באמצעות assay הפאן ויראלי microarray (Virochip) אל מסך דוגמאות קליניות עבור פתוגנים ויראליים

הליך זה משתמש בשבב Viro, מבחן מיקרו-מערך פאן ויראלי לניתוח דגימות קליניות עבור נגיפים ידועים ולא ידועים כאחד. חומצות גרעין ראשונות מופקות מדגימות קליניות. לאחר מכן, ה-RNA המופק מתועתק הפוך באמצעות פריימרים אקראיים.

סינתזת CD NA גדיל שני מתבצעת וספריית CD NA מוגברת עם PCR אקראי. לאחר מכן ה-cd NA המוגבר מסומן בצבעים פלואורסצנטיים ועובר הכלאה למיקרו-מערך שבבים ויראלי. השלב האחרון הוא סריקה וניתוח של המיקרו-מערך.

בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות נוכחות או היעדר של וירוס או מספר וירוסים באמצעות ניתוח של מיקרו-מערך השבבים. יש צורך בשיטות זיהוי רחבות טווח כגון מיקרו-מערך צ'יפ ויראלי במיקרוביולוגיה אבחנתית מכיוון שתסמונות קליניות נפוצות כגון דלקת ריאות, אינן ספציפיות לפתוגן בודד כלשהו, ובגלל האיום המתמשך המתעורר של פתוגנים נגיפיים חדשים כמו נגיף הקורונה SARS ונגיף השפעת החדש H one N אחד משנת 2009, שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה האבחנתית, כגון איזה אחוז מהזיהומים הלא מאובחנים בסביבה הקלינית עלולים להיגרם על ידי נגיפים חדשים שעדיין לא זוהו. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון טוב יותר של מחלה קלינית חריפה בבית החולים מכיוון שאנו בודקים מאות עד אלפי פתוגנים פוטנציאליים בו זמנית.

הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה בשנת 2002 כאשר החלטנו ליישם את הטכנולוגיה החדשה שפותחה של מיקרו-מערכים שפותחה במעבדתו של ד"ר ג'וזף דריסי ב-UCSF לזיהוי וירוסים. מקרה המבחן הראשון שלנו בעולם האמיתי היה שימוש בשבב הנגיפי כדי לזהות נגיף קורונה חדש האחראי ל-SARS בשנת 2003, וידגים את ההליך מתחילתו ועד סופו יהיה טכנאי מהמעבדה שלי שידגים את השימוש בבדיקת השבב הנגיפי על דגימת משטח אף של ילדה כדי לאבחן את הגורם למחלת הנשימה החריפה שלה. דגימות ספוגית האף נאספות במיכלים סטריליים המכילים הובלה ויראלית, מדיה נוזלית, ומאוחסנות קפואות במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס.

במכסה מנוע לבטיחות ביולוגית, אפשר לצינור המכיל את הדגימה להפשיר ולערבב לזמן קצר את הספוגית במדיה לפני השלכת הספוגית לפח מותניים מסוכן ביולוגית. לאחר מכן יש להוציא 200 מיקרוליטר מהדגימה לתוך צינור של 1.5 מיליליטר. העבירו את הדגימה דרך מסנן ספין של 0.22 מיקרון כדי לטהר חלקיקים נגיפיים ולתוך צינור טרי של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן, השתמש בערכת ה-DNA של Turbo מבית Ambien לפי הוראות היצרן כדי לפרק את ה-DNA הגנומי של המארח ולטהר את חומצת הגרעין הנגיפית המוגנת. עקוב אחר זה עם מיצוי RNA, באמצעות ערכת מיצוי RNA ויראלי XMO ZR או ערכת הווירוסים של אולטרסאונד Qiagen לפי הוראות היצרן. מדוד את ריכוז ה-RNA המופק באמצעות ספקטרופוטומטר חומצות גרעין NanoDrop.

ריכוז ה-RNA הוא רצוי לפחות 10 ננוגרם למיקרוליטר, אך ישתנה מדגימה לדגימה באמצעות צינור דק של 200 מיקרוליטר. הוסף מיקרוליטר אחד של פריימר A בריכוז של 40 שומות PICA למיקרוליטר לארבעה מיקרוליטר של RNA שחולץ. מחממים את הדגימה ל-65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות במחזור תרמי, ולאחר מכן נותנים לצינור להתקרר לטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרוליטר של תערובת מאסטר המכילה שני מיקרוליטר חמש פעמים מאגר RT, מיקרוליטר אחד 12.5 מילי-מולר, DNTP מיקרוליטר אחד מים 0.5 מיקרוליטר, 0.1 DTT מולארי ו-0.5 מיקרוליטר כתב עילי שלושה, טרנסקריפטאז הפוך בתרמחזורר. דגרו את הצינור בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לאחר מכן מחממים את הדגימה ל 94 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות.

כדי לבטל את תגובת הטרנסקריפטאז ההפוך, התקשר ל-10 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות ודופק צנטריפוגה למשך חמש שניות. לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרוליטר של תערובת קוויז המורכבת ממיקרוליטר אחד פי חמש מאגר קוויז, 3.8 מיקרוליטר מים ו-0.15 מיקרוליטר קווז סינתזת הגדיל השני. הרם את התרמו-סייקלר מ-10 מעלות צלזיוס ל-37 מעלות צלזיוס במשך שמונה דקות.

יש להחזיק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שמונה דקות. לאחר מכן מחממים ל-94 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות כדי לנטרל את ההפסקה וקוראים ל-10 מעלות צלזיוס בשלב זה. אם תרצה, אחסן את הדגימה המכילה 15 מיקרוליטר CDNA במינוס 20 מעלות צלזיוס.

ראשית, הוסף חמישה מיקרוליטר של דגימת CD NA ל-45 מיקרוליטר של תערובת מאסטר המורכבת מחמישה מיקרוליטר פי 10 מאגר PCR, מיקרוליטר אחד 12.5 מילי-מולר, DNTP מיקרוליטר אחד 100 פומו לכל פריימר מיקרוליטר, B מיקרוליטר אחד קלינטק LA ו-37 מיקרוליטר מים. לאחר מכן הפעל את פרוטוקול ה-PCR באופן הבא, 94 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, ולאחר מכן 25 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. 50 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך דקה.

לאחר מכן מדרגת כריעה של 72 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ואחריה עצירה ב-10 מעלות צלזיוס לאחר PCR. בדוק את מוצר ה-PCR וג'ל אלקטרופורזה של 1.5% AOSE. יש לדמיין מריחה מכ-200 עד 1000 זוגות בסיסים.

כדי לשלב AAD DNTP, הוסף חמישה מיקרוליטר של מוצר PCR ויראלי ל-45 מיקרוליטר של תערובת מאסטר המורכבת מחמישה מיקרוליטר פי 10 מאגר PCR, מיקרוליטר אחד 12.5 מילי-מולר, A-A-D-N-T-P מיקרוליטר אחד 100 p של פריימר מרובה מיקרוליטר, B מיקרוליטר אחד ClinTech LA ו-37 מיקרוליטר מים. הפעל את פרוטוקול ה-PCR באופן הבא, 94 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, 15 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. 50 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות.

72 מעלות צלזיוס לדקה ומדרגת כריעה של 72 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות והחזקה ב-10 מעלות צלזיוס. לאחר מכן נקו את מוצר ה-PCR החדש עם ערכת ה-DNA הנקייה והריכוז לפי הוראות היצרן והכניסו פנימה 10 מיקרוליטר של מאגר פליטה. הוסף מיקרוליטר אחד של ביקרבונט מולארי אחד ומיקרוליטר אחד si שלושה ל-10 מיקרוליטר של מוצר PCR ודגירה למשך שעה בחושך.

לאחר מכן, שוב, נקו את הדגימה המסומנת ב-S עם ערכת DNA נקייה ורכזת חמש ושחררו פנימה 12 מיקרוליטר של מאגר פליטה. השתמש ב-1.5 מיקרוליטר של דגימה כדי לבדוק את ריכוז ה-CDNA ואת כמות הצבע המשולבת בספקטרופוטומטר NanoDrop בצינור רצועת PCR במיקרוליטר אחד, פי 25 מאגר פיצול, חמישה מיקרוליטר חמש פעמים חוסם מאגר 9.5 מיקרוליטר או כמות הדרושה לריכוז סופי מנורמל של 10 שיא או שומות למיקרוליטר של SI, שלוש דגימה מסומנת ומים לנפח כולל של 25 מיקרוליטר. לאחר מכן הוסף 25 מיקרוליטר של מאגר הכלאה של GX פי שניים, וסובב לזמן קצר כדי להסיר בועות.

הנח מגלשת אטם חדשה בתא ההכלאה. טען 40 מיקרוליטר מהדגימה על מגלשת האטם. לאחר מכן, הנח את המערך הוויראלי המודפס של Agilent כשהצד המסומן Agilent כלפי מטה על גבי מגלשת האטם והדק את הבורג בחוזקה.

מכניסים את תא ההכלאה לתנור של 65 מעלות צלזיוס ומכליאים למשך הלילה באמצעות סיבוב איטי של 10 סיבובים לדקה כדי לשטוף את המערכים. ראשית יש לחמם מראש שתיים עד 37 מעלות צלזיוס בזמן החימום. מלאו מיכל פלסטיק של 500 מיליליטר בכ-250 מיליליטר חיץ. אחד.

הסר את המערך מתא ההכלאה, הטביע את המערך והפרד אותו ממגלשת האטם. העבירו את המערך למיכל הנקי ושטפו במאגר אחד למשך דקה אחת. ואז באמצעות מיכל פלסטיק נפרד של 500 מיליליטר.

שוטפים את המערך במאגר שחומם מראש שניים למשך דקה אחת. לאחר הכביסה, הסר לאט את המערך מהמאגר. שנית, להיזהר להימנע מבועות.

השתמשו במגבון קים כדי לסלק לחות מיותרת תוך היזהרות להימנע מנגיעה ישירה בצד הפעיל של המערך. לבסוף, הנח את השקופית לתוך מחזיק השקופיות Agilent כלפי מעלה והכנס לסורק המערך. בהליך זה, אנו משתמשים בסורק מיקרו-מערך DNA של שני מיקרון Agilent.

סרוק את מערך ה-SI עם שלוש תוויות בחמישה מיקרון או שני מיקרון בהתאם לפרוטוקול הסריקה הסטנדרטי של המכשיר. נתח מיקרו-מערכי שבבים נגיפיים על ידי ניתוח אשכולות או תוכנית ניתוח שבבי RO אוטומטית e לא פרדיק. באמצעות Viro Chipp microarray 2009 נגיף השפעת החדש H one N אחד מתגלה בקלות בדגימת משטח האף שהתקבלה מילד עם מחלה דמוית שפעת.

בנוסף, הראינו כי השבב הנגיפי מסוגל לזהות לא רק וירוסים נשימתיים, אלא גם מגוון רחב של נגיפים ממגוון רקמות ונוזלי גוף שונים. כמה דוגמאות לזיהוי וירוסים בדם מלא ובסרום באמצעות הוויצ'י כפי שמוצג כאן. אלו הן קריאות המתאימות למיקרו-קרני שבב וירו מדגימות דם, דם מלא או סרום שנלקחו מארבעה חולים עבור כל דגימה, שתי תחזיות הנגיף המובילות מוצגות כאשר לחיזוי הנגיף העליון יש את ערך ה-P הנמוך ביותר.

לדוגמה, במדגם המודגש בכחול בהיר, התחזית המובילה לדגימה זו היא נגיף דנגי מסוג 1. בעוד שהתחזית המדורגת שנייה היא נגיף דנגי מסוג 2, הנגיף האמיתי בדגימת הדם השלמה אכן אושר כנגיף דנגי מסוג 1 בהתאם לתוצאות הכתבה. יישום נוסף של שבב הווירו הוא בגילוי פתוגנים חדשים.

כמה דוגמאות כוללות את התגליות של נגיף הקורונה X-M-R-V-A, רטרו-וירוס OME הקשור לסרטן הערמונית ותסמונת העייפות הכרונית בבני אדם ו-HTCV, וירוס לב אנושי חדש הקשור לזיהומים בדרכי הנשימה ושלשול בילדים לאחר שהשתלט עליהם. ניתן לבצע טכניקה זו תוך 12 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להבטיח את זמינותם של כל הציוד והריאגנטים הדרושים לאחר הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הגברת PCR ויראלית ספציפית וריצוף עמוק על מנת לאשר ולעקוב אחר דפוסי הכלאה חריגים של שבב ויראלי או תוצאות שבב ויראלי המצביעות על נוכחות של נגיף חדש לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האונקולוגיה לחקור את הקשר של נגיפים חדשים לסרטן בתחומי ההגנה הביולוגית והמיקרוביולוגיה הקלינית כדי לפתח בדיקות מבוססות מיקרו מרוכזות לאבחון מהיר של פתוגנים, ובתחום הווירולוגיה לאפיון נגיפים חדשים והקשר שלהם למחלות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את כל השלבים של בדיקת מיקרו-קרני השבב הנגיפי, בדיקת מעקב בספקטרום רחב לאיתור פתוגנים נגיפיים בדגימות קליניות, כל הדרך ממיצוי חומצות גרעין, מדגימות קליניות ועד הכלאה וניתוח מיקרו-קרניים.

אל תשכח שעבודה עם דגימות קליניות נחשבת למסוכנת ביולוגית ומיצוי חומצות גרעין צריך להתבצע במעבדות המדורגות ברמת בטיחות ביולוגית שתיים ומעלה.