Name: שילוב של לימוד למבוגרים, יליד נוירונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: חקור שילוב תפקודי של נוירונים חדשים בדנטט גירוס באמצעות תיוג רטרו-ויראלי ורישום patch-clamp במוח עכברים בוגרים. שיטה זו מאפשרת ניתוח מדויק של התבגרות סינפטית וחיבוריות במעגלים היפוקמפיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי NINDS ו איגוד הלב האמריקני כדי S.Ge. גישה זו הוקם ופותח על ידי המחבר במעבדה של ד&quot;ר Hongjun שיר של אוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס. ברצוננו להודות שיר ד&quot;ר Hongjun הדרכה ותמיכה שלו.

1. הזרקת וירוס High-titer רטרווירוס מהונדסים (1 × 10 9 יחידה / ml) מופק על ידי transfection משותפת של וקטורים retroviral ו VSVG לתאי HEK293T, ואחריו ultracentrifugation של supernatant ויראלי. עבור מקורות ושיטות הייצור, לראות את ההפגנה יופיטר מעולה (3). הערה: מבוגרים צעירים (4-6 שבועות) נקבה C57Bl / 6 עכברים (Charles River) הם שוכנו בתנאים סטנדרטיים. כל הנהלים לעקוב מדריך הלאומית למחקר של המועצה לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה תחת פרוטוקול שאושר על ידי Stony Brook University IACUC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי 2ul של רטרווירוס קפוא לכל בעל חיים על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש (100 מיקרוגרם קטמין + 10 xylazine מיקרוגרם לכל גרם משקל גוף) ואת הר החיה על מסגרת stereotaxic (Steolting). הסרת שיער על הראש ולנגב את העור עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הגולגולת לקדוח ארבעה חורים רדודים באמצעות מקדח שיניים (0.6mm המקדח) בשעה מרכזת את הפעולות הבאות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> anterioposterior = -2 מ"מ מן גבחת; לרוחב = ± 1.6 מ"מ; הגחון = 2.5 מ"מ; anterioposterior = מ -3 מ"מ גבחת; לרוחב = ± 2.6 מ"מ; הגחון = 3.2 מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> anterioposterior = -2 מ"מ מן גבחת; לרוחב = ± 1.6 מ"מ; הגחון = 2.5 מ"מ; anterioposterior = מ -3 מ"מ גבחת; לרוחב = ± 2.6 מ"מ; הגחון = 3.2 מ"מ. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר המילטון 1μl, שטוח קצה מזרק להזריק 0.5 רטרווירוס μl לכל אתר בשיעור של μl 0.25 / דקה לתוך gyrus משוננת. (ראו את הקואורדינטות לעיל עומק הגחון.) 2 השהה דקות לאחר ההזרקה לפני כל נסיגה לאט את המזרק כדי למנוע backflow נוזל. בין זריקות, בקצרה לשטוף את המשטח החיצוני של קצה המזרק עם PBS סטרילית המוליך כדי להסיר עקבות של דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הפצע עם חומר סטרילי תפר כירורגי (סוג P-1; גודל 6-0) ולהחזיר את בעל החיים בתנאי דיור סטנדרטית עד לשלבים הזמן הרצוי לאחר ההזרקה. </li></ol> 2. פורסים הכנה כדי להשיג איכות גבוהה פרוסות חריפה של עכברים בוגרים, אנחנו משתמשים בפתרון חיתוך שונה להכנת פרוסה (ראה להלן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום צמרמורת חיתוך פתרון 0-4 מעלות צלזיוס על הקרח בועה עם 95% -5% O 2 CO 2 במשך 30 דקות לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש ו transcardially perfuse חיה עם פתרון חמצן רווי קר כקרח חיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר במהירות את המוח לתוך צלחת פטרי עם נייר סינון, טרום הרטובות עם פתרון, קר חיתוך מחומצן. לנתק את המוח הקטן ואת פרוסה משטח הרכבה לפחות הקדמי 1mm לקואורדינטות (גלוי) את הזריקה. דבק המוח לבמה vibrotome ו הר זה לתוך תא חיתוך מלא פתרון חיתוך קר מחומצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פרוסות העטרה או אופקיים (300 350μm) ולהעביר אותם עם פיפטה גדול נשא אל חדר דוגרים המכיל בטמפרטורת החדר ACSF מבעבע עם 95% O 2 / 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את פרוסות, מבעבעים ללא הרף, על 32 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות. החזר את תא לטמפרטורת החדר למשך ההקלטה. </li></ol> 3. אלקטרו ניסויים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Slices מועברים לתא הקלטה אשר perfused ברציפות ב 32 ° C עם ACSF חמצן רווי - 34 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודה טונגסטן דו קוטבית גירוי ממוקם השכבה המולקולרית של gyrus משוננת באמצעות מיקרוסקופ בהגדלה נמוכה אובייקטיבי (10X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DGCs יילוד באזור תת פרטנית / שכבת תאים גרעיניים מזוהים ביטוי ה-GFP או dTomato. Whole-cell הקלטה patchclamp מבוצע על נוירונים היילוד בהגדלה גבוהה (40X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאפייני ירי של תאים רשמה מתקבלים על ידי הזרקה של סדרת זרמי תחת מצב מהדק הנוכחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גירויים חשמליים מועברים על ידי האלקטרודה גירוי באמצעות המבודד גירוי נשלט על ידי תוכנת הקלטה, עורר זרמים postsynaptic ב DGCs הילוד נרשמים. </li></ol> 4. ניתוח נתונים אמפליטודות התגובות postsynaptic עורר מנותחים בשלבים התפתחותיים שונים של מבוגר יליד נוירונים. 5. נציג תוצאות שימוש בפרוטוקול לעיל, ביטוי של GFP ב היילוד נוירונים gyrus משוננת דומה איור 1 נפוץ. שים לב נוירונים היילוד הם דמיינו בקלות הן דנדריטים ואקסונים מסומנים וחסונה. הביטוי אקסונים DGC דק קוצים קטן תלוי באיכות titer של הנגיף, מקדם בשימוש, אורך בביטוי vivo. בידיים שלנו, תאים היילוד המשנה הסלולר האברונים הם בדרך כלל גלויים בתוך כמה ימים לאחר ההזרקה, וביטוי עמוד השדרה ניתן לייחס החל מהשלבים המוקדמים של הפיתוח. Wחור תא הקלטות מתא עצב הנולד בשלבי זמן שונים לאפשר את לימוד ייחודיים המאפיינים תאים שזה עתה נולד, פוטנציאל פעולה כגון (איור 2 א), וכן את תהליך האינטגרציה הסינפטי לתוך מעגלים עצביים הקיימים במהלך ההבשלה (איור 2b). <img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> איור 1 2 פוטון תמונה confocal של נוירונים היילוד בסעיף gyrus אופקי משוננת עכבר מבוגר. תאים הירוק 21dpi (ימים שלאחר הזריקה) GFP-לבטא DGCs היילוד שכותרתו עם רטרווירוס pUX-GFP. <img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> איור 2 ב) פעולה פוטנציאל ירי המאפיינים של DGC בן יומו ב 21 dpi.) נציג עורר זרמים postsynaptic מעוררים (EPSCs) נרשם על DGC בן יומו ב 21 dpi.

<ol><li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functional+implications+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis.</a> Cell. 132, 645-660 (2008).</li>
<li>Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+regulates+synaptic+integration+of+newly+generated+neurons+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain.</a> Nature. 439, 589-593 (2006).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Neurogenesis רציף בהיפוקמפוס של מוח היונקים מבוגר מספקת מערכת ייחודית במודל ניסיוני ללמוד פיתוח ואינטגרציה עצב במוח הבוגר. הפרוטוקול המובא כאן משלב תיוג retroviral ושיטות אלקטרו ללמוד את השילוב של היילוד נוירונים גרגיר משוננת במוחם של עכברים בוגרים. על מנת להבטיח כי הניסויים שלך מצליחים, אנו ממליצים הבאים במהלך השלבים הקריטיים של ההליך: כדי למנוע זיהום דלקת לא רצויים, כל הכלים צריכים להיות מעוקרים (על ידי מעוקר, כל סוג של מעקר, או אתנול 70%) לפני הניתוח. השתמש PBS סטרילית כדי לשטוף את קצה מחט המזרק לפני ההזרקה. עבור זריקה וירוס, בעלי חיים חייב להיות מותקן גם על המכשיר stereotaxic ומקורות תנועה מיותרת חייב להיות ממוזער במהלך ההזרקה. ודא הראש מקובע היטב במשרד, ולהתאים את המיקום האף של העכבר לרמה גבחת ו למבדה לפני הזריקה חישוב קואורדינטות. תמצית וירוס לתוך המזרק במהירות כדי לצמצם את החשיפה לטמפרטורות החדר - הטמפרטורה רטרווירוסים הם רגישים במיוחד. הזרק וירוס לאט בקצב מומלץ למזער את הנזק הלחץ. שימוש מומלץ שקצהו שטוח מזרק (לעומת קצה משופעים משותף) יבטיח שטח מופץ באופן שווה משוננת זיהום gyrus. לפני הכנת פרוסות, חיתוך פתרון דוגרים ACSF חייב להיות מבעבע עם 95% O 2 CO 2 -5% במשך 30 דקות לפחות, כדי לאפשר לחמצן כדי להרוות את הפתרונות. בעלי חיים צריכים להיות perfused במהירות רקמת נשמר בתמיסה קר חמצן רווי, איכות פרוסה הטוב ביותר. עבור הקלטה, להגביר את עוצמת הגירוי בהדרגה עד אין תגובה postsynaptic. שינוי מיקום האלקטרודה גירוי בתוך השכבה המולקולרית של gyrus משוננת לפי הצורך. לסיכום, הגישה המומלצת מציעה דרך לחקור תכונות שונות ותפקידים תפקודית אפשרית של מבוגר יליד נוירונים במהלך האינטגרציה בשלב מוקדם לתוך המעגלים, פעיל בוגרת.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיתוך פתרון (מ&quot;מ): 110 כולין כלוריד, KCl 2.5, 1.3 KH 2 PO 4, 25.0 NaHCO 3, 0.5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 10 דקסטרוז, 1.3 ascorbate נתרן, 0.6 pyruvate נתרן, 5.0 חומצה kynurenic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוזל מלאכותית cerebro-השדרה (ACSF, מ&quot;מ): 125.0 NaCl, 25.0 NaHCO 3, 2.5 KCl, 2 CaCl 2, 1.3 KH 2 PO 4, 1.3 MgCl 2, 1.3 ascorbate נתרן, 0.6 pyruvate נתרן, 10 דקסטרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון פנימי patchclamp כל תאים (מ&quot;מ): 120 gluconate אשלגן, 15 KCl, 4 MgCl 2, 0.1 EGTA, HEPES 10.0, 4 MgATP, 0.3 Na 3 GTP, 7 phosphocreatine (pH 7.4, 300 mOsm). </li></ul>

שילוב של לימוד למבוגרים, יליד נוירונים

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis מתרחש במוחם של יונקים בוגרים באזור חדרית המשנה (SVZ) של החדר לרוחב באזור תת פרטנית (SGZ) של gyrus משוננת בהיפוקמפוס לאורך כל החיים. דיווחים קודמים הראו כי neurogenesis בהיפוקמפוס מבוגר קשורה בהפרעות מוח שונים, כולל דיכאון, אפילפסיה, סכיזופרניה וחרדה (1). פענוח תהליך של שילוב בוגרים שנולדו נורמלי סוטה נוירון עשוי לשפוך אור על האטיולוגיה של מחלות אלו ולהודיע ​​פיתוח טיפולים חדשים. Neurogenesis SGZ מבוגר מראות התפתחות עובריים עצביים שלאחר הלידה, כולל שלבי מפרט הגורל, הגירה, אינטגרציה סינפטית, והתבגרות. עם זאת, אינטגרציה מלאה מתרחשת על פני תקופה ארוכה 6 שבועות,. הקלט הסינפטי הראשונית מבוגר יליד תאים SGZ גרגיר משוננת (DGCs) הוא GABAergic, ואחריו קלט glutamatergic ב 14 ימים (2). גורמים ספציפיים המווסתים את היווצרות מעגל של מבוגר יליד נוירונים gyrus משוננת כרגע לא ידוע. המעבדה שלנו משתמשת שכפול מחסר וקטור retroviral מבוסס על נגיף Moloney Murine לוקמיה לספק חלבונים פלורסנט גנים רגולטוריים שיערו תאים אלה מתרבים. טכניקה זו מספקת סגוליות ויראלי ברזולוציה גבוהה לצורך ניתוח של תאריך הלידה התא, שושלת, מורפולוגיה, ו synaptogenesis. ניסוי טיפוסי לעתים קרובות מעסיקה שניים או שלושה וירוסים המכיל תווית ייחודית, transgene, ואלמנטים האמרגן לניתוח תא בודד של תהליך התפתחותי הרצוי in vivo. פרוטוקול הבאה מתארת ​​שיטה לניתוח נוירון תפקודית שילוב היילוד באמצעות ירוק אחד (GFP) או אדום (dTomato) רטרווירוס חלבון פלואורסצנטי ו-clamp תיקון electrophysiology.

הדרך ללמוד את השילוב של היילוד תאים גרגר משוננת בבעלי חיים מבוגרים מתואר. טכניקה זו משתמשת רטרווירוס מהונדסים תווית נוירונים היילוד, ואחריו הקלטות אלקטרו לקבוע אינטגרציה תפקודית vivo.

נוירוגנזה (יצירת נוירונים) מתרחשת במוחות של יונקים בוגרים באזור התת-וונטריקולרי (SVZ) של המערכות הצדיות ובאזור התת-גרנולרי (SGZ) של ה...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להציג דרך לבחון את האינטגרציה התפקודית של תאי גרנולה בגירוס הדנטט שנולדו בבגרות. דבר זה מושג ראשית באמצעות הזרקה סטריאוטקסיס של רטרו-וירוס לתוך הגירוס הדנטט של עכברים בוגרים כדי לסמן את תאי הגרנולה של הדנטט שנולדו לאחרונה. השלב השני של הפרוצדורה הוא ביצוע פרפוזיה לעכברים בשלבי זמן מסוימים עם תמיסת חיתוך קרה והוצאת המוח.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הכנת פרוסות מוח טריות (acute brain slices) באמצעות ויברטום. השלב הרביעי של הפרוצדורה הוא ביצוע הקלטות patch clamp של תא שלם (whole cell) בתאי גרנולה רעננים בגירוס הדנטט (dentate granule cells), וגירוי של השכבה המולקולרית של פרוסות המוח הטריות. לבסוף, ניתן לקבל תוצאות המראות אינטגרציה סינפטית תפקודית של נוירונים רעננים על ידי הקלטה וניתוח של זרמים פוסט-סינפטיים עורריים בנוירוני גרנולה רעננים בגירוס הדנטט.היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם סימון רטרו-ויראלי של נוירונים רכים במוח של בוגרים והכנת נתחי מוח טריים מבעלי חיים בוגרים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הנוירוגנזה בבגרות, כגון אובדן תפקודי של נוירונים רכים במוח הבוגר. הכינו את ההזרקה הויראלית על ידי הוצאת הרטרו-ויראוס המקודד לחלבון פלואורסצנטי ירוק GFP או לחלבון פלואורסצנטי אדום D tomato מהמקפיא והפשרתו על קרח.הרדימו עכברה נקבה בת ארבעה עד שישה שבועות והזריקו לה שני מיקרוליטרים של רטרו-וירוס לכל בעל חיים. בדקו את עומק ההרדמה באמצעות צביטה בכף הרגל, הצמידו את העכברה למסגרת סטריאוטקסית, גלחו את הפרווה מהראש ונגבו את העור עם 70% ethanol. השתמשו בסקלפל כדי לחתוך את העור ולחשוף את הגולגולת.כווננו את מיקום אפו של העכבר כך ש-bgma ו-lambda יהיו באותו מישור אופקי, באמצעות מקדח שיניים עם מקדח בקוטר 0.6 מילימטר. קדחו ארבעה חורים דרך הגולגולת בקואורדינטות המוצגות כאן. מלאו במהירות מזרק Hamilton בעל קצה שטוח בנפח של 1 µL עם הרטרו-וירוס שהופשר.מקם אותו מעל אחד החורים שנוצרו במינוס שני מילימטרים bgma כדי להחדיר את הרטרו-וירוס אל תוך ה-dentate gyrus. הורד את המזרק לעומק אנכי של 2.5 millimeters. מזריק 0.5 µL של רטרו-וירוס בקצב של 0.25 µL לדקה כדי למנוע זרימה חוזרת של הנוזל.המתינו שתי דקות לאחר כל הזרקה לפני שתוציאו את המזרק באיטיות. שטפו קצרות את פני השטח החיצוניים של קצה המזרק עם PBS סטרילי ואפליקטור כדי להסיר שאריות דם. השתמשו באותו הליך כדי להזריק 0.5 microliters של רטרו-וירוס לשלושה האתרים האחרים בעומקים ונטראליים של 2.5 או 3.2 millimeters.סגור את הפצע באמצעות חומר תפירה כירורגי סטרילי והחזר את בעל החיים לכלובו עד שהנוירונים הרכים יגיעו לתאריך הבשלות הרצוי. לאחר שיחלפו 21 ימים, הכן את המוח של העכבר לחיתוך על ידי הכנת התמיסות הדרושות. קרר את תמיסת החיתוך על קרח בטמפרטורה של 0 עד 4 °C והזרם בה בועות של 95% oxygen, 5% carbon dioxide למשך 30 דקות לפחות.השקיפו את הנוזל הצרברוספינלי המלאכותי (A CSF) בטמפרטורת החדר והנפיחו בו 95% oxygen ו-5% carbon dioxide למשך 30 דקות לפחות. לאחר 30 דקות על קרח, הכינו את תמיסת החיתוך רוויית החמצן המקוררת עבור פרפוזיה לבבית. לאחר הרדמת העכבר, בצעו פרפוזיה לבבית.לאחר מכן, הוצא את המוח במהירות והנח אותו בצלחת פטרי המכילה תמיסת חיתוך ופיסת נייר סינון. חתוך את המוחך הקטן, ולאחר מכן בצע חיתוך קורונלי (שפני) במרחק של מילימטר אחד עד שניים קדמה לאתרי ההזרקה כדי ליצור משטח שטוח לצורך הקיבוע.הדביקו את המוח על פלטפורמת vibram. התקינו את הפלטפורמה בתוך תא החיתוך של ה-vibram הממולא בתמיסת חיתוך מחומצנת. הורידו את הלהב והגדירו את חלון החיתוך במכשיר ה-Vibram.התחילו בחיתוך הרקמה. חתכו כל פרוסה לשני חצאים לאורך קו האמצע. השתמשו בפיפט בעל קוטר רחב כדי להעביר את הפרוסות הללו לתא דגירה בטמפרטורת החדר.טמפרטורה A CSF המבעבע עם 95% oxygen ו-5% carbon dioxide. המשך בחיתוך עד שקצהו הקדמי של ההיפוקמפוס יהיה גלוי. הדגר את הפרוסות בריבוע מים בטמפרטורה של 32 degrees Celsius תחת בועיות רציפות למשך 30 עד 60 דקות.החזירו את תא הדגירה לטמפרטורת החדר למשך זמן ההקלטה. הפרוסות מוכנות כעת להקלטה. התחילו בביצוע פרפוזיה של תא ההקלטה עם A CSF רווי חמצן בטמפרטורה של 32 עד 34 degrees Celsius בקצב של כ-two milliliters per minute.השתמש בפינצטה רחבה להעברת פרוסה לתא ההקלטה. הנח חוט פלטינה בצורת U עם חוטי ניילון מעל הפרוסה כדי לקבע אותה תחת הגדלה נמוכה. זהה את השכבה המולקולרית של הפיתול השינני (dentate gyrus).לאחר מכן, הורידו את אלקטרודת הגירוי אל השכבה המולקולרית של הגירוס דנטט (dentate gyrus). תחת הגדלה גבוהה, זהו את תאי הגרנולה הנולדים של הגירוס דנטט באזור התת-גרנולרי או בשכבת הגרנולה באמצעות ביטוי של סימון חלבוני פלואורסצנטי ירוק או אדום.אתרו נוירונים רכים המבטאים GFP או D tomato על ידי מעבר בין מסנני DIC למסננים פלואורסצנטיים. בחרו תא בעל פלואורסצנציה בהירה יחסית וגוף תא בריא לצורך הקלטת whole cell patch clamp. הכניסו מיקרופיפט זכוכית עם התנגדות קצה של 3 עד 6 mega ohm, מלא בתמיסה פנימית מתאימה, למחזיק מיקרופיפטים בראש המגבר תחת עדשת המיקרוסקופ בעלת ההגדלה הגבוהה.הורידו את המיקרופיפט באמצעות מיקרו-מניפולטור אל תא הגרנול הנבחר בגיבב השיניים (dentate gyrus) וצרו patch של תא שלם (whole cell patch). מזריקו סדרה של זרמים במצב current clamp והקליטו את תכונות הפריקה של הנוירון החדש. החילו גירוי חשמלי של פולס בודד או זוג פולסים באמצעות אלקטרודת הגירוי והקליטו את הזרמים הפוסט-סינפטיים שהו induced.אם אין תגובה פוסט-סינפטית, העבירו את אלקטרודת הגירוי למיקום אחר בשכבה המולקולרית ונסו להקליט את הזרמים הפוסט-סינפטיים שהתעוררו ממיקום הגירוי החדש. עם סיום הניסוי, השתמשו ב-clamp fit כדי למדוד את האמפליטודה של התגובות הפוסט-סינפטיות שהתעוררו מהנוירונים החדשים. איור זה מראה ביטוי GFP בנוירונים חדשים ב-dentate gyrus של עכבר בוגר 21 ימים לאחר הזרקת GFP Retrovirus.שימו לב כי ניתן להבחין בקלות בנוירונים שנולדו, וכי הן הדנדריטים והן האקסונים מסומנים באופן ברור. הדנדריטים הם הזקיפים המתרחבים מהסומה אל השכבה המולקולרית של ה-dentate gyrus, והאקסונים נראים גם ב-hilos ובאזור ה-ca three. איור זה מציג הקלטות זרם של תא שלם (whole cell current clamp) מתא גרנולר של ה-dentate שנולד 21 ימים לאחר הזרקה של רטרו-וירוס P-U-X-G-F-P בעכבר בוגר.העקבה העליונה מראה פוטנציאלי פעולה שעוררו הזרקות זרם. איור זה מציג זרמים פוסט-סינפטיים שעוררו בתא גרנולה של הנשנירה (dentate granule cell) שנולד, 21 ימים לאחר הזרקת נגיף. זאת על ידי גירוי בשכבה המולקולרית.קיומה של התגובה הפוסט-סינפטית מעיד על כך שהנוירון החדש כבר השתלב במעגלים עצביים קיימים ומקבל קלטים סינפטיים מ-ENT ממקורות שונים לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הנוירוגנזה בבגרם לבחון את השילוב התפקודי של נוירונים חדשים במוח הבוגר.

studying-the-integration-of-adult-born-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

נוירונים בוגרים שנולדו של הנורה חוש הריח יכול להיות נשלט באמצעות optogenetically Channelrhodopsin2-לבטא הזרקת lentiviral בזרם נודדות מקורי ו photostimulation כרונית עם מיניאטורי מושתל LED.

התמרה ויראלי סלקטיבי של נוירונים בוגרים יליד חוש הריח של כרוני In vivo Optogenetic גירוי

המחקר הגנטי של הדור הבא אקסון עם נוירונים בתרבית למבוגרים הגנגליון הגב שורש

מקור: Gómez-Villafuertes, R., et. al., הדמיה חיה ואחריה מעקב אחר תא בודד כדי לנטר את הביולוגיה של התא ואת התקדמות השושלת של אוכלוסיות עצביות מרובות. J. Vis. exp. (2017)} } וידאו מדגים את תהליך ההכנה, ההדמיה והמעקב אחר תאי גזע עצביים בוגרים בזמן אמת כדי לחקור התנהגויות תאיות, כולל חלוקה והתמיינות.

 הדמיה חיה ומעקב אחר תא בודד לניטור שושלת עצבית בתאי גזע עצביים בוגרים

שיטות למניפולציה והניתוח של neurogenesis בהיפוקמפוס המבוגר NF-κB תלוי מתוארות. פרוטוקול מפורט מוצג לבדיקה משוננת gyrus תלוי התנהגותי (שמכונה במבוך ההפרדה בארנס דפוס המרחבי) לחקירת תוצאה קוגניטיבית בעכברים. טכניקה זו צריכה גם לעזור לאפשר חקירות בהגדרות ניסיוניות אחרות.

שיטות לאפנון וניתוח של Neurogenesis מבוגרים NF-κB תלוי

מאמר וידאו זה מדגים פרוטוקול מקיף לאיתור וכימות של כל שלבי הנוירוגנזה של ההיפוקמפוס במבוגרים באותו קטע רקמה. פיתחנו שיטה להתגבר על המגבלות של אימונופלואורסצנציה מרובה עקיפה המתעוררת כאשר נוגדנים מתאימים ממינים מארחים שונים אינם זמינים.

אימונוהיסטוכימיה ותיוג מרובה עם נוגדנים ממיני Host אותו ללימוד למבוגרים בהיפוקמפוס נוירוגנזה

מאתגר צעיר הנוירונים באזורים במוח חדש יכול לחשוף תובנות חשובות איך הסביבה מפסל גורל עצביים ועם בגרות. פרוטוקול זה מתאר הליך כדי לקצור מבשרי interneuron מאזורים ספציפיים במוח, השתלת אותם גם homotopically או heterotopically לתוך המוח של הגורים כמחנכת.

השתלת Homochronic של סימנים מקדימים Interneuron לתוך מוח העכבר כמחנכת מוקדם

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר גישה לניתוח התנהגות של מבוגרים בתאי גזע/מחולל קדמון בתגובה לטיפול כימוגנטי של מעגל מקומי ספציפי עצביים.

Assaying בוויסות מעגל ספציפי של היפוקמאל מבוגרים תאים מקודמן עצבי

היכולת לסמן באופן קבוע תאי גזע וצאצאיהם באמצעות פלואורופור באמצעות קו עכברים מהונדס בלתי ניתן להשראה מאפשרת ניתוח מרחבי וזמני של הפעלה, התפשטות, נדידה ו/או התמיינות in vivo. מעקב אחר שושלת יכול לחשוף מידע חדש על מחויבות לשושלת, תגובה להתערבויות ורב-תחומיות.

מעקב אחר שושלת של תאי גזע בעלי תווית פלואורסצנטית אינדוקטיבית במוח העכבר הבוגר

מוצגת כאן שיטה לרצף גרעינים בודדים שבודדו מהפיתול המשונן של העכבר, שאינה כוללת את רוב תאי העצב באמצעות מיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FAN). גישה זו מייצרת פרופילי ביטוי איכותיים ומקלה על המחקר של רוב סוגי התאים האחרים המיוצגים בנישה, כולל אוכלוסיות נדירות כגון תאי גזע עצביים.

מיון שלילי של גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה של נוירונים בשילוב עם ריצוף RNA של גרעין יחיד כדי לחקור את הנישה הנוירוגנית של ההיפוקמפוס

כאן, אנו משתמשים ב- HD-MEA כדי להתעמק בדינמיקה חישובית של הרכבים עצביים בקנה מידה גדול, במיוחד בהיפוקמפוס, מעגלי פקעות ריח ורשתות נוירונים אנושיות. לכידת פעילות מרחבית-זמנית, בשילוב עם כלים חישוביים, מספקת תובנות לגבי מורכבות ההרכב העצבי. השיטה משפרת את ההבנה של תפקודי המוח, ועשויה לזהות סמנים ביולוגיים וטיפולים להפרעות נוירולוגיות.

הקלטה וניתוח של דינמיקה של אנסמבל עצבי רב-מודאלי בקנה מידה גדול במערך מיקרואלקטרודות בצפיפות גבוהה משולב CMOS

מדעי המוח המודרניים צריכים לחקור הבדלים בין מינים רבים, כולל מכרסמים במעבדה ובני אדם. עם זאת, קשיים טכניים מתעוררים כאשר מעורבים יונקים בעלי מוח גדול. גישה זו מתייחסת לשונות בין-מינים באוכלוסיות נוירונים ביונקים שונים מאוד, ומניבה תוצאות דומות למיפוי לחשיפת דפוסי אבולוציה.

גישה השוואתית למחקרי ספירת תאים כמותיים במוחות יונקים שונים מאוד

חקור שילוב תפקודי של נוירונים חדשים בדנטט גירוס באמצעות תיוג רטרו-ויראלי ורישום patch-clamp במוח עכברים בוגרים. שיטה זו מאפשרת ניתוח מדויק של התבגרות סינפטית וחיבוריות במעגלים היפוקמפיים.

שילוב של לימוד למבוגרים, יליד נוירונים

גלה סרטונים נוספים