Name: שימוש הר שלם באתרו הכלאה קישור לביולוגיה מולקולרית האורגניזם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-31T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: למד את שיטת ההכלאה in situ לזיהוי תבניות ביטוי גנים בעוברי זברה פיש. טכניקה זו מחברת בין ביולוגיה מולקולרית להתפתחות אורגניזמלית ומספקת לסטודנטים ניסיון מעשי בטכניקות מחקר מתקדמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר את החוג לביולוגיה באוניברסיטת סירקיוז, ד&quot;ר מרילין קר עבור תפקידם בממשל של הקורס החולייתנים השוואתי ביולוגיה. המעבדה Albertson נתמך על ידי מענק R21DE019223 מן המכון הלאומי לבריאות / המכון הלאומי למחקר דנטלי Craniofacial, וכן מענק R01AG031922 מן המכון הלאומי לבריאות / המכון הלאומי להזדקנות.

<ol><li>Albertson, R. C., Yelick, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+fgf8+signaling+in+left-right+patterning+of+the+visceral+organs+and+craniofacial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton.</a> Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).</li>
<li>Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+expression+profile+of+chicken+CHD7%2C+the+ortholog+of+the+causative+gene+for+CHARGE+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+A+Clin+Mol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome.</a> Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).</li>
<li>Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. J., Geisler, R., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+neckless+mutation+reveals+a+requirement+for+raldh2+in+mesodermal+signals+that+pattern+the+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish neckless mutation reveals a requirement for raldh2 in mesodermal signals that pattern the hindbrain.</a> Development. 128, 3081-3094 (2001).</li>
<li>Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+zebrafish+genes+affecting+the+formation+of+the+boundary+between+midbrain+and+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain.</a> Development. 123, 179-190 (1996).</li>
<li>Clark, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClark%2C+M+%22In+situ+Hybridization%3A+Laboratory+Companion%22">In situ Hybridization: Laboratory Companion</a>. , Wiley-VCH. (2003).</li>
<li>D'Costa, A., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+development+and+genetics%3A+Introducing+undergraduates+to+developmental+biology+and+genetics+in+a+large+introductory+laboratory+class%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Zebrafish development and genetics: Introducing undergraduates to developmental biology and genetics in a large introductory laboratory class.</a> Zebrafish. 6, 169-177 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Emerging+Model+Organisms%3A+A+Laboratory+Manual%2C+Volume+1%22">Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 1</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2008).</li>
<li>Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2010).</li>
<li>Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+limb+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in limb organogenesis.</a> Organogenesis. 4, 109-115 Forthcoming.</li>
<li>Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M., Huang, R., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+somite+development%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in somite development.</a> Ann Anat. 190, 208-222 Forthcoming.</li>
<li>Huelsken, J., Behrens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The Wnt signaling pathway.</a> J Cell Sci. 15, 3977-3978 (2002).</li>
<li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li>
<li>Oates, A. C., Mueller, C., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+function+of+deltaC+and+her7+in+anterior+segment+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cooperative function of deltaC and her7 in anterior segment formation.</a> Dev. Biol. 280, 133-149 (2005).</li>
<li>Pizard, A., Haramis, A., Carrasco, A. E., Franco, P., López, S., Paganelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+and+detection+of+RNAs+in+vertebrate+embryos+and+isolated+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2004).</li>
<li>Reifers, F., Bohli, H., Walsh, E. C., Crossley, P. H., Stainier, D. Y., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+is+mutated+in+zebrafish+acerebellar+%28ace%29+mutants+and+is+required+for+maintenance+of+midbrain-hindbrain+boundary+development+and+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf8 is mutated in zebrafish acerebellar (ace) mutants and is required for maintenance of midbrain-hindbrain boundary development and somitogenesis.</a> Development. 125, 2381-2395 (1998).</li>
<li>Schmoldt, A., Forecki, J., Hammond, D. R., Udvadia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+differential+gene+expression+in+zebrafish+to+teach+basic+molecular+biology+skills%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Exploring differential gene expression in zebrafish to teach basic molecular biology skills.</a> Zebrafish. 6, 187-199 (2009).</li>
<li>Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchoenwolf%2C+GC+%22Laboratory+Studies+of+Vertebrate+and+Invertebrate+Embryos%3A+Guide+and+Atlas+of+Descriptive+and+Experimental+Development%22">Laboratory Studies of Vertebrate and Invertebrate Embryos: Guide and Atlas of Descriptive and Experimental Development</a>. , 9th Edition, Pearson Education- Benjamin Cummings. Upper Saddle River, NJ. (2008).</li>
<li>Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somite+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Somite development in zebrafish.</a> Dev Dyn. 219, 287-303 (2000).</li>
<li>Weinberg, E. S., Allende, M. L., Kelly, C. S., Abdelhamid, A., Murakami, T., Andermann, P., Doerre, O. G., Grunwald, D. J., Riggleman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+zebrafish+MyoD+in+wild-type%2C+no+tail+and+spadetail+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of zebrafish MyoD in wild-type, no tail and spadetail embryos.</a> Development. 122, 271-280 (1996).</li>
<li>Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+expression+of+cardiac+myosin+genes+reveals+regulated+aspects+of+heart+tube+assembly+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish.</a> Dev. Biol. 214, 23-37 (1999).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מאחלים שימש קורס החולייתנים השוואתי ביולוגיה מעבדה כדי לסייע לתלמידים להבין את התפקידים של הגנטיקה בפיתוח אנטומי באמצעות ויזואליזציה של דפוסי ביטוי גנים ידועים. בחלק הראשון של הקורס, התלמידים ביצעו והניתוחים על אורגניזמים המייצגים chordate כמה מינים שונים, ומאפשר להם מספיק זמן ללמוד, להבין, להשוות, ו - חוליות האנטומיה הניגוד. כהקדמה לחלק השני של הקורס, הסטודנטים קיבלו הרצאה רשמי המתאר פיתוח דג הזברה אנטומיה. השיטות ואת התוצאות הצפויות של הניסוי מאחלים נדונו גם. הסטודנטים קיבלו אז דג הזברה לחיות somitogenesis ודקדקן-6 שלבים של התפתחות, ועל הפריה ימים 2 ו - 5 לתגובה (DPF) לבדוק תחת מיקרוסקופ לנתח. זה היה כדי לתת לתלמידים הבנה טובה יותר של מה עוברי דג הזברה נראית כמו וסוגי שינויים מורפולוגיים המתרחשות על פני ontogeny. בפגישה הבאה מעבדה, סטודנטים קיבלו עוברי דג הזברה שבה מאחלים נעשו בעבר. הם התבקשו ללמוד לתאר את דפוסי ביטוי גנים עבור כל גן של עניין (riboprobe בשימוש). עוברים המשמש מאחלים נגזרו הזדווגויות בין חברי קו ace/fgf8a הטרוזיגוטיים. על סמך ירושה מנדל, 25% עוברים מן ההזדווגויות ace/fgf8a היו אמורים להיות מוטנטים הומוזיגוטים ו להציג פגמים רבים של מבנים אנטומיים התמקדה בקורס זה. על פי דיווחים שפורסמו ותצפיות פורסם במעבדה Albertson, מומים במוח looping לב לא תקין היו צפויים, כמו גם ליקויים somites (Brand et al, 1996;. Albertson ו Yelick, 2005; תצפיות אישי). הסטודנטים התבקשו לבדוק את כל דגימות, סוג בר (בעלי חיים הטרוזיגוטיים הם נבדלים אחים סוג בר בשלבים המוקדמים של הפיתוח) לבין מוטציות הומוזיגוטים, עבור כל תבנית ביטוי הגן הציגו. לאחר מכן הם התבקשו לכתוב דוחות מעבדה לתאר את התוצאות שלהם, ועל סמך הידע שלהם באנטומיה גנטיקה, ביטוי גנים פגומים איך ייתכן זירז מומים אנטומיים. סטודנטים נראה לקבל את התרגיל מעבדה בהתרגשות ובסקרנות. רובם לא השתמשו מאחלים לפני התעניינו מאוד בחלק הזה של הקורס. הסטודנטים מצאו את דפוסים שונים של ביטוי גנים העוברים דג הזברה מסקרן, חלקם אף תיארו את דפוסי מכתים דמיינו ידי שיוך אותם עם הידוע עיצובים וסמלים, כמו פרצוף מחייך. דוחות מעבדה וכתוצאה מכך הראו התלמידים היו הבנה כללית של פרוטוקול מאחלים ואת הביטוי של גנים במבנים אנטומיים ספציפיים. התלמידים נדרשו גם להבין את פונקציות ספציפיות של גנים שנבדקו באמצעות מאחלים במהלך (Stickney et al, 2000 במעבדה;. Huelsken et al, 2002;. קומאראסינגות-Loganathan et al, 2008a,.. קומאראסינגות-Loganathan et al, 2008b ). היה ברור עם זאת, כי תלמידים מסוימים היה ידע מוגבל רקע של מסלולי איתות וגנים של עניין. מידע נוסף על מושגים אלה, מאחלים הרצאת מבוא עשוי להיות תוספת ברוכה השימוש מאחלים בעתיד קורסים ביולוגיה השוואתי החולייתנים. מאז פרוטוקול בדרך כלל לוקח ארבעה ימים רצופים, תלוי בלוח הזמנים של הקורס, התלמידים יכולים רק להיות מסוגל להשלים חלק בניסוי בכיתה המורה חייב להיות אחראי על שאר. בשיעור ביולוגיה חוליות השוואתי שלנו, התלמידים סיימו את התגובות מכתים במעבדה, ואילו עוזר הוראה לבצע את כל השלבים הקודמים. אם הוא מעדיף את התלמידים לבצע מאחלים בכיתה, פרוטוקול ניתן לחלק את יחידות משנה שניתן לבצע על מפגשי מעבדה מספר, תלוי במסגרת הזמן של הכיתה. אם זה לא ריאלי עבור התלמידים לבצע את הפרוטוקול כולו, כפי שהיה כאן בגלל הפגישה במעבדה רק פעם בשבוע, סטודנטים יכולים להוסיף את הפתרון מכתים בתחילת בכיתה, בהתאם riboprobe בשימוש, יש מכתים המלא בתוך שעה. הזמן שלוקח את הכתם לפתח משתנה מאוד עם כל riboprobe ועוד מגוון של תנאי הניסוי, ויש קבוע מראש לפני השיעור. יש לציין, אם התלמידים יהיה רק ​​לפתח את הכתם במעבדה, מדריכים יהיה אחראי על כל השלבים הקודמים, וזה ידרוש זמן ומאמץ משמעותיים מחוץ לכיתה. אם תרצה, חלופה קצרה לאחל יכול להיות אימונוהיסטוכימיה, באמצעות תוויות נוגדן לדמיין לוקליזציה חלבון, אולם בשלב זה, דג הזברה נוגדנים ספציפיים עבור גנים התפתחותיים אינם זמינים. אפשרות נוספת תהיה לבצע מאחל בעלי החוליות השונותnd יש לתלמידים להשוות את דפוסי הביטוי של אותם גנים באורגניזמים שונים (Pizard et al, 2004;. Aramaki et al, 2007;. אורגניזמים דגם מתעוררים, 2008; אורגניזמים דגם מתעוררים, 2010). מטרת העל של שימוש משאלה קורס החולייתנים השוואתי ביולוגיה היה כדי להדגים לתלמידים איך בשיטות ביולוגיות מולקולריות משמשים במחקר ופיתוח אנטומי. היא גם סיפקה הזדמנות לתלמידים לשער, כיצד שינו ביטוי גנים עשויה להוביל לא רק מומים התפתחותיים, אלא גם שינוי אבולוציוני. פורמלית כמו בביולוגיה התפתחותית אבולוציונית (המכונה לעתים קרובות &quot;Evo-Devo&quot;), שדה זה הולך וגדל במהירות של המחקר נועד לקשר גנוטיפ לבין פנוטיפ באמצעות פיתוח, וכדי להבהיר בסיסים מכניסטית פוטנציאל של שינוי אבולוציוני. עם עלייתו של תחום זה, אקולוגים יותר, ביולוגים האורגניזם, ו פיזיולוגים הם שימוש בטכניקות מולקולריות במחקר שלהם. אנו טוענים כי השימוש משאלה קורס החולייתנים השוואתי ביולוגיה יעזור לשמור על תוכנית הלימודים מעודכן עם ההתקדמות הטכנולוגית והמושגית הנוכחית המחקר, כדי להקל על היישור האופקי יותר קורסים בביולוגיה ברמה העליונה על ידי שילוב של תת תחומים ביולוגיים. יתר על כן, גישה אינטגרטיבית זו תספק לסטודנטים הזדמנות ללמוד מגוון של טכניקות מחקר ביולוגי במהלך אחד, המוביל השכלה מגוונת יותר וקידום המחקר המדעי בעתיד תחומית.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוד לחץ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרו צנטריפוגות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 37 ° C אינקובטור (עם מטרף) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 ° C מיקרו צנטריפוגות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המים באמבטיה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;ל אלקטרופורזה מנגנון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -20 ° C במקפיא </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -80 ° C במקפיא </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Rocker / שייקר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 ° C מקרר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ הביתור (רצוי עם מסך הוראה או מצלמה) </li></ul>

שימוש הר שלם באתרו הכלאה קישור לביולוגיה מולקולרית האורגניזם

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

הר שלמים הכלאה באתרו (בכך) היא טכניקה נפוצה במעבדות הביולוגיה המולקולרית בשימוש ללמוד ביטוי גנים באמצעות לוקליזציה של תעתיקי mRNA ספציפי בתוך הדגימה הר שלם. טכניקה זו (עיבוד Albertson ו Yelick, 2005) שימש במפלס העליון השוואתי ראשון בכיתה חוליות מעבדה לביולוגיה באוניברסיטת סירקיוז. הראשונה שני שלישים של הקורס החולייתנים השוואתית במעבדה לביולוגיה נתן לסטודנטים הזדמנות ללמוד את אמבריולוגיה ואנטומיה ברוטו של אורגניזמים שונים המייצגים מינים שונים chordate בעיקר באמצעות חתכים המסורתית ושימוש במודלים. החלק הסופי של הקורס מעורב גישה חדשנית ללימוד אנטומיה באמצעות תצפית של התפתחות החולייתנים שימוש בטכניקות מולקולריות שבה מאחלים בוצעה על עוברי דג הזברה. פיברובלסטים הטרוזיגוטיים גורם הגדילה 8 קו (fgf8a) מוטציה, אס, היה בשימוש. בשל ירושה מנדל, אס intercrosses סוג בר הפיק, הטרוזיגוטיים, ו הומוזיגוטים מוטנטים ace/fgf8a ביחס 01:02:01. בדיקות RNA עם דפוסי הביטוי הידוע קו האמצע לבין בפיתוח מבנים אנטומיים כגון הלב, somites, tailbud, myotome, והמוח היו בשימוש. מאחלים בוצעה באמצעות דג הזברה ב somite 13 ו חסודה-6 שלבים, עם התלמידים מבצעים את התגובה מכתים בכיתה. המחקר של עוברי דג הזברה בשלבים שונים של פיתוח נתן לסטודנטים את היכולת לבחון כיצד אלה מבנים אנטומיים השתנה במשך ontogeny. בנוסף, חלק מוטנטים ace/fgf8a מוצג looping לב לא תקין, ועל פגמים somite והתפתחות המוח. הסטודנטים במעבדה זו צפו התפתחות תקינה של מערכות איברים שונים הן באמצעות האנטומיה חיצוניים, כמו גם דפוסי ביטוי גנים. הם זיהו גם ותיאר עוברים הצגת התפתחות אנטומית גן תקין הביטוי (כלומר, מוטציות המשוערת). למדריכים במוסדות כי עדיין אין את הציוד הדרוש או שם כספים עבור המעבדה לחדשנות הלימודים מוגבלים, העלות הכספית של ריאגנטים המנגנון עשוי להיות גורם לשקול, כמו את הזמן והמאמץ הנדרש יהיה על החלק של מאמן ללא קשר להגדרה. עם זאת, אנו טוענים כי השימוש מאחלים זה סוג של הגדרה מעבדה בכיתה יכולים לספק חוליה חשובה בין גנטיקה התפתחותית ואנטומיה. עם התקדמות הטכנולוגיה ואת היכולת ללמוד התפתחות האורגניזם ברמה המולקולרית נעשה קל יותר, זול יותר ויותר פופולרי, ביולוגים אבולוציוניים רבים, אקולוגים, ו פיזיולוגים פונים אסטרטגיות ומחקר בתחום הביולוגיה המולקולרית. שימוש משאלה כיתה חוליות השוואתי ביולוגיה מעבדה היא דוגמה אחת כיצד מולקולות האנטומיה יכול להתכנס בתוך קורס בודד. זה נותן העליון סטודנטים ברמה הזדמנות לתרגל טכניקות מודרניות במחקר ביולוגי, המוביל השכלה מגוונת יותר וקידום המחקר המדעי בעתיד תחומית.

שלמה הר<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (בכך) שימש במפלס העליון כמובן השוואתי ראשון בביולוגיה חוליות בנוסף חוליות והניתוחים. זה נתן לסטודנטים הזדמנות ללמוד דפוסי ביטוי גנים כמו גם האנטומיה ברוטו, המקשר את לימודי הביולוגיה המולקולרית בתוך האורגניזם במהלך אחד.

היברידיזציה באתר (in situ hybridization) של דגימה שלמה (WISH) היא טכניקה נפוצה במעבדות לביולוגיה מולקולרית המשמשת לחקר ביטוי גנים באמצעות איתור של...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לצפות בדפוסי ביטוי גנים בעוברים של דגי זברה במהלך שלבי התפתחות ספציפיים. דבר זה מושג תחילה על ידי היברידיזציה של גשש ribo antisense המסומן ב-digoxigenin ל-mRNA של הגן הנבדק. השלב השני הוא גילוי גשש ה-ribo.בשימוש בנוגדן עבור doxygen, הנוגדן מצומד לאנזים alkaline phosphatase. השלב השלישי של הפרוטוקול הוא צביעה באמצעות הוספת NBT ו-BCIP, המגיבים עם אנזים ה-alkaline phosphatase כדי להפיק משק סגול בלתי מסיס. השלב הסופי של הפרוטוקול הוא דגירה של עוברים שנצבעו מספיק במתנול כדי להפחית צביעה לא ספציפית.בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות דפוסי ביטוי גנים בעוברים שלים של דגי זברה בשלבים ספציפיים של ההתפתחות באמצעות היברידיזציה של Whole Mount In Situ. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הדגמות מסורתיות של היסטולוגיה או נתיחות בכיתה, הוא שהיא מעניקה לסטודנטים את ההזדמנות לבנות גשרים מושגיים בין ביולוגיה מולקולרית לבין מגמות בהתפתחות ואבולוציה של אורגניזמים, ובכך מספקת חוויה אינטגרטיבית אמיתית. למרות ששיטות אלו שימשו באופן מסורתי לחקר ההתפתחות של מספר מועטים של אורגניזמי מודל, ניתן ליישמן בקלות על אורגניזמים אחרים שאינם אורגניזמי מודל כדי להבין את השמרנות של מסלולי התפתחות בין טקסונים של חולייתנים, וכן את הנקודות שבהן מסלולים אלו סוטים ומובילים לחידושים אבולוציוניים.שיטה זו עשויה להיות לא מוכרת לסטודנטים לתואר ראשון, ולכן חלקם עלולים להתקשות בתחילה, אך למידת שיטה זו תועיל להם רבות במסגרת חוויות מחקר בתואר הראשון ובקורסים מתקדמים. כדי להתחיל בהליך זה, השתמשו בפיפט העברה להעברת כ-50 עוברים של zebrafish למבחנה קטנה לפסולת. הסירו נוזל עודף ולאחר מכן העבירו בפיפט 1.5 milliliters של 4%para formaldehyde למבחנה.הנח את מבחנת העוברים על מכשיר ערבוב (agitator) בטמפרטורת החדר למשך הלילה. למחרת בבוקר, הסר את נוזל הקיבוע (fix) והשלך אותו. הוסף 1.5 milliliters של תמיסת phosphate buffered saline המכילה 0.1% tween 20 לעוברים לצורך שטיפה.השתמשו בפינצטה בעלת קצה דק כדי לצפות את העובריים ידנית במידת הצורך, והשתמשו בפיפט העברה כדי להעביר את העובריים המצופים לשפרוֹר microfused נקי. לאחר מכן, העבירו בפיפט 1.5 milliliters של 25%methanol ו-PBST לתוך השפרוֹר. לאחר דגירה של שעה אחת, שאבו כמה שיותר מהתמיסה מבלי להפריע לעובריים.לאחר מכן, החליפו ב-1.5 milliliters של 50% methanol ב-PBST והדגירו למשך שעה אחת לפחות. לבסוף, החליפו ב-1.5 milliliters של 100% methanol והניחו בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius. ניתן לשמור את העוברים ב-methanol בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius.כאשר השפופרת מוכנה לשימוש, העבירו את המתנול מהשפופרת באמצעות פיפטה והשליכו את הפיפטה. העבירו לשפופרת 50% methanol ב-PBST והדגירו למשך 10 דקות. חזרו על פעולה זו, שטפו פעם שנייה, לאחר מכן שאבו את התמיסה וחזרו על ההדגרה עם 25% methanol ב-PBST.לבסוף, שטפו פעמיים למשך 10 דקות בכל פעם ב-100% PBST והכינו תמיסת hydrogen peroxide בריכוז 10% ב-PBST. טבלו את עוברי דגי הזברה (zebrafish) בתמיסה זו בטמפרטורת החדר כאשר פקק המיקרו-פיובל פתוח למשך 10 עד 20 דקות, בהתאם לגיל העובר. כדי להסיר פיגמנטציה כהה, השתמשו בפיפט העברה כדי להוציא ולהשליך את תמיסת ה-hydrogen peroxide.שטפו את העוברים ב-1.5 milliliters של PBST מספר פעמים כדי להפסיק את התגובה. דללו תמיסת מלאי של proteinase K בריכוז 50 milligram per milliliter ביחס של 1 ל-5,000 ב-PBST. בדרך כלל מדובר ב-one microliter של proteinase K ב-4.999 milliliters של PBST.הסיר את ה-PBST מהעובריים. באמצעות פיפט העברה, השלך את הנוזל והוסף 1.5 milliliters של תמיסת proteinase K לשפופרת. השקע את העובריים בתמיסת proteinase K בטמפרטורת החדר למשך שלוש עד 15 דקות, בהתאם לגיל העובריים.שטפו מספר פעמים עם PBST כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, הסירו את ה-PBST והטבילו את העובריים ב-4% formaldehyde למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לצורך קיבוע מחדש; הסירו את ה-formaldehyde באמצעות פיפטה להעברה והשליכו אותו. הוסיפו 1.5 milliliters של PBST לעובריים ושטפו למשך חמש דקות.שאיפים בזהירות את ה-PBST מהמבחנה ושופכים אותו. חוזרים על השטיפה עם שני נפחים נוספים של PBST. לאחר מכן ממשיכים להיברידיזציה של גש probes של RIP, מחממים מראש אמבט מים ל-70 °C ומכינים את תמיסת טרום-ההיברידיזציה.לאחר מכן, השתמשו בפפית העברה כדי להסיר ולהשליך את ה-PBST. טבלו את העוברים ב-0.5 milliliters של תמיסת טרום-היברידיזציה והדגירו במקלח מים בטמפרטורה של 70 degree Celsius למשך שעתיים עד שלוש שעות, תוך הקפדה שלא להפריע לעוברים.שאיב את תמיסת טרום-ההכלאה (pre hybridization solution) מהנבובת לפסולת המיקרו והשלך אותה. שאיב בעדינות 0.5 milliliters של תמיסת הכלאה (hybridization solution) אל תוך הנבובת. לאחר מכן, הוסף במהירות doxygen שסונתז מראש ב-ribo המסומנת.החדרו למבחנה ריכוזי פרוב ריבו (ribo probe) הנעים סביב 1 µg/mL. דגרו בטמפרטורה של 70 °C למשך הלילה. למחרת, הכינו תמיסות של 75%, 50% ו-25% PHS ב-2× saline sodium citrate, וכן תמיסות של 2× SSC ו-0.2× SSC.חממו תמיסות נוספות באמבט מים בטמפרטורה של 70 °C. כאשר התמיסות יגיעו ל-70 °C, הוציאו אותן מאמבט המים. לאחר מכן, שאבו את תמיסת ההיברידיזציה מהמבחנה והשליכו אותה.הוסיפו 0.5 milliliters מכל תמיסת P-H-S-S-S-C חמה, והדגירו את העוברים בכל תמיסה למשך 10 דקות ב-70 °C. לבסוף, הדגירו את העוברים בתמיסת 0.2 times SSC ב-68 °C למשך 30 דקות. שאבו את תמיסת ה-0.2 times SSC מהמבחנה והשליכו אותה.דגרו את העוברים ב-1.5 milliliters של בופר חומצה מלית pH 7.5 בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. חזרו על פעולה זו, ושטפו פעם שנייה. הכינו תמיסת חסימה (blocking solution) בהתאם לפרוטוקול הכתוב.העבירו את העוברים ב-MAB לכל באער של פלטת 12 באערים. הסירו את ה-MAB העודף והעבירו בפיפטה אחד עד שני מיליליטרים של תמיסת חסימה לכל באער.דגרו בטמפרטורת החדר עם ערבוב למשך שלוש שעות לפחות. דללו את האנטיגן בנוגדן ביחס של 1:2000 בתמיסת החסימה שנותרה. דגרו בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות לפחות עם ערבוב עדין.יש להיזהר לא להפריע לעוברי. שאיפה בעזרת פפיטה של תמיסת החסימה מבארות הפלטה והשלכתה. העברה בעדינות בעזרת פפיטה של נוגדן anti-doxygen והתמיסה החוסמת שהוכנו מראש אל תוך הבארות, ודגירה בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה.למחרת, שטפו את העוברים בחמישה סבבים של 1.5 milliliters של באפר חומצה מאלית. השאירו את העוברים לדגירה בבאפר חומצה מאלית למשך חמש דקות. לאחר מכן, בצעו החלפות באפר והדגירו אותם פעמיים למשך 10 דקות.מרווח זמן אחד של 30 דקות ומרווח זמן אחד של 60 דקות. שאבו את השטיפה האחרונה של בופר חומצה מאיק (meic acid buffer) מהבארות והשליכו את הפ pipette. העבירו 1.5 עד שני מיליליטר של בופר פוספטאז אלקלין לבארות והדגירו למשך חמש דקות.חזור על תהליך זה פעמיים. הסר את באפר הפוספטאז האלקלי והוסף 1.5 עד שני מיליליטר של תמיסת צביעה לבארים. עטוף את הפלטה כולה בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מאור, ובצע ערבוב עדין במרווחי זמן של 20 דקות.הפסיקו את האגיטציה ובחנו את העוברים תחת מיקרוסקופ דיסקציה כדי לוודא שהושג צביעה מספקת. ברגע שצביעה מספקת נראית לעין, שאבו את תמיסת הצביעה מהבארות והשליכו אותה. החליפו את התמיסה ב-PBST כדי להפסיק את תגובת הצביעה.חזרו על תהליך השטיפה עם נפח נוסף של PBST, שאבו את ה-PBST מהבארות והשליכו אותם כדי לייבש את העוברים. שאבו 1.5 עד שני מיליליטרים של 25% methanol ב-PBST לתוך הבארות והדגירו למשך 10 דקות. חזרו על התהליך פעמיים עם 50% methanol ב-PBST למשך 10 דקות נוספות בכל שטיפה. לאחר מכן, העבירו את העוברים ל-100% methanol והדגירו למשך שעתיים לפחות כדי להפחית צביעה לא ספציפית.לאחר הדגירה, העבירו את המתנול מהבארות בעזרת פיפטה והשליכו אותו כדי לבצע רהידרטציה לעוברים. שטפו פעמיים עם 50% methanol ב-PBST, ולאחר מכן עם 25% methanol ב-PBST למשך 10 דקות בכל פעם. לאחר מכן, שטפו עם 100% PBST פעמיים למשך 10 דקות בכל פעם.לבסוף, העבירו את העוברים הצבועים לתוך תמיסת glycerol בריכוז 80% ב-PBST באמצעות סדרה מדורגת של שטיפות, ואחסנו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד לתצפית; כאשר הפרוטוקול בוצע נכון, ביטוי הגן הנחקר יבוא לידי ביטוי בהופעת צבע סגול בעובר דג הזברה. תמונה זו מציגה עובר דג זברה 24 שעות לאחר ההפריה, אשר עבר היברידיזציה עם גששים מסוג RIBA הספציפיים ל-AAL DH one A two; ניתן לראות צביעה ספציפית בעיניים, במוח האחורי, בנבט סנפיר החזה, ב-ria ובסומיטים.תמונה זו מציגה עובר דג זברה (zebrafish) בשלב 13 הסומיטים של ההתפתחות, שעבר היברידיזציה עם גלאי (probe) ספציפי ל-FGF eight A. במקרה זה, נצבעה באופן ספציפי קו ה-tline kelon, ה-dorsal Dion, ה-Kelon midbrain, הגבול בין המוח האמצעי למוח האחורי (hind brain boundary), הסומיטים וניצן הזנב. תמונה זו מציגה עובר דג זברה 22 שעות לאחר ההפריה, שעבר היברידיזציה עם הגלאי הספציפי ל-PAX two A; מרקר חזק ושימושי להדמיית מערכת העצבים.ניתן להבחין בצביעה ספציפית בחריץ הכורואיד (choroid fissure), בגוון הביניים, בגבול המוח האחורי, בבועית השמיעה ובנוירונים של חוט השדרה. לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן להתאימה לביצוע על פני מספר מפגשים במעבדה, בהתאם ללוח הזמנים של הקורס. ייתכן שהמרצה יידרש להשקיע זמן ומאמץ נוספים מחוץ לשעות השיעור.לאחר צפייה בסרטון זה, אנו מקווים שתרגישו בנוח יותר עם הרעיון של הכנסת היברידיזציה של דגימות שלמות (whole mount) ו-C2 למעבדה של תואר ראשון. ככל שהסטודנטים יפתחו מיומנויות אלו, היכרות עם טכניקה זו יכולה להקל על מעברם למחקר בשלבים מתקדמים של התואר או ללימודים במסגרת תואר שני או שלישי.

using-whole-mount-situ-hybridization-to-link-molecular-organismal

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרט הווידאו הזה מדגים 2 צבעים הר שלם הכלאה באתרו, שיטה שבאמצעותה דפוס ביטוי במרחב ובזמן של 2 גנים שונים יכולים להיות דמיינו בעוברים אפרוח צעיר. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי דייוויד וילקינסון, דומינגוס אנריקה, פיל אינגהם ודוד איש-Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

שילוב של טכניקות שונות על מנת למקסם את איסוף הנתונים מרקמות העכבר מוצג.

שילוב של צבע lipophilic, באתרו</emהכלאה>, אימונוהיסטוכימיה ו היסטולוגיה

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

על ידי שילוב של כל שיטות להר...

רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

דג הזברה, דגים טרופיים קטנים, הפכה לדגם פופולרי ללימוד תפקוד גן במהלך התפתחות מחלה וחוליות. הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה יכול להיקבע על...

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

אנו מתארים הליך רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-תרצה) בעוברים שלמים תסיסנית מאפשרים זיהוי סימולטני וספציפי של שלושה דפוסי הפצת mRNA שונים על ידי מנוגד משקעים צבע.

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

במאמר זה וידאו מפרט פשוטה במתודולוגיה vivo, שניתן להשתמש בהם כדי בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות מורכבות ורשתות רגולטוריות בעוברים חסרי חוליות רבים.

כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו<em&gt; ב Vivo</em&gt; מודלים התפתחותי לימוד Cell ל-תא קומפלקס אינטראקציות רשת איתות

פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של ביטוי גנים בעובריים Astyanax cavefish. גישה זו פותחה במטרה למקסם את אות של ביטוי גנים, תוך מזעור צביעת הרקע לא ספציפית.

Wholemount ב באתרו הכלאה עבור עוברי Astyanax

למד את שיטת ההכלאה in situ לזיהוי תבניות ביטוי גנים בעוברי זברה פיש. טכניקה זו מחברת בין ביולוגיה מולקולרית להתפתחות אורגניזמלית ומספקת לסטודנטים ניסיון מעשי בטכניקות מחקר מתקדמות.

שימוש הר שלם באתרו הכלאה קישור לביולוגיה מולקולרית האורגניזם

גלה סרטונים נוספים