Name: אסטרטגיה לזהות מוטציות דה נובו בהפרעות נפוצות כגון אוטיזם וסכיזופרניה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: למד אסטרטגיה לזיהוי מוטציות דה נובו בהפרעות נפוצות כמו אוטיזם וסכיזופרניה באמצעות ריצוף אקסומי וכלים ביואינפורמטיים. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לזהות גנים מועמדים ולאמת ממצאים בדגמים תאיים ובעלי חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו הודות מקורות המימון שלנו הגנום קנדה הגנום קוויבק, אוניברסיטת מונטריאול, כמו גם במימון הקרן הקנדית חדשנות למימון &quot;סינפסה על מחלות&quot; הפרויקט שלנו (S2D).

1. בחירה של המחלה עלולה להיגרם על ידי מוטציות דה נובו מחלה המתאים הקריטריונים הבאים יכול להתאים עם ההשערה נובו מוטציה דה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כושר הרבייה מופחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכיחות המחלה גבוהה יחסית קבוע למרות נרחב סביבות שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המחלה קשורה בגיל אבהית גבוהה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמדה קלאסי האגודה ללימודי נכשל להסביר חלק ניכר תורשתיות במחלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנתונים הקונקורדנציה התאום תמיכה מודל דה נובו. </li></ol> ניתוח של סבירות כי מחלה נפוצה שבה מוטציות דה נובו עשוי בחלקו להסביר את הבסיס הגנטי הוא השלב הראשון קריטי. 2. מבחר מקרים דגימות DNA מבחר דוגמאות המתאים הוא קריטי להצלחה של זיהוי המוטציות דה נובו. כדי למקסם את הסיכוי למצוא מוטציות דה נובו, אנו ממליצים על הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר המקרים עם הגיל המוקדמים של הופעת פנוטיפ, קשה, עם ההורים מושפעים, אבות מבוגרים ללא היסטוריה המשפחה המורחבת של המחלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר חולים אשר DNAs זמין מספיקים כדי לנהל את המחקר. קריטי במיוחד הוא הזמינות של ה-DNA ממקור תא ראשוני זה לא היה נתון culturing (DNA דם כגון DNA או רוק), </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזמינות של ה-DNA שני ההורים הוא קריטי על מנת לקבוע את השידור מוטציה מעמד (בירושה לעומת דה נובו). זמינות של קבוצות מושפע נוספים שולטת נורמלי הוא הכרחי עבור אימות מחקרים גנטיים פעם גנים מועמדים מזוהים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת גודל המדגם מבוסס על שיעור המוטציות, כמות הגנים שיוקרנו ואת אומדן של שבריר של מקרים שעלולים לנבוע מוטציה דה נובו. </li></ol> 3. ג'ין resequencing, שתי הגישות העיקריות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איכות גבוהה נמוך התפוקה רצף גישה זו מבוססת על גישות גנים מועמדים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה של מועמד הגן (ים) בחר את הגנים המועמד הטוב ביותר על בסיס מערכת ניקוד אשר בנויה על 6 קריטריונים מרכזיים. ואז לחשב את סך תאמו את הסכום של כל הנקודות המיוחסות באמצעות ששת הקריטריונים המפורטים בטבלה 1. ראה למשל מהפרויקט שלנו דמות 1 של התפלגות גנים נבחרים ולא נבחרים. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534table1.jpg" alt="טבלה 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="טבלה 1"> טבלה 1. קריטריונים המשמשים מבחר הגן המועמד <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. גרף המציג את החלוקה של גנים נבחרים ולא נבחרים עבור סידור בפרויקט שלנו. קיבלנו חלוקה של גנים מדורגים לפי תכונות המועמד על ידי הגנים מיון לפי שווי הציון שלהם. לדוגמה, SHANK3 ו NRXN1 הגנים, שני הגנים שמצאנו מוטציה דה נובו, היו ציון 7 ו -6 בהתאמה (המקסימלי הוא 12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב primers Primers3 באמצעות תוכנה דרך Exonprimer. רק קידוד אזור צומת אחוי צריך להיות מכוסה כולל 50 זוגות תוספת לבסיס בכל צד של אקסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטב PCR התנאים הבחירה של תקי, עוצמת התגובה וכו ' </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטב את כל שברי PCR </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Amplify 5 ננוגרם של הדנ"א הגנומי המופקים דגימות דם על פי נהלים קבועים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שליחת על רצף, לבצע בקרת איכות של מוצרי ה-PCR שלך על ידי טעינת 2% agarose ג'ל. נבחרים באופן אקראי דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף מוצרי ה-PCR על ה-DNA Analyzer על גדיל אחד. שבר נחשב רצף בהצלחה אם ניתוח של מעל 90% של עקבות אפשרי. זה ישים להקרנה בקנה מידה גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרסאות איתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלים לזיהוי genotyping הגנומי של וריאציות כגון PolyPhred, Polyscan ו המודד מוטציה. שילוב של יותר מ 2 כלי איתור אידיאלי. לדוגמה, PolyPhred v.5 ו PolyPhred v.6 עם הגדרות ברירת המחדל אינם מזהים את הווריאציות אותו. Polyscan v.3 יש שיעור גבוה יותר שווא מוטציה חיובית SNPs (96%) ופחות עבור INDELs (93%). PolyPhred v.6 לא זיהה את רוב INDELs נכון, אבל יש שיעור שווא מוטציה חיובית (עבור INDELs) נמוך יותר הכולל v.3 Polyscan (90%). אנחנו צריכים להסיר את האפשרות של גילוי SNPs עבור Polyscan v.3 ולשמור הן PolyPhred v.5 ו PolyPhred v.6 לאיתור חלופה. המודד המוטציה Polyscan טובים לאיתור indels. הערה: האפשרות של גילוי SNP לא צריך להיות מיושם כאשר באמצעות Polyscan. רק "indel" האופציה צריך להיות. Polyscan שנוצר חיובי כוזב רבים לאיתור SNP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור exonic כל גרסאות ייחודי רומן זוהה, לאשר אותה באופן ידני על ידי reamplifying שבר ו resequencing proband ואת שני ההורים באמצעות primers הפוכה קדימה כדי לחסל כל חפץ טכנית. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלמות exome רצף גישה זו מהווה רצף תפוקה גבוהה מיקוד רוב קידוד אזורים של הגנום האנושי. עכשיו אנחנו כרגע באמצעות הגישה החדשה הזו במעבדה שלנו, להאיץ את הגילוי של גנים מועמדים פוטנציאליים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצו "SureSelect אקסון כל אדם" מיקוד האזור קידוד של מעל 16,000 הגנים (50 MB של הגנום) תוכנן על ידי Agilent או כל מוצר דומה אחר על ידי אחרים כמו רוש. לפני הסדר ערכת ללכוד, פלטפורמות סידור צריך לקבוע (Illumina לעומת מוצק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם ללכוד פי פרוטוקול Agilent </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף המוצר בהתאמה פלטפורמת הדור הבא שלך זמין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Variant זיהוי של רצף exome שלם: מספר כלי ביואינפורמטיקה עבור איתור genotyping של וריאציות הגנומי של פלטפורמת הדור הבא של רצף זמינים כגון BWA, Bfast, BioScope אשר יבצע את היישור. לאחר מכן כלים נוספים במורד זמין בחינם (לדוגמה SAM כלים, Varscan, Annovar) יהיה צורך זה להתקשר ביאורים גרסאות. תוכנה מסחרית המשלבת יישור רצף וקראו וריאנט ו ביאור זמינים גם כגון, NextGen (Softgenetics), CLC ביו ועוד </li></ol></li></ol> 4. סדרי עדיפויות משתנים הגנום וריאנטים שזוהו הן עדיפות אז למעקב על פי ההסתברות שלהם להיות דה נובו ו מזיקות לתפקד חלבון או mRNA ו / או מבנה. גרסה מעקב העדיפויות לגילוי גרסה נובו דה אמור להיות כך: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וריאציות ייחודיות (צפו פעם מקרה אחד) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וריאציות לא נוכחים ההורים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבון-מקצץ וריאציות: שטויות, indels המוביל frameshift ומוטציות שחבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וריאציה Missense ושקט חזו להיות הרסנית מבחינה תפקודית (למשל, להשפיע על שחבור mRNA). שימוש, Polyphen לנפות ו הפנתר עבור השפעה תפקודית על חיזוי החלבון. </li></ol> אם באמצעות רצף exome שלם, מבחר של גנים מועמדים יכולה לשמש כאסטרטגיה עבור גרסאות עדיפות למחקר נוסף. 5. גנטית אימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resequence את הגן כולו במקרים חולה נוסף (כדי לזהות מוטציות סיבתי אחרים) שולטת. דגימות השליטה ישמש להעריך תדרים allelic של וריאנטים עדיפות. כל גן המכילים לפחות שתי שונה דה נובו מוטציות מזיקות (שחבור שטויות, frameshifts, וחזה missense מזיק) מצאו אצל חולים שונים (אך לא בדגימות שליטה או מאגרי מידע ציבוריים) צריכה להיות עדיפות גבוהה ללימודי אימות נוסף. זה כולל: 1) בדיקת פגם שחבור פוטנציאליים lymphoblastoid שורות תאים שמקורם בחולה. מניסיוננו, רוב הגנים תשואה RT-PCR מוצרים שורות תאים lymphoblastoid; 2) לחקור שינו ביטוי רמות חלבון על ידי ניתוח כמותי כתם המערבי של תמציות חלבון מן שורות תאים lymphoblastoid ו 3) מבחן נוסף המוטציה / גן ברמה תפקודית חיים (ג elegans, דג הזברה) וקו תא מודלים כמו שנעשה בעבר על ידי הקבוצה שלנו (לשעבר: 5,6). </li></ol> 6. נציג תוצאות: בעקבות פרוטוקול זה, הצלחנו לזהות גנים חדשים סכיזופרניה ואוטיזם. דוגמה אחת היא גילוי לאחרונה SHANK3 הגן שלנו (איור 2). שני שונות דה נובו מוטציות בגן SHANK3, מוטציה אחת שטויות נמצא אחיו three מושפעים מוטציה אחת missense ב נקבה זו שנפגעה. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. (א) הפרדה של המוטציה שטויות R1117X בשלושה אחים מושפעים המשפחה PED 419. Proband מסומנת על ידי החץ. (ב) הפרדה של המוטציה missense R536W ב proband אך לא אחי לא השפיע עליה PED 56.

<ol><li>Bassett, A. S., Bury, A., Hodgkinson, K. A., Honer, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+fitness+in+familial+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Res%22%5BJournal%5D)">Reproductive fitness in familial schizophrenia.</a> Schizophr Res. 21, 151-160 (1996).</li>
<li>Jablensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizophrenia%3A+manifestations%2C+incidence+and+course+in+different+cultures.+A+World+Health+Organization+ten-country+study%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med+Monogr%22%5BJournal%5D)">Schizophrenia: manifestations, incidence and course in different cultures. A World Health Organization ten-country study.</a> Psychol Med Monogr. , Suppl 20. 1-97 (1992).</li>
<li>Malaspina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizophrenia+risk+and+paternal+age%3A+a+potential+role+for+de+novo+mutations+in+schizophrenia+vulnerability+genes%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Spectr%22%5BJournal%5D)">Schizophrenia risk and paternal age: a potential role for de novo mutations in schizophrenia vulnerability genes.</a> CNS Spectr. 7, 26-29 (2002).</li>
<li>DeLisi, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+scan+for+linkage+to+chromosomal+regions+in+382+sibling+pairs+with+schizophrenia+or+schizoaffective+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A genome-wide scan for linkage to chromosomal regions in 382 sibling pairs with schizophrenia or schizoaffective disorder.</a> Am J Psychiatry. 159, 803-812 (2002).</li>
<li>Gauthier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+SHANK3+Mutations+in+Patients+Ascertained+for+Schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">De Novo SHANK3 Mutations in Patients Ascertained for Schizophrenia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Piton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+calcium-related+gene+IL1RAPL1+are+associated+with+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the calcium-related gene IL1RAPL1 are associated with autism.</a> Hum Mol Genet. 17, 3965-3974 (2008).</li>
<li>Krawczak, M., Ball, E. V., Cooper, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neighboring-nucleotide+effects+on+the+rates+of+germ-line+single-base-pair+substitution+in+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Neighboring-nucleotide effects on the rates of germ-line single-base-pair substitution in human genes.</a> Am J Hum Genet. 63, 474-488 (1998).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ההליך המתואר כאן שואפת לזהות מחלות נפוצות ספציפיות התוצאה הסבירה, בין השאר, מן מוטציות דה נובו, וכדי להוכיח את ההשערה הזאת. דה נובו מוטציות הן מנגנון מבוססת היטב על פיתוח של מספר מחלות, למשל תסמונות סרטן תורשתיות, אך נחקר גרוע מחלות נפוצות. זה בתוצאות חלק מן האתגרים הטכניים הכרוכים לזיהוי מוטציות דה נובו, אשר מחייב את רצף של כמויות גדולות של DNA, אשר רק לאחרונה להיות חסכוני עם כניסתו של רצף הדור הבא. בנוסף, דה נובו שיעור המוטציות בבני אדם היה, עד לאחרונה, אומדן בלבד. רק לאחרונה יש שם דיווחים ישירות בקביעת שיעור המוטציות בבני אדם. לפני מדידות אלה, קשה היה לחזות את גודל המדגם הנדרש לסוג זה של המחקר כדי לקבוע אם נצפה דה נובו שיעור המוטציות גדול משיעור הבסיס. סידור גנים מועמדים לעומת הגנום כולו? מאחר שרוב המוטציות במחלה דיווחו הם missense / שטויות מוטציות הן באתר אחוי מוטציות (על פי אתר האינטרנט HGMD) אסטרטגיה ההקרנה שלנו היה לזהות מעל 68% של מוטציות ידועות. יש גם קשר ברור בין חומרת החלפת חומצת אמינו ואת הסבירות של פנוטיפ קליני. לעומת החלפת חומצת אמינו שמרני, שינוי שטויות 9.0 פעמים סביר יותר להציג קלינית 7. לפיכך, בשלב זה גנים מועמדים רצף היא האסטרטגיה העלות האפקטיבית ביותר. ההצלחה של ההליך המתואר תלוי כמה שלבים קריטיים, אשר מתוארים בפירוט ואייר באמצעות שתי דוגמאות, אוטיזם וסכיזופרניה. ישנם מכשולים רבים אשר צריך להימנע, כגון מחלה שבה בחר, אשר מטופלים למקור המסך של ה-DNA, ופירוט כיצד ביעילות לזהות את המוטציות דה נובו. אנו מספקים שיטה יעילה ביותר בקביעת חלק מן המקרים של כל מחלה הנובעת מוטציות ספונטניות כאלה.

אסטרטגיה לזהות מוטציות דה נובו בהפרעות נפוצות כגון אוטיזם וסכיזופרניה

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

ישנם מספר קווים של ראיות התומכות את התפקיד של מוטציות דה נובו כמנגנון בהפרעות נפוצות, כגון אוטיזם וסכיזופרניה. ראשית, דה נובו שיעור המוטציות בבני אדם גבוה יחסית, כך נוצרות מוטציות חדשות בתדירות גבוהה באוכלוסייה. עם זאת, מוטציות דה נובו לא דווחו המחלות הנפוצות ביותר. מוטציות בגנים מובילים למחלות קשות בהם יש סלקציה שלילית חזקה נגד פנוטיפ, כגון הקטלניות בשלבים עובריים או כושר הרבייה מופחת, לא יועבר לבני משפחה רבים, ולכן לא יזוהו על ידי מיפוי גנטי הצמדה או התאגדות מחקרים. תצפית של הקונקורדנציה גבוה מאוד תאומים מונוזיגוטיים ו הקונקורדנציה נמוך מאוד תאומים dizygotic גם מאוד תומך בהשערה כי חלק ניכר מהמקרים עשויים לנבוע מוטציות חדשות. כזה הוא המקרה של מחלות כמו אוטיזם וסכיזופרניה. שנית, למרות כושר הרבייה מופחת 1 וגורמים סביבתיים משתנה מאוד, השכיחות של מחלות מסוימות נשמר ברחבי העולם בשיעור גבוה יחסית קבוע. זהו המקרה של אוטיזם וסכיזופרניה, עם שכיחות של כ -1% ברחבי העולם. עומס מוטציוני יכול להיחשב איזון בין מבחר בעד או נגד מוטציה מזיקה הייצור שלה על ידי מוטציה דה נובו. שיעור נמוך יותר של רבייה מהווה גורם סלקציה שלילית שיש לצמצם את מספר אללים מוטנטים באוכלוסיה, ובסופו של דבר מובילים שכיחות המחלה פחתה. אלה לחצים בררניים נוטים להיות בעוצמה שונה בסביבות שונות. עם זאת, הפרעות נפשיות חמורות אלה נשמרו על שכיחות גבוהה יחסית קבוע באוכלוסיה ברחבי העולם במגוון רחב של תרבויות ומדינות למרות בחירה שלילית חזקה נגדם 2. זה לא מה שניתן היה לחזות במחלות עם כושר הרבייה מופחת, אלא אם כן יש שיעור גבוה מוטציה חדשה. לבסוף, את ההשפעות של גיל אבהי: קיים סיכון מוגבר משמעותית של המחלה עם הגיל אבהי הגדלת, אשר יכול לנבוע להגדיל את גיל הקשורים מוטציות דה נובו אבהי. זהו המקרה של אוטיזם וסכיזופרניה 3. יחס הזכר אל הנקבה של שיעור המוטציות מוערך בכ 4-6:1, ככל הנראה עקב מספר גבוה יותר של תא הנבט חטיבות עם הגיל אצל גברים. לכן, אפשר היה לחזות כי מוטציות דה נובו יבואו בתדירות גבוהה יותר מן הזכרים, במיוחד גברים מבוגרים 4. שיעור גבוה של מוטציות חדשות עשוי בחלקו להסביר מדוע מחקרים גנטיים נכשלו עד כה לזיהוי גנים רבים predisposing אל מתחמי גנים למחלות, כמו אוטיזם וסכיזופרניה, ומדוע מחלות זוהו על 3% בלבד של גנים בגנום האנושי . זיהוי עבור דה נובו מוטציות כגורם למחלה מחייבת גישה מולקולרית ממוקד, הכולל הורים לימוד מקצועות המושפעים. תהליך לקביעת אם הבסיס הגנטי של המחלה עלולה לגרום לחלק מן המוטציות דה נובו ועל הגישה המולקולרית להקים קישור זה יהיה מאויר, באמצעות אוטיזם וסכיזופרניה כדוגמאות.

אסטרטגיה גנטית מולקולרית למציאת דה נובו מוטציות גרימת הפרעות שכיחות כמו אוטיזם וסכיזופרניה.

ישנן מספר ראיות התומכות בתפקידן של מוטציות דה-נובו (de novo mutations) כמנגנון להפרעות נפוצות, כגון אוטיזם וסכיזופרניה. ראשית, ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא היכולת לזהות מוטציות de novo בהפרעות גנטיות נפוצות. לאחר שזוהתה מחלה התואמת את היפותזת מוטציות ה-de novo, מיושמים קריטריונים קריטיים לבחירת מקרי חולים שמהם יסרקו מוטציות de novo. לאחר מכן, נעשה שימוש בריצוף באיכות גבוהה ובספיקה נמוכה, או בריצוף כל האקסום, כדי לזהות מוטציות אלו באמצעות אסטרטגיה זו.מוטציות De Novo בגן Shank three נמצאו בנבדקים הסובלים מסכיזופרניה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הגנטיקה של סכיזופרניה ואוטיזם, היא יכולה לשמש גם למחקר של מחלות נפוצות אחרות, כגון פיגור שכלי.לא כל המחלות מתאימות לפרופיל של מחלה דה נובו (de Novo Disease). לכן, לפני פירוט הפרוטוקול, אלו הם הקריטריונים החיוניים שמחלה חייבת לעמוד בהם כדי להיחשב כמועמדת למחלה עם מוטציית Novo. מטופלים חולים מראים ירידה בכושר ההישרדות (fitness).המחלה נמצאת לעיתים קרובות בסביבות משתנות מאוד. המחלה קשורה לעיתים לגיל אב גבוה יותר. מחקרי קישור (linkage) ואסוציאציה קלאסיים אינם מסבירים חלק משמעותי מהתורשתיות של המחלה.ולסיום, נתוני התאמה בתאומים חייבים לתמוך במודל de novo. לאחר מכן, יש להחיל קריטריונים לבחירת דגימות עם סבירות גבוהה לנוכחות של מוטציה de novo. מוטציית de novo נמצאת במתאם עם הופעה מוקדמת, פנוטיפים חמורים, הורים שאינם מושפעים ואבות מבוגרים שאינם סובלים מתסמיני המחלה.הזמינות של DNA עלולה להגביל את בחירת הדגימות. אלא אם כן זמינות דגימות הן מהמטופל והן מהוריו של המטופל, לא ניתן לשלול העברה (transmittance). בנוסף, נדרשת זמינות של קבוצות מושפעות נוספות ונבדקים תקינים לצורך תיקוף של גן מועמד שזוהה.כאשר נאסף גודל מדגם מספיק של מועמדים וביקורות, יש להמשיך בבחירת המועמד הטוב ביותר לניתוח. בחירת הגנים מתבססת על מערכת ניקוד. לדוגמה, ניתן להשתמש בסט קריטריונים זה לצורך ניקוד גנים הקשורים למחלות נוירו-קוגניטיביות.מחלות נוירולוגיות כגון טרשת נשיתית צדית (myotrophic lateral sclerosis), למשל, יעשה שימוש בקריטריונים שונים מאוד. אלו כוללים ראיות למעורבות סינפטית, ראיות למיקום סינפטי, נתוני ביטוי ברקמה, נתוני דגמי בעלי חיים, נתוני קוגניציה, טיעונים מניתוח גנטי ומעורבות גנטית. לאחר החלת קריטריונים אלו, ניתן להוציא גנים רבים מהמחקר לטובת מועמדים טובים יותר.לאחר הריצוף, עבור הגנים המועמדים, יש להשתמש בשילוב של שניים או יותר מכלי ניתוח רצפים, כיוון שהם פועלים בדרך כלל באופן שונה. לדוגמה, שיעור המוטציות החיוביות השגויות עבור SMPs, כפי שחושב על ידי תוכנת polys scan כפי שמוצג בגרף זה, גבוה יותר מהערך שחושב על ידי תוכנת poly Fred. תוכנת polys scan מראה גם שיעור מוטציות נמוך יותר עבור indels בהשוואה ל-poly Fred.כשלב סופי עבור כל וריאנט אקסוני חדש, יש לשלול ארטיפקטים טכניים על ידי אישור חוזר, באמצעות PCR וריצוף מחדש. אזור העניין מתוך DNA שהופק מדגימות דם של המטופל ושל שני ההורים; ביצוע שלב זה על DNA מדם הוא חשוב, מכיוון שחלק מהמוטציות עשויות לנבוע מארטיפקטים שנגרמו כתוצאה מחלוקה של תרביות של קווי תאי לימפובלסטים. חלופה יעילה לריצוף של גנים מועמדים נבחרים היא שימוש בריצוף רצף גבוה (high throughput sequencing) כדי לרצף את האזורים המקודדים של 16,000 גנים.ערכות להכנת דגימות עבור ריצוף כל האקסום (whole exome sequencing) זמינות כעת מחברות מסחריות שונות. כאשר רצופים אלו חוזרים למעבדה, קיימים מספר כלי ביואינפורמטיקה לבחירה לצורך זיהוי וטיפוס גנטי (genotyping) של וריאציה גנומית. כעת, לפני תיעוד פריוריטציה של מוטציות בתוך כל האקסום, בחרו וריאנטים מתוך גנים מועמדים המדורגים, כפי שהוסבר קודם לכן.עבור כל הווריאנטים, יש לתעדף כל אחד מהם על פי שני קריטריונים. ראשית, הווריאנט צריך להיות ייחודי ואינו אמור להופיע אצל ההורים, או במאגרי מידע ציבוריים של s ו-p. שנית, הווריאנטים נחזים כמשפיעים על תפקוד הגן בהתאם למיקומם ברצף, על ידי קיצור או שינוי.הציפוי. תוכנות כגון PolyPhen, sift ו-Panther יכולות לבצע תחזיות אלו כדי לזהות מוטציות גורמות אחרות ולוודא שהמוטציות שזוהו אינן נוכחות באנשים בריאים, באמצעות רצף מחדש של הגן השלם במקרים נוספים של חולים ובביקורות. כל גן המכיל לפחות מוטציה de novo אחת שחוזה כגורמת לנזק (deleterious) צריך לעבור מחקרי תיקוף נוספים. ניתן לאפיין תפקודית וריאנטים מאושרים על ידי ביצוע ניתוח mRNA ו/או חלבון בתרביות תאים או במודלים של בעלי חיים הנושאים את המוטציות.ניתן לבצע אנליזות פונקציונליות אלו על קווי תאים או במודלים של בעלי חיים תוך שימוש בגישת גנומיקה של מועמדים באיכות גבוהה ובסביבתיות נמוכה. גן עם שתי מוטציות de novo שונות נמצא אצל חולי סכיזופרניה. מוטציית nonsense אחת נמצאה בשלושה אחים נפגעים.במשפחה זו, המוטציה גרמה לאות סיום מוקדם בקודון 1,117 של הגן shank3. במשפחה אחרת, נמצאה מוטציית missense באותו הגן אצל נקבה שנשאה את התכונה. מוטציה זו משנה ארגנין לטריפטופאן, חומצת אמינו שונה מאוד, בקודון 536.לאחר צפייה בסרטון זה ושימוש בשיטות המתוארות, אתם אמורים להיות מסוגלים להעריך את המחלה הנחקרת כדי לבדוק האם מוטציות Novo ממלאות בה תפקיד.

a-strategy-to-identify-de-novo-mutations-common-disorders-such-as

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מערך CGH לצורך זיהוי של גרסאות עותק מספר הגנומי החליף ניתוח קריוטיפ התאגדו-G. מאמר זה מתאר את הטכנולוגיה והיישום שלה במעבדת שירות לאבחון.

מערך השוואתי הגנום הכלאה (Array CGH) לאיתור של הגנום גרסאות מספר עותק

Periventricular קשרי הטרוטופיה (PNH) היא הצורה הנפוצה ביותר של מום ההתפתחות בקליפת המוח (MCD) בבגרות אבל את הבסיס הגנטי שלה אינו ידוע במקרים ספורדיים ביותר. לאחרונה פיתחנו אסטרטגיה לזיהוי גנים מועמדים חדשניים עבור MCDs וכדי לאשר ישירות שלהם תפקיד סיבתי בתוך vivo.

אסטרטגיה רומן המשלב מערך-CGH, רצף שלם-exome and בתוך הרחם אלקטרופורציה בחולדות לזיהוי גנים סיבתי של מומים המוח

אנו מציגים תוכנית אסטרטגית ופרוטוקול לזיהוי וריאנטים גנטיים לא מקודדים המשפיעים על קשירת ה-DNA של גורם השעתוק (TF). פרוטוקול ניסיוני מפורט מסופק לבדיקת משמרת ניידות אלקטרופורטית (EMSA) וניתוח משקעים של זיקה ל-DNA (DAPA) של קשירת TF DNA תלויה בגנוטיפ.

הקרנה עבור וריאנטים גנטיים ללא קידוד תפקודיים באמצעות ניידות Electrophoretic Shift Assay (Emsa) ו Assay משקע זיקת DNA (DAPA)

התפתחותיות תהליכים כגון התפשטות ההעברה, תוצר neurite לעיתים קרובות מוטרד מנוטלי מחלות. לפיכך, אנו מציגים פרוטוקולים להעריך במהירות, reproducibly אלה בתהליכי התפתחותיות NPCs נגזר iPSC אנושי. פרוטוקולים אלה מאפשרות גם להערכת ההשפעות של גורמי גדילה הרלוונטיים הרפוי על פיתוח NPC.

זיהוי מהיר של פנוטיפים התפתחותיות בתאי האדם קודמן עצבית (NPCs)

הדור הבא רצפי (הגדרות) הוא כלי רב עוצמה עבור אפיון גנומית זה מוגבל על ידי שיעור שגיאה גבוהה של פלטפורמת (~0.5–2.0%). אנו מתארים את השיטות שלנו של רצף שגיאות המאפשרים לנו במחלקותיכם שיעור שגיאה המיתרים, לזהות מוטציות ב- variant אלל שברים כמו שנדיר למצוא 0.0001.

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

הפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD) קשורה להתנהגות חברתית ותקשורתית לקויה ולהופעתה של התנהגות חזרתית. לצורך חקר הקשר בין גנים אוטסיים וליקויים התנהגותיים במודל דרוזופילה , מתוארות במאמר זה חמש פרדיגמות התנהגותיות להערכת ריווח חברתי, תוקפנות, חיזור, טיפוח והתנהגות הרגלה.

פרדיגמות להערכה התנהגותית במודל דרוזופילה של הפרעת הספקטרום האוטיסטי

מודלים של מכרסמים הם כלים רבי ערך לחקר התנהגויות ליבה הקשורות להפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD). במאמר זה, אנו מסבירים על שני מבחנים התנהגותיים למידול מאפייני הליבה של ASD בעכברים: טיפוח עצמי, המעריך התנהגות חוזרת, ומבחן אינטראקציה חברתית בן שלושה חדרים, המתעד ליקויים חברתיים.

אסטרטגיות להערכת התנהגויות דמויות אוטיסטיות בעכברים

כתב יד זה מציג פשוט, אך רב עוצמה, בשיטה חוץ גופית להערכת התכווצות שריר חלק בתגובה לסוכנים תרופתיים או גירוי עצב. יישומים עיקריים הם הקרנת סמים ופיזיולוגיה רקמת הבנה, פרמקולוגיה, ופתולוגיה.

שריר חלק בשלפוחית ​​השתן רצועת התכווצות כשיטה להערכת נמוכה יותר בדרכי שתן פרמקולוגיה

ניתוח תמונה ברשתית הוא הליך לא פולשני המאפשר הדמיה זרימת הדם. ההשפעה של גורמי סיכון למחל לב וכלי דם יכולה לגרום לשינויים של קליבר כלי רשתית. הנהלים לרכוש תמונות הפונדוס וצעדים לחישוב הכלי בקליבר מתוארים.

צילום קרקעית העין ככלי נוח ללמוד תגובות כלי הדם לגורמי סיכון קרדיווסקולריים מחלות באפידמיולוגיים לימודים

העבודה הנוכחית ממחישה את הנוחות של שימוש באימונותרפיה תת-לשונית כדי להגביר את התגובה החיסונית המולדת בריאות ולהעניק הגנה מפני דלקת ריאות פנאומוקוקית חריפה בעכבר.

אימונותרפיה תת לשונית כחלופה ללהשרות הגנה מפני זיהומים בדרכי הנשימה חריפים

למד אסטרטגיה לזיהוי מוטציות דה נובו בהפרעות נפוצות כמו אוטיזם וסכיזופרניה באמצעות ריצוף אקסומי וכלים ביואינפורמטיים. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לזהות גנים מועמדים ולאמת ממצאים בדגמים תאיים ובעלי חיים.

אסטרטגיה לזהות מוטציות דה נובו בהפרעות נפוצות כגון אוטיזם וסכיזופרניה

גלה סרטונים נוספים