טרנספורמציה של DNA פלסמיד לתוך החיידק שימוש בשיטה הלם חום

שלום, אני אלכס הוג. אני עובד במעבדת Gym Hall במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה באוניברסיטת קליפורניה אירביין. והיום אני אראה לכם כיצד לבצע טרנספורמציה של חיידקי E coli בעלי כשירות חשמלית (electrically competent) בשיטת האלקטרופורציה (electroporation).

היום אני משתמש בטכניקה זו כדי לבצע טרנספורמציה של E. coli עם תוצר הליגציה שלי, מכיוון שאני מבצע ניסוי לצורך ביצוע whole mount hybridization בדגי zebrafish. אוקיי, נתחיל בביצוע הטרנספורמציה. ראשית, עליכם להכין את אמבט המים או את המקלט היבש בטמפרטורה של 42 °C.

עליך להחזיק את הבקטריות שהוצאת זה עתה מהתרבית הראשית בקרח. היום נשתמש בתאי COMPETENCE חשמליים מ-ities וב-DNA שלך בקרח. כמו כן, עליך להכין מבחנה של מצע SOC בטמפרטורת החדר או ב-37°C ואת צלחות ה-LV עם מצע אנטיביוטיקה.

כעת אוסיף את ה-DNA אל החיידקים. אני עובד לצד הלהבה כדי למנוע זיהום של החיידקים. אני מוסיף תמיסה עם החיידקים.

מוסיפים 50 µL של חיידקים ולאחר מכן מחזירים מיד לקרח; ניתן לנער קלות כדי לערבב את החיידקים ואת ה-DNA, ולהשאיר בקרח למשך עד 15 דקות. כעת, לאחר שעברו 15 דקות, אנו מוכנים לביצוע ההלם התרמי (heat shock), הכולל הנחת החיידקים בטמפרטורה של 42 °C למשך 45 שניות. אני מוציא את המבחנות מהקרח ומעביר אותן ישירות ל-42 °C, מכוון את הטיימר ל-45 שניות, ולאחר מכן מחזיר אותן במהירות רבה מה-42 °C ישירות לקרח.

לאחר מכן נמתין שתי דקות. כעת אוסיף את מצע ה-SOC לחיידקים ואדגיר אותם ב-37°C למשך 30 דקות. אני שואב 500 µL של מצע SOC, מוסיף אותו לחיידקים ומניח אותם בתא הדגירה המאולתר שלי.

לכן, אם אתם משתמשים במבחנות eend ובתא מאולתר עבור האינקובטור שלכם, ודאו שאתם מניחים את מבחנות ה-eend באופן אופקי, כיוון שהן יורעדו בצורה טובה יותר כך. כעת אנו מוכנים להכניס את המבחנות למנער. זו הסיבה שיש לנו את התא הקטן הזה ב-37 °C למשך 30 דקות.

כעת סיימנו את הדגירה ב-37 °C ואנו נעביר את החיידקים לצלחות LB בתוספת אנטיביוטיקה. במקרה שלי, מדובר ב-chloral. אני שואב 50 µL מכל דגימה ומניח אותה על הצלחת.

כעת, עם 500 µL הנותרים, סובב אותם בצנטריפוגת שולחנית קטנה כדי לשקע את הבקטריות. לאחר הצנטריפוגה נקבל משקע יפה, וכעת נסיר כמעט את כל מצע ה-SOC, ונשאיר רק 50 µL, ואז נוכל לזרוע את 50 µL הללו של בקטריות מרוכזות. לכן, הסרתי כ-450 µL.

אני משאיר את הכמות הזו. כעת אני עומד לתלה את המשקע ב-50 µL שנותרו של מצע SOC. לאחר מכן אוכל לזרוע את ה-50 µL הללו על פלטה אחרת.

כעת אני מרטיב כל פלטה, לאחר מכן מעביר את התוכן ומפזר אותו על הפלטה. כך שיהיו בסוף שתי פלטות לכל דגימה. כעת עלינו לפרוס את החיידקים על פלטת LB.

לכן אני אשתמש בחרוזי זכוכית שעברו עיקור באוטוקלאב, אך ניתן להשתמש גם בפיסת צינור שעיצבת לצורת פורס (spreader) כזו. אני אניח מספר חרוזים על פטרי dish. אני מעדיף את השיטה הזו.

ובכן, 10 15. לאחר הוספת החרוצים, הניחו את כל הצלחות בערימה כזו ונערו אותן בעדינות כדי שהחרוצים יפזרו את החיידקים באופן שווה על פני הצלחות. המשיכו להזיז את הצלחות עד שהן יתייבשו.

כלומר, לא אמורות להופיע רצועות גדולות של נוזל כאשר מזיזים את החרוצים. לדוגמה, בצלחת ההיא, החרוצים נוטים לקרוס זה לתוך זה וניתן לראות רצועות רבות. זוהי דוגמה למצב רטוב, בעוד שזו דוגמה למצב יבש שבו החרוצים נעים בחופשיות.

כעת, לאחר שהפלטות יבשות, ניתן להסיר את חרוזי המגנט. אני פשוט מושך אותם כך כדי שניתן יהיה למחזר אותם. כעת נכניס את הפלטה לאינקובטור ב-37°C למשך הלילה, כאשר הפלטות מונחות הפוך. לאחר 12 שעות של אינקובציה ב-37°C, נוציא את הפלטה מהאינקובטור.

וכפי שניתן לראות, ישנן פחות מושבות בצלחת שבה זרעתי 50 microliter מאשר בצלחת שבה זרעתי את השאר. דבר שחשוב בעת טרנספורמציה של חיידקים הוא להגיע לכמות הנכונה של מושבות בצלחת, כלומר לצפיפות הנכונה. בצלחת זו ישנן מעט מאוד מושבות, אך אם ברצונכם להשיג יותר מושבות, ניתן לראות דוגמה טובה בצלחת זו שבה הצפיפות היא בדיוק הנכונה, כ-100 מושבות לצלחת.

צלוחית זו היא דוגמה רעה מכיוון שיש בה יותר מדי מושבות ולא ניתן לבודד מושבות בודדות. לכן, הדגמתי לכם כיצד לבצע טרנספורמציה של e coli באמצעות כל שיטת טרנספורמציה. היבט חשוב מאוד בטכניקה זו הוא לשמור על כל הרכיבים קרים על קרח לפני השוק התרמי.

לאחר מכן 45 שניות בטמפרטורה רגילה, זמן נוסף ב-42 degree וחזרה לקרח. ואז כל השאר חייב להיות בטמפרטורה חמימה או 37 degree. כעת אני אסנן את המושבות שלי באמצעות סריקת PCR.

לכן, אחת המטרות היא להשתמש בשתי צלחות. באחת אנו מצפים להרבה מושבות, ובשנייה לפחות מושבות. חשוב שהצלחות יהיו יבשות מאוד, באמצעות שימוש בחרו지를 או בpipette.

תודה שצפיתם ובהצלחה בתהליך האישור שלכם.