Name: טרנספורמציה של DNA פלסמיד לתוך החיידק שימוש בשיטה הלם חום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: למדו את שיטת הלם החום להעברת DNA פלסמיד לתאי E. coli כשירים חשמלית. טכניקה זו מכינה חיידקים לניסויים עתידיים בדגי זברה ומספקת מדריך ויזואלי חיוני למחקרים בביולוגיה מולקולרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

טרנספורמציה של dna פלסמיד לתוך החיידק שימוש בשיטה הלם חום

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

טרנספורמציה של DNA פלסמיד לתוך החיידק בשיטה הלם חום היא טכניקה בסיסית של ביולוגיה מולקולרית. זה מורכב של החדרת מוצר פלסמיד או קשירת זרים לתוך חיידקים. זה פרוטוקול וידאו המתאר את השיטה המסורתית של שינוי באמצעות זמינים מסחרית חיידקים המוסמכת כימית Genlantis. לאחר דגירה קצרה קרח, תערובת של חיידקים כימית המוסמכת ו-DNA ממוקם ב 42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות (הלם חום) והניח ואז חזרה בקרח. SOC התקשורת מתווסף ותאי שינה מודגרת על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם תסיסה. כדי להיות סמוך ובטוח של בידוד מושבות ללא תלות יעילות טרנספורמציה, שתי כמויות של חיידקים הם הפכו מצופים. פרוטוקול זה המסורתי יכול לשמש בהצלחה להפוך חיידקים המוסמכת ביותר זמינים מסחרית. Turbocells מ Genlantis יכול לשמש גם בפרוטוקול 3 דקות רומן שינוי, המתוארות במדריך ההוראה.

טרנספורמציה של DNA פלסמיד לתוך החיידק שימוש בשיטה הלם חום

טרנספורמציה של DNA פלסמידי לתוך *E. coli* באמצעות שיטת ההלם התרמי היא טכניקה בסיסית בביולוגיה מולקולרית. היא כוללת הכנסה של ...

שלום, אני אלכס הוג. אני עובד במעבדת Gym Hall במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה באוניברסיטת קליפורניה אירביין. והיום אני אראה לכם כיצד לבצע טרנספורמציה של חיידקי E coli בעלי כשירות חשמלית (electrically competent) בשיטת האלקטרופורציה (electroporation).היום אני משתמש בטכניקה זו כדי לבצע טרנספורמציה של E. coli עם תוצר הליגציה שלי, מכיוון שאני מבצע ניסוי לצורך ביצוע whole mount hybridization בדגי zebrafish. אוקיי, נתחיל בביצוע הטרנספורמציה. ראשית, עליכם להכין את אמבט המים או את המקלט היבש בטמפרטורה של 42 °C.עליך להחזיק את הבקטריות שהוצאת זה עתה מהתרבית הראשית בקרח. היום נשתמש בתאי COMPETENCE חשמליים מ-ities וב-DNA שלך בקרח. כמו כן, עליך להכין מבחנה של מצע SOC בטמפרטורת החדר או ב-37°C ואת צלחות ה-LV עם מצע אנטיביוטיקה.כעת אוסיף את ה-DNA אל החיידקים. אני עובד לצד הלהבה כדי למנוע זיהום של החיידקים. אני מוסיף תמיסה עם החיידקים.מוסיפים 50 µL של חיידקים ולאחר מכן מחזירים מיד לקרח; ניתן לנער קלות כדי לערבב את החיידקים ואת ה-DNA, ולהשאיר בקרח למשך עד 15 דקות. כעת, לאחר שעברו 15 דקות, אנו מוכנים לביצוע ההלם התרמי (heat shock), הכולל הנחת החיידקים בטמפרטורה של 42 °C למשך 45 שניות. אני מוציא את המבחנות מהקרח ומעביר אותן ישירות ל-42 °C, מכוון את הטיימר ל-45 שניות, ולאחר מכן מחזיר אותן במהירות רבה מה-42 °C ישירות לקרח.לאחר מכן נמתין שתי דקות. כעת אוסיף את מצע ה-SOC לחיידקים ואדגיר אותם ב-37°C למשך 30 דקות. אני שואב 500 µL של מצע SOC, מוסיף אותו לחיידקים ומניח אותם בתא הדגירה המאולתר שלי.לכן, אם אתם משתמשים במבחנות eend ובתא מאולתר עבור האינקובטור שלכם, ודאו שאתם מניחים את מבחנות ה-eend באופן אופקי, כיוון שהן יורעדו בצורה טובה יותר כך. כעת אנו מוכנים להכניס את המבחנות למנער. זו הסיבה שיש לנו את התא הקטן הזה ב-37 °C למשך 30 דקות.כעת סיימנו את הדגירה ב-37 °C ואנו נעביר את החיידקים לצלחות LB בתוספת אנטיביוטיקה. במקרה שלי, מדובר ב-chloral. אני שואב 50 µL מכל דגימה ומניח אותה על הצלחת.כעת, עם 500 µL הנותרים, סובב אותם בצנטריפוגת שולחנית קטנה כדי לשקע את הבקטריות. לאחר הצנטריפוגה נקבל משקע יפה, וכעת נסיר כמעט את כל מצע ה-SOC, ונשאיר רק 50 µL, ואז נוכל לזרוע את 50 µL הללו של בקטריות מרוכזות. לכן, הסרתי כ-450 µL.אני משאיר את הכמות הזו. כעת אני עומד לתלה את המשקע ב-50 µL שנותרו של מצע SOC. לאחר מכן אוכל לזרוע את ה-50 µL הללו על פלטה אחרת.כעת אני מרטיב כל פלטה, לאחר מכן מעביר את התוכן ומפזר אותו על הפלטה. כך שיהיו בסוף שתי פלטות לכל דגימה. כעת עלינו לפרוס את החיידקים על פלטת LB.לכן אני אשתמש בחרוזי זכוכית שעברו עיקור באוטוקלאב, אך ניתן להשתמש גם בפיסת צינור שעיצבת לצורת פורס (spreader) כזו. אני אניח מספר חרוזים על פטרי dish. אני מעדיף את השיטה הזו.ובכן, 10 15. לאחר הוספת החרוצים, הניחו את כל הצלחות בערימה כזו ונערו אותן בעדינות כדי שהחרוצים יפזרו את החיידקים באופן שווה על פני הצלחות. המשיכו להזיז את הצלחות עד שהן יתייבשו.כלומר, לא אמורות להופיע רצועות גדולות של נוזל כאשר מזיזים את החרוצים. לדוגמה, בצלחת ההיא, החרוצים נוטים לקרוס זה לתוך זה וניתן לראות רצועות רבות. זוהי דוגמה למצב רטוב, בעוד שזו דוגמה למצב יבש שבו החרוצים נעים בחופשיות.כעת, לאחר שהפלטות יבשות, ניתן להסיר את חרוזי המגנט. אני פשוט מושך אותם כך כדי שניתן יהיה למחזר אותם. כעת נכניס את הפלטה לאינקובטור ב-37°C למשך הלילה, כאשר הפלטות מונחות הפוך. לאחר 12 שעות של אינקובציה ב-37°C, נוציא את הפלטה מהאינקובטור.וכפי שניתן לראות, ישנן פחות מושבות בצלחת שבה זרעתי 50 microliter מאשר בצלחת שבה זרעתי את השאר. דבר שחשוב בעת טרנספורמציה של חיידקים הוא להגיע לכמות הנכונה של מושבות בצלחת, כלומר לצפיפות הנכונה. בצלחת זו ישנן מעט מאוד מושבות, אך אם ברצונכם להשיג יותר מושבות, ניתן לראות דוגמה טובה בצלחת זו שבה הצפיפות היא בדיוק הנכונה, כ-100 מושבות לצלחת.צלוחית זו היא דוגמה רעה מכיוון שיש בה יותר מדי מושבות ולא ניתן לבודד מושבות בודדות. לכן, הדגמתי לכם כיצד לבצע טרנספורמציה של e coli באמצעות כל שיטת טרנספורמציה. היבט חשוב מאוד בטכניקה זו הוא לשמור על כל הרכיבים קרים על קרח לפני השוק התרמי.לאחר מכן 45 שניות בטמפרטורה רגילה, זמן נוסף ב-42 degree וחזרה לקרח. ואז כל השאר חייב להיות בטמפרטורה חמימה או 37 degree. כעת אני אסנן את המושבות שלי באמצעות סריקת PCR.לכן, אחת המטרות היא להשתמש בשתי צלחות. באחת אנו מצפים להרבה מושבות, ובשנייה לפחות מושבות. חשוב שהצלחות יהיו יבשות מאוד, באמצעות שימוש בחרו지를 או בpipette.תודה שצפיתם ובהצלחה בתהליך האישור שלכם.

transformation-of-plasmid-dna-into-e-coli-using-the-heat-shock-method

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Mutagenesis האתר בבימויו של פלסמידים כולה היא דרך פשוטה ליצור וריאציות שונות במקצת של הפלסמיד המקורי. כאן אנו מדגימים דרך יעילה קל עלות להציג החלפות בסיס לתוך ריאגנטים באמצעות פלסמיד רגיל.

Mutagenesis האתר ביתי בימוי של פלסמידים שלמים

מקור: Stefan, A., et al., היתרונות הרב-צדדיים של ביטוי משותף של חלבון ב-Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את ההליך להפיכת Escherichia coli עם פלסמיד הנושא גן עמידות לאנטיביוטיקה, כולל הכנת תאים, אלקטרופורציה, התאוששות ובחירת טרנספורמציה.

הכנה וטרנספורמציה של חיידקים באמצעות אלקטרופורציה במתח גבוה

פרוטוקול זה מדגים את פעילות המלווה של חלבון הלם חום 70 (Hsp70). תאי E. coli dnaK756 משמשים כמודל לבדיקה מכיוון שהם מכילים Hsp70 ילידי ולקוי תפקודית, מה שהופך אותם רגישים ללחץ חום. המבוא ההטרולוגי של Hsp70 פונקציונלי מציל את חוסר הצמיחה של התאים.

Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70

הרכבה in vivo היא שיטת שיבוט בלתי תלויה בקשירה המסתמכת על אנזימי תיקון DNA פנימיים בחיידקים כדי להרכיב שברי DNA על ידי רקומבינציה הומולוגית. פרוטוקול זה הוא גם חסכוני בזמן וגם בעלות יתר, מכיוון שנדרשים מעט ריאגנטים, ויעילות השיבוט יכולה להגיע עד 99%.

שימוש במכלול In Vivo לבניית פלסמיד ביעילות גבוהה

מאמר זה מתאר מתודולוגיה לביטוי יתר של Nsp15 רקומביננטי, נוקלאז רעיל, במערכת ביטוי C41(DE3), ואחריה טיהור החלבון המתויג באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה והדרת גודל. ניתן להתאים את הפרוטוקולים האלה לחלבונים רעילים מאתגרים אחרים.

שאיבת יתר וטיהור נוקלאז רעיל מ-Escherichia coli

טיהור פלסמיד דנ&quot;א מ מושבות חיידקים באמצעות Miniprep Qiagen Kit

עבודה זו מראה כיצד ליצור כלאיים RNA / DNA ברמה כרומוזומליות ולחשוף העברת מידע גנטי מ-RNA ל-DNA הגנומי בתאי שמרים.

הדור של RNA / DNA כלאיים ב-DNA הגנום על ידי טרנספורמציה באמצעות RNA המכיל oligonucleotides

אנו מציגים הליך שבאמצעותו דו מימדי agarose ג'ל ניתוח יכול לשמש כדי לזהות את מבנה ביניים שכפול המתרחשות בעקבות קרינה UV.

ויזואליזציה של UV-Induced ביניים שכפול א coli באמצעות דו מימדי agarose ג&#39;ל ניתוח

פרוטוקול זה הוא חלופה חסכונית הבהרה במקביל יעילה לטיהור פלסמיד דנ"א...

טיהור יעיל של ה-DNA פלסמיד מתרבויות פרוקריוטים

כאן אנו להדגים פרוטוקול פשוט ליצור ספריה מוטציה אקראית על רצף יעד נתון. אנו מראים כיצד שיטה זו, אשר מבוצעת in vivo של Escherichia coli, יכול להיות יחד עם בחירות פונקציונלי להתפתח פעילות אנזימטית חדשה.

בחירת הפרוטוקולים mutagenesis ו פונקציונאלי אבולוציה מכוונת של חלבונים א coli</em

למדו את שיטת הלם החום להעברת DNA פלסמיד לתאי E. coli כשירים חשמלית. טכניקה זו מכינה חיידקים לניסויים עתידיים בדגי זברה ומספקת מדריך ויזואלי חיוני למחקרים בביולוגיה מולקולרית.

טרנספורמציה של DNA פלסמיד לתוך החיידק שימוש בשיטה הלם חום

גלה סרטונים נוספים