להוסיף את הדנ"א עם החיידקים. אז אני עובד ליד הלהבה כדי לא לזהם את החיידקים. אז אני מוסיף לציה עם החיידקים.

זה 50 מיקרוליטר של חיידקים ואז מיד בחזרה לקרח אתה יכול להעיף אותו מעט כדי לערבב את החיידקים והדנ"א שלך ואתה משאיר עד 15 דקות בקרח. אז עכשיו עברו 15 דקות ואנחנו מוכנים לעשות את הלם החום, כלומר לשים את החיידקים על 42 מעלות למשך 45 שניות. אז אני מוציא את הצינורות מהקרח ישירות בסט של 42 מעלות, 30 טיימר 45 שניות, ואז אני מחזיר אותם לקרח מהר מאוד ושם אותם מתוך 42 ישירות על הקרח.

ואז אנחנו מחכים שתי דקות. אז עכשיו אני הולך להוסיף את מדיית ה-SOC לחיידקים ולשים אותם על 37 למשך 30 דקות. אז אני מאדה אותו 500 מיקרוליטר של מדיה SOC ואני מכניס אותו לחיידקים ומכניס אותם לתא המאולתר הקטן שלי.

אז אם אתה מתכוון להשתמש בצינורות eend ובתא מאולתר עבור החממה שלך, הקפד לשים את צינורות הקצה שלך אופקיים מכיוון שהם ירעדו הרבה יותר טוב ככה. אז עכשיו אנחנו מוכנים להכניס את הצינורות לשייקר. לכן יש לנו את החדר הקטן הזה ב-37 מעלות למשך 30 דקות.

אז עכשיו סיימנו את הדגירה ב-37 מעלות ואנחנו הולכים לצלחת את החיידקים על lb בתוספת אנטיביוטיקה. אז במקרה שלי זה כלורל. אז ב 50 מיקרוליטר מכל דגימה והנחתי אותה על הצלחת.

אז עם 500 המיקרוליטר הנותרים, אתה מסובב אותם למטה בשולחן קטן, חלקם מסרבים כדי לקלף אותו את החיידקים. אז לאחר הבדיקה נקבל כדור נחמד ומה שאנחנו הולכים לעשות עכשיו זה להסיר כמעט את כל אמצעי ה-SOC, פשוט להשאיר 50 מיקרוליטר ואז נוכל לצלחת את ה-50 מיקרוליטר של החיידקים המרוכזים. אז אני משלם בערך 450 מיקרוליטר.

אני פשוט עוזב את זה הרבה. אז עכשיו אני הולך לתלות את המזרן ב-50 מיקרוליטר שנותר ממדיית SOC. ואחרי זה אני יכול לצלחת את ה-50 מיקרוליטר האלה, על צלחת אחרת.

אז אני מתנגד לכל משטח, ואז אני מפעיל אותו בבובות ואני לוח. כך שבסוף יהיו שתי צלחות, לכל דגימה. אז עכשיו אנחנו צריכים להפיץ את החיידקים על צלחת LB.

אז אני הולך להשתמש בכמה חרוזי זכוכית חיטוי, אבל אתה יכול גם להשתמש בצינור מעבר שאתה מעצב למפזר כזה. אז אני הולך לשים כמה חרוזים על צלחת הפטרי. זה מוצא חן בעיניי.

ובכן, 10 15. אז אחרי שאתה מוסיף את החרוזים, אתה שם את כל הצלחות שלך בערימה כזו ואתה מנער אותן בעדינות כדי שהחרוזים יפזרו את החיידקים בכל מקום באופן שווה על הצלחות. אז כשאני מזיז את הצלחות עד שהן יבשות.

אז מה שאומר שאתה לא צריך לראות פסים גדולים של נוזל כשאתה זז עם החרוזים. לדוגמה, בצלחת הזו, החרוזים נוטים לקרוס יחד ולראות הרבה פסים. זה זיעה, החרוזים נעים בחופשיות, זה יבש.

אז עכשיו הצלחות יבשות כדי שנוכל להשליך את החרוזים. אז אני פשוט הולך ככה כדי שתוכל למחזר אותם. אז עכשיו אנחנו הולכים לשים את הצלחת בחממה ב-37 בלילה, ואתה שם את הצלחות הפוכות אחרי 12 שעות של דגירה ב-37, אנחנו מוציאים את הצלחת מהחממה.

וכפי שאנו יכולים לראות, יש לנו פחות מושבות בצלחת שבה אני לוחת 50 מיקרוליטר מאשר בצלחת שבה ציפיתי את השאר. מה שחשוב כשאתה משנה חיידקים הוא שתהיה לך את הכמות הנכונה של מושבות בצלחת שלך, את הצפיפות הנכונה. אז במקום הזה יש לך מעט מאוד מושבות, אבל אם אתה רוצה עוד מושבות, אתה יכול לקבל את הדוגמה הטובה בצלחת הזו שבה זה בדיוק הצפיפות הנכונה, בערך 100 מושבות לצלחת.

הצלחת הזו היא דוגמה גרועה מכיוון שיש יותר מדי מושבות ואי אפשר לבחור מושבות בודדות. אז הראיתי לכם איך לשנות אי קולי על ידי כל טרנספורמציה. אז ההיבט החשוב מאוד של הטכניקה הזו הוא לשמור על הכל או קר כקרח לפני ההלם.

ואז 45 שניות רגילות, יותר ב-42 מעלות בחזרה בקרח. ואז כל השאר צריך להיות בטמפרטורה חמה או 37 מעלות. אז עכשיו אני הולך לסנן את המושבות שלי על ידי בדיקת PCR.

אז אחת הנקודות היא גם שיהיו שתי צלחות. אז ראשית, אנחנו מצפים שיהיו לנו הרבה מושבות ומושבות אחת פחות. ומה שחשוב הוא שהצלחות שלך יבשות מאוד בעזרת חרוזים או מעבר הצינור.

תודה על הצפייה ובהצלחה עם האישור שלך.