תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור פרופיל של ביטוי מיקרו RNA ביעילות, בזול ועם חומר התחלתי מינימלי על ידי שילוב R-T-P-C-R כמותי מרובה עם פלטפורמה מיקרופלואידית. זה מתחיל בריכוז RNA שחולץ, ואחריו שעתוק הפוך מרובה והגברה מוקדמת של ריבוי. השלב הבא הוא לטהר פריימרים מוגזמים.

לבסוף, ביטוי מיקרו RNA יחיד מתוארת באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית. התוצאה היא רמות ביטוי מיקרו RNA מדויקות וניתנות לשחזור על פני דגימות מעניינות. היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות הוא ששלב הטיהור הנוסף לאחר הגברה לפני EMP משפר את הדיוק והשחזור של שיטת המולטיפלקס Q-R-T-P-C-R.

התחילו עם RNA שהופק מסרום. באמצעות ערכת טיהור RNA או שיטת RNA מבוססת פנול כלורופורם מרקמה הומוגנית כמו טריול, יש לבצע את כל העקירות בשלב שטיפה וכל האחסון נעשה במינוס 80 מעלות צלזיוס. רכז את תמיסת ה- RNA.

אם מתחילים עם כמות מוגבלת של דגימה, כגון מסרום תחילה, הכנס מאגר דגימת MicroCon לבקבוקון, ולאחר מכן הכניס את תמיסת ה-RNA למאגר, תוך הקפדה רבה לא לגעת בממברנה עם קצה הפיפטה. כעת מקם את הבקבוקון והסנן בצנטריפוגה עם רצועת הסדק לכיוון הרוטור והפעל את הצנטריפוגה למשך כשלוש שעות. לאחר שלוש שעות, ה-RNA יהיה מרוכז במלואו על הממברנה כדי לסלק את ה-RNA.

הוסף כמות רצויה של מים ללא RNA לממברנה, הפוך את המאגר והנח בבקבוקון חדש. לאחר מכן סובב במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס עם מקסימום 3000 פעמים G.Store ה-RNA המרוכז במינוס 80 מעלות צלזיוס עד הצורך לאחר ביצוע תגובת RT על ה-RNA באמצעות פריימרים של לולאת גזע הפוכה xpl, ואחריה 12 עד 18 סיבובים של מחזורי PCR. המיקרו-רנ"א מיוצגים על ידי גדילי CD NA.

זה נקרא מוצר קדם PCR. מתייחס ל-QPCR הקרוב. יש לטהר את המוצר הקדם-PCR על ג'ל פולי אקרילאמיד 10% לצד עומס סולם DNA מזווג של 10 בסיסים בכל נתיב עם 5.5 מיקרוליטר של שישה x G כתום בשילוב עם 27.5 מיקרוליטר של מוצר קדם PCR.

הפעל את הג'ל ב -150 וולט למשך 55 עד 60 דקות. רומו פנול כחול פועל על הג'ל הזה באזור 20 זוגות הבסיסים. לאחר שהג'ל נגמר, מכתימים אותו בזהב סייבר למשך 25 דקות, ללא חשיפה לאור ועל שייקר מהג'ל המוכתם.

גזרו את רצועת המוצר לפני ה-PCR מ-60 עד 80 זוגות בסיסים והעבירו את גוש הג'ל לצינורות מסומנים. אם ריכוז המוצר נמוך, יתכן שהוא לא יהיה גלוי, אך עדיין יהיה בג'ל. כעת מועכים את רצועת הג'ל באמצעות צנטריפוגה בצינור ומוסיפים 300 מיקרוליטר של מאגר TEN.

דגרו את תערובת ג'ל החיץ למשך ארבע שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה. לאחר ארבע שעות, העבירו את הנוזל לצינור חדש והוסיפו עוד 300 מיקרוליטר של מאגר TEN. דגרו את התערובת הזו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה.

למחרת, העבירו שוב את תכולת הצינור והמשיכו עם משקעי אתנול של המוצר שלפני ה-PCR. כאשר פותחים שבב מהאריזה שלו, יש להקדים אותו תוך 24 שעות ולאחר מכן לטעון אותו תוך 60 דקות מרגע ההתחלה. התחל את המערך על ידי הזרקת 150 מיקרוליטר של נוזל קו בקרה לכל אחד מהמצברים על השבב.

היזהר לא לשפוך נוזלים על השבב או הכניסות, אחרת השבב יהפוך לבלתי שמיש. לאחר מכן הנח את השבב במעגל הנוזל המשולב או בקר IFC והפעל את סקריפט ההתחלה של הבקר. ברגע שהתוכנית מתחילה, התחל להכין את הדגימות.

התחל בהכנת דגימת הקדם מיקס שילוב של איש דבק, תערובת מאסטר אוניברסלית וטעינת ריאגנטים. לאחר מכן באמצעות פורמט טעינת 96 בארות, שלב 2.25 מיקרוליטר מכל דגימה עם 2.75 מיקרוליטר של תערובת דגימת pres כדי לאסוף את הנוזל הטעון. מערבולת קצרה וצנטריפוגה מהירה של הצלחת בארבע מעלות צלזיוס.

לוחית הדגימה מוכנה כעת. כעת השתמש בצלחת חדשה של 96 בארות כדי להכין 13 x ריכוזים של תערובת הבדיקה. זה נעשה על ידי ערבוב פריימר אוניברסלי אחד, פריימר קדימה ובדיקת טק מן ספציפית לגן לכל באר.

ריכוזי ה-X האחד הם מיקרו-מולרית אחת עבור הפריימר האוניברסלי והקדמי ו-0.2 מיקרומולר עבור בדיקת ה-tac man. לאחר מכן הוסף מספיק טווין לריכוז סופי של 0.25% טווין בנפח באר סופי של חמישה מיקרוליטר. מערבבים היטב הימנעות מבועות וסובבו בקצרה את הצלחת כדי לאסוף את הנוזל.

זוהי לוחית הבדיקה. התחל את ה-96.96 Q-R-T-P-C-R על ידי טעינת השבב. תחילה טען את הדגימות ולאחר מכן את הבדיקות בנפח הסופי של חמישה מיקרוליטר לכניסה ל-IFC.

שנית, הפעל את סקריפט תערובת העומס כדי לטעון את הדגימות והבדיקות לתוך השבב. בסיום התסריט, קלף את סרט המגן מהשבב הטעון והסר חלקיקי אבק או פסולת ממשטח השבב באמצעות סרט דבק. כעת הגדר את תוכנית ההגברה של המערכת הביולוגית.

טען את השבב למערכת והפעל את התוכנית. ניתן לנתח את התוצאות באמצעות תוכנת מטבעות נוזלים כדי לספק עקומות הגברה, מפות חום של שבב שלם וערכי CT עבור כל אחד מהם. ובכן שימוש במוצרי קדם PCR, מטוהרים על ידי הפרדת גודל על ג'לים מקוריים של פולי אקרילאמיד, סוג פרא DG CR שמונה ומוטציה אפסית ER.

RNA הוכן בהשוואה לפרוטוקולים קודמים. יותר מיקרו-רנ"א ואובדן אותות חיוביים כוזבים מתרחשים הן ברקעי DGCR שמונה אפס והן ברקע אפס ER הודות לשלב הטיהור. בנוסף, גישת ה-QR TPCR R ששונתה מאפשרת סיווג נכון של שמונה RNA קטנים תלויי דיסר עצמאיים נדירים.

כאן, 48 cera ממטופלים וביקורת נבדקו לשינוי ביטוי של 384 מיקרו-רנ"א שונים. הנתונים נורמלו עבור כל דגימה על ידי הפחתת החציון המתאים וללא שימוש בספייק בבקרות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ניתן להשתמש בריבוי Q-R-T-P-C-R על פלטפורמת קו שפעת כדי לאפיין בו זמנית מאות מיקרונאז על פני דגימות רבות, גם כאשר מתחילים עם קלט מוגבל מאוד, RNA.