באמצעות assay הפאן ויראלי microarray (Virochip) אל מסך דוגמאות קליניות עבור פתוגנים ויראליים

הליך זה משתמש ב-Viro chip, מערך מיקרו-מערכים (microarray) פנו-ויראלי לניתוח דגימות קליניות לזיהוי נגיפים ידועים ולא ידועים. ראשית, חומצות גרעיניות מופקות מהדגימות הקליניות. לאחר מכן, ה-RNA שהופק עובר תמלול הפוך באמצעות פריימרים אקראיים.

מבוצע סינתזה של גדיל שני של ה-CD NA וספריית ה-CD NA מוגברת באמצעות PCR רנדומלי. לאחר מכן, ה-cd NA המוגבר מסומן בצבעים פלואורסצנטיים ועובר היברידיזציה למערך מיקרו-צ'יפ ויראלי. השלב הסופי הוא סריקה וניתוח של מערך המיקרו-צ'יפ.

בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות נוכחות או היעדר של נגיף אחד או מספר נגיפים באמצעות ניתוח של שבב המיקרו-מערך (microarray chip). שיטות זיהוי רחבות-טווח, כגון שבב מיקרו-מערך נגיפי, נחוצות במיקרוביולוגיה אבחנתית כיוון שתסמונים קליניים נפוצים, כגון דלקת ריאות, אינם ספציפיים לפתוגן בודד, ובשל האיום המתמשך של פתוגנים נגיפיים חדשים, כגון נגיף הקורונה SARS ונגיף השפעת H1N1 החדש של 2009. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה האבחנתית, כגון איזה אחוז מהזיהומים שלא אובחנו במסגרת קלינית עלולים להיגרם על ידי נגיפים חדשים שטרם זוהו. ההשלכות של טכניקה זו פונות לעבר אבחנה טובה יותר של מחלה קלינית חריפה בבית החולים, כיוון שאנו בודקים מאות עד אלפי פתוגנים פוטנציאליים בו-זמנית.

הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה בשנת 2002, כאשר החלטנו ליישם את טכנולוגיית המיקרו-מערכים (microarrays) שפותחה לאחרונה במעבדתו של ד"ר Joseph DeRisi ב-UCSF לזיהוי נגיפים. מקרה הבוחן הראשון שלנו בעולם האמיתי היה שימוש בשבב נגיפי לזיהוי קורונה-וירוס חדש שהיה אחראי ל-SARS בשנת 2003. את הפרוצדורה מההתחלה ועד לסופה תדגים טכנאית מהמעבדה שלי, אשר תציג את השימוש בבדיקת השבב הנגיפי על דגימה של מטוש נזאלי מילדה, כדי לאבחן את הסיבה למחלה הנשימתית החריפה שלה. דגימות של מטוש נזופרינגיאל נאספות במיכלים סטריליים המכילים מדיום נוזלי להעברת נגיפים, ונשמרות בהקפאה במקפיא של 80°C-.

במסיכת בטיחות ביולוגית, יש לאפשר למבחנה המכילה את הדגימה להפשיר ולערבב קצרה את מקל הדגימה בתווך לפני השלכתו לפח פסולת ביולוגית מסוכנת. לאחר מכן, העבר מנבוב של 200 µL מהדגימה למבחנה של 1.5 mL. העבר את הדגימה דרך מסנן סבוב (spin filter) של 0.22 micron לצורך ניקוי חלקיקי נגיף, אל תוך מבחנה נקייה של 1.5 mL.

בשלב הבא, השתמש בערכת ה-Turbo DNA מבית Ambien לפי הוראות היצרן כדי לפרק DNA גנומי של המאחסן ולטהר חומצות גרעין נגיפיות עטופות ומוגנות. לאחר מכן בצע מיצוי RNA, באמצעות ערכת מיצוי RNA נגיפי XMO ZR או ערכת הנגיפים של Qiagen ultrasound לפי הוראות היצרן. מדוד את ריכוז ה-RNA המומצא באמצעות ספקטרופוטומטר לחומצות גרעין מסוג NanoDrop.

ריכוז ה-RNA הוא רצוי לפחות 10 nanograms per microliter, אך הוא ישתנה מדגימה לדגימה תוך שימוש במבחנה בעלת דופן דקה של 200 microliter. הוסף one microliter של פרימר A בריכוז של 40 PICA moles per microliter לארבעה microliters של RNA שחולץ. חמם את הדגימה ל-65 degrees Celsius למשך חמש דקות בטרמוסייקלר, ולאחר מכן אפשר למבחנה להתקרר לטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.

בשלב הבא, הוסף חמישה µL של תערובת מאסטר (master mix) המכילה שני µL של RT buffer בריכוז 5x, מיקרוליטר אחד של 12.5 mM dNTP, מיקרוליטר אחד של מים, 0.5 µL של 0.1 M DTT ו-0.5 µL של reverse transcriptase בתוך תרמוסייקלר. דגור את המבחנה בטמפרטורה של 42 °C למשך 60 דקות. לאחר מכן, חמם את הדגימה ל-94 °C למשך שתי דקות.

כדי להפסיק את תגובת התעתק התשומתית, קבעו את הטמפרטורה ל-10 degrees Celsius למשך שתי דקות ובצעו סבב קצר בצנטריפוגה (pulse centrifuge) למשך חמש שניות. לאחר מכן, הוסיפו חמישה µL של תערובת quease המורכבת מ-1 µL של 5x quease buffer, 3.8 µL מים ו-0.15 µL של quease the second strand synthesis. הגדירו במכשיר התרמוסייקלר עלייה בטמפרטורה מ-10 degrees Celsius ל-37 degrees Celsius לאורך שמונה דקות.

החזיקו בטמפרטורה של 37 °C למשך שמונה דקות. לאחר מכן, חממו ל-94 °C למשך שתי דקות כדי להשבית את האנזים, וקררו ל-10 °C בשלב זה. במידת הצורך, אחסנו את הדגימה המכילה 15 µL של cDNA בטמפרטורה של -20 °C.

ראשית, הוסף 5 µL של דגימת CD NA ל-45 µL של תערובת מאסטר (master mix) המורכבת מ-5 µL של באפר PCR בריכוז 10X, 1 µL של DNTP בריכוז 12.5 mM, 1 µL של פריימר B בריכוז 100 pmol/µL, 1 µL של cleantech LA ו-37 µL של מים. לאחר מכן, בצע את פרוטוקול ה-PCR באופן הבא: 94 °C למשך שתי דקות, ולאחריהם 25 מחזורים של 94 °C למשך 30 שניות, 50 °C למשך 45 שניות ו-72 °C למשך דקה אחת.

לאחר מכן, שלב דניטורציה (denaturing) של 72 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ואחריו השהייה ב-10 מעלות צלזיוס לאחר ה-PCR. בדוק את תוצרי ה-PCR באמצעות ג'ל אלקטרופורזה של 1.5% agarose. יש לצפות במריחה (smear) של בערך 200 עד 1000 זוגות בסיסים.

כדי לשלב AAD DNTP, הוסף חמישה µL של תוצר PCR ויראלי ל-45 µL של תערובת מאסטר (master mix) המורכבת מחמישה µL של PCR buffer בריכוז 10x, מיקרוליטר אחד של A-A-D-N-T-P בריכוז 12.5 mM, מיקרוליטר אחד של פריימר B בריכוז 100 p, מיקרוליטר אחד של ClinTech LA ו-37 µL מים. בצע את פרוטוקול ה-PCR באופן הבא: 94 °C למשך שתי דקות, 15 מחזורים של 94 °C למשך 30 שניות, ו-50 °C למשך 45 שניות.

72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, שלב annealing של 72 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות ושמירה ב-10 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, נקה את תוצרי ה-PCR החדשים באמצעות ערכה של DNA clean and concentrator three לפי הוראות היצרן ודלל ב-10 µL של elution buffer. הוסף 1 µL של bicarbonate בריכוז 1 M ו-1 µL של si three ל-10 µL של תוצרי ה-PCR והדגר למשך שעה אחת בחושך.

בשלב הבא, נקה שוב את הדגימה המסומנת ב-S באמצעות ערכת DNA clean and concentrator five ובצע אלוציה לתוך 12 µL של elution buffer. השתמש ב-1.5 µL מהדגימה כדי לבדוק את ריכוז ה-CDNA ואת כמות הצבע שהוכנסה באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop בתוך מבחנה של PCR strip tube עם 1 µL של 25 times fragmentation buffer, 5 µL של five times blocking buffer, ו-9.5 µL או הכמות הדרושה להגעה לריכוז סופי מנורמל של 10 pM של דגימת SI three מסומנת, ומים לנפח כולל של 25 µL. לאחר מכן, הוסף 25 µL של two times GX hybridization buffer, וסבב קצרת (spin down) כדי להסיר בועות.

הניחו שקופית עם אטם חדשה בתא ההכלאה (hybridization chamber). טענו 40 µL מהדגימה על שקופית האטם. לאחר מכן, הניחו את מערך הווירוסים המודפס של Agilent, כאשר הצד המסומן ב-Agilent פונה כלפי מטה, מעל שקופית האטם והדקו את הבורג היטב.

הנח את תא ההיברידיזציה בתנור בטמפרטורה של 65 °C ובצע היברידיזציה למשך לילה תוך סיבוב איטי של 10 סיבובים לדקה לשטיפת המערכים. ראשית, חמם מראש את בופר 2 ל-37 °C בזמן החימום. מלא מיכל פלסטיק של 500 milliliters בכ-250 milliliters של בופר 1.

הוצא את המערך מתא ההיברידיזציה, טבול אותו במנוזל והפרד אותו משקופית האטם. העבר את המערך למכל נקי ושטוף אותו בבופר 1 למשך דקה אחת. לאחר מכן, השתמש במכל פלסטיק נפרד בנפח 500 מיליליטר.

שטפו את המערך בבופר שני שחומם מראש למשך דקה אחת. לאחר השטיפה, הוציאו את המערך לאט מהבופר השני, תוך הקפדה להימנע מהיווצרות בועות.

השתמשו בנייר סופג מסוג kim wipe כדי לספוג לחות עודפת, תוך הקפדה להימנע ממגע ישיר בצד הפעיל של המערך. לבסוף, הניחו את השקופית בתוך מחזיק השקופיות כאשר צד Agilent פונה כלפי מעלה, והחדירו אותה לסורק המערכים. בהליך זה, אנו משתמשים בסורק DNA microarray של Agilent בעל רזולוציה של שני מיקרון.

סרוק את מערך ה-SI three המסומן ברזולוציה של חמישה מיקרונים או שני מיקרונים בהתאם לפרוטוקול הסריקה הסטנדרטי של המכשיר. נתח את מערכי השבבים הוויראליים באמצעות ניתוח אשכולות (cluster analysis) או באמצעות תוכנת ניתוח השבבים האוטומטית RO chipp e unpredic. באמצעות מערך השבבים Viro Chipp microarray 2009, ניתן לזהות בקלות את נגיף השפעת H one N one החדש בדגימת מטוש מהאף שנלקחה מילד עם מחלה דמוית שפעת.

בנוסף, הראינו כי השבב הויראלי מסוגל לזהות לא רק נגיפים נשימתיים, אלא גם קשת רחבה של נגיפים ממגוון רקמות ונוזלי גוף שונים. מספר דוגמאות לזיהוי נגיפים בדם מלא ובסרום באמצעות ה-vichi כפי שמוצג כאן. אלו הן תוצאות התואמות למערך המיקרו-מערכים (microarray) של ה-viro chip מדגימות דם, דם מלא או סרום שנלקחו מארבעה מטופלים עבור כל דגימה; שתי תחזיות הנגיפים המובילות מוצגות, כאשר תחזית הנגיף המובילה ביותר היא בעלת ה-P value הנמוך ביותר.

לדוגמה, בדגימה המודגשת בכחול בהיר, החיזוי המוביל עבור אותה דגימה הוא נגיף הדנגי מסוג 1. בעוד שהחיזוי במקום השני הוא נגיף הדנגי מסוג 2, הנגיף בפועל בדגימת דם מלא זו אכן הוכח כנגיף הדנגי מסוג 1, בתיאום עם תוצאות הדיקטו (dict). יישום נוסף של ה-viro chip הוא גילוי פתוגנים חדשים.

דוגמאות לכך כוללות את הגילויים של sars coronavirus X-M-R-V-A, רטרו-וירוס OME הקשור לסרטן הפרוסטטה ולתסמונת העייפות הכרונית בבני אדם, ו-HTCV, וירוס לב אנושי (cardio virus) חדש הקשור לזיהומי נשימה ושלשולים בילדים. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך 12 שעות אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להבטיח את זמינותם של כל הציוד והריאגנטים הדרושים בהתאם לפרוצדורה זו.

ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון הגברה ספציפית של נגיפים באמצעות PCR וריצוף עמוק (deep sequencing), כדי לאשש ולעקוב אחר דפוסי היברידיזציה חריגים בצ'יפ נגיפי או תוצאות צ'יפ המצביעות על נוכחות של נגיף חדש לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום האונקולוגיה לבחון את הקשר בין נגיפים חדשים לסרטן, בתחומי ההגנה הביולוגית והמיקרוביולוגיה הקלינית לפיתוח בדיקות מבוססות מיקרו-מערכים דחוסים לאבחון מהיר של פתוגנים, ובתחום הוירולוגיה לאפיון נגיפים חדשים והקשר שלהם למחלות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי ביצוע כל שלבי בדיקת המיקרו-מערך (microarray) של הצ'יפ הנגיפי, שהיא בדיקת מעקב רחבת ספקטרום לזיהוי פתוגנים נגיפיים בדגימות קליניות, החל ממיצוי חומצות גרעין מדגימות קליניות ועד להיברידיזציה של המיקרו-מערך וניתוח התוצאות.

יש לזכור כי עבודה עם דגימות קליניות נחשבת למסוכבת ביולוגית, ויש לבצע את מיצוי חומצות הגרעין במעבדות מדורגות ברמת בטיחות ביולוגית 2 ומעלה.