תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפיין ביטוי של micro RNA ביעילות, בעלות נמוכה ועם כמות מינימלית של חומר התחלתי, וזאת על ידי שילוב של multiplex quantitative R-T-P-C-R עם פלטפורמה מיקרופלואידית. התהליך מתחיל בריכוז של RNA שהופק, ולאחריו multiplex reverse transcription ו-multiplex pre amplification. השלב הבא הוא טהרה להסרת פריימרים עודפים.

לבסוף, ביטוי של micro RNA בבדיקה בודדת (singleplex) ממופה באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית. התוצאה היא רמות ביטוי מדויקות ובעלות הדירות גבוהה של micro RNA בין הדגימות הנבדקות. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא ששלב הטהרה הנוסף לאחר הגברת ה-pre-EMP משפר את הדיוק וההדירות של שיטת ה-multiplex Q-R-T-P-C-R.

התחל עם RNA שהופק מסרום. באמצעות ערכה לטיהור RNA או שיטת הפקה של RNA המבוססת על פנול-כלורופורם מרקמה הומוגניזית כגון triol, לאחר כל שלב של הפקה יש לבצע שלב שטיפה, וכל האחסון יבוצע בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. רכז את תמיסת ה-RNA.

אם מתחילים עם כמות מוגבלת של דגימה, למשל מסרום תחילה, הכניסו מאגר דגימות MicroCon לתוך מבחנה, ולאחר מכן העבירו בפיפט את תמיסת ה-RNA למאגר, תוך הקפדה יתרה לא לגעת בממברנה עם קצה הפיפט. כעת מקמו את המבחנה והמסנן בצנטריפוגה כאשר פס הסדק פונה לכיוון הרוטור, והפעילו את הצנטריפוגציה למשך כשלוש שעות. לאחר שלוש שעות, ה-RNA יתרכז במלואו על הממברנה לצורך אלוציה של ה-RNA.

הוסיפו את הכמות הרצויה של מים נטולי RNAs לממברנה, הפכו את המאגר והעבירו אותו למבחנה חדשה. לאחר מכן, סובבו בצנטריפוגה למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 4 °C במהירות מקסימלית של 3000 ×g. אחסנו את ה-RNA המרוכז בטמפרטורה של 80 °C- עד למועד השימוש. לאחר ביצוע תגובת RT ל-RNA באמצעות פרימרי xpl reverse stem loop, ולאחריה 12 עד 18 סבבי PCR, ה-microRNAs מיוצגים על ידי גדילי cDNA.

זהו תוצר ה-pre PCR, בהתייחס לבדיקת ה-QPCR העומדת להתבצע. יש לטהר את תוצר ה-pre PCR על ג'ל poly acrylamide בריכוז 10% לצד סולם DNA של 10 bp; טען כל נתיב עם 5.5 µL של orange G בריכוז six x בשילוב עם 27.5 µL של תוצר ה-pre PCR.

הריצו את הג'ל במתח של 150 volts למשך 55 עד 60 דקות. Romo phenol blue רץ על ג'ל זה באזור של 20 base pair. לאחר סיום הרצת הג'ל, צבעו אותו ב-cyber gold למשך 25 דקות, ללא חשיפה לאור ועל שייקר מהג'ל הצבוע.

גזרו את פס המוצר של ה-pre PCR בטווח של 60 עד 80 זוג בסיסים והעבירו את גוש הג'ל למבחנות מסומנות. במידה וריכוז המוצר נמוך, ייתכן שהוא לא יהיה נראה לעין, אך הוא עדיין יימצא בג'ל. כעת רסקו את פס הג'ל באמצעות סבוב של מבחנה בתוך מבחנה (tube in tube centrifugation) והוסיפו 300 µL של TEN buffer.

דגרו את תערובת ג'ל הבאפר למשך ארבע שעות ב-37 °C עם ערבוב. לאחר ארבע שעות, העבירו את הנוזל למבחנה חדשה והוסיפו 300 µL נוספים של TEN buffer. דגרו תערובת זו למשך הלילה ב-4 °C עם ערבוב.

ביום למחרת, העבירו שוב את תכולת המבחנה והמשיכו בהשקעה באתנול של תוצר ה-pre PCR. כאשר שבב נפתח מאריזתו, יש לבצע לו הטרייה (priming) בתוך 24 שעות, ולאחר מכן להטעינו בתוך 60 דקות מההטרייה. התחילו את הטריית המערך על ידי הזרקת 150 microliters של נוזל קו בקרה לכל אחד מהמצברים שבשבב.

הקפידו שלא לשפוך נוזל על השבב או על פתחי הכניסה, שכן הדבר יהפוך את השבב לבלתי שמיש. לאחר מכן, הניחו את השבב במעגל הנוזלים המשולב או בבקר ה-IFC והריצו את סקריפט ההכנה (priming) של הבקר. עם תחילת התוכנית, התחילו בהכנת הדגימות.

התחילו בהכנת תערובת דגימת ה-pres. ערבבו שילוב של tack man, universal master mix וריאגנטים לטעינה. לאחר מכן, באמצעות פורמט טעינה של 96 בארות, שלבו 2.25 µL מכל דגימה עם 2.75 µL מתערובת דגימת ה-pres כדי לאסוף את הנוזל הטעון. בצעו וורטקס קצר וצנטריפוגה מהירה של הפלטה בטמפרטורה של 4 °C.

פלטת הדגימות מוכנה כעת. כעת השתמשו בפלטת 96 בארות חדשה כדי להכין תערובת בדיקה בריכוזים של 13x. זאת על ידי ערבוב של פריימר אוניברסלי אחד, פריימר קדמי ופרוב TacMan ספציפי לגן בכל בארה.

ריכוזי ה-1X הם 1 µM עבור הפריימר האוניברסלי והפורוורד, ו-0.2 µM עבור גשושית ה-TaqMan. לאחר מכן, הוסיפו מספיק Tween לריכוז סופי של 0.25% Tween בנפח סופי של 5 µL לבאר. ערבבו היטב תוך הימנעות מהיווצרות בועות, וסובבו את הפלטה קצרות במערבל צנטריפוגי (spin) כדי לאסוף את הנוזל.

זוהי פלטת הבדיקה. התחילו את ה-96.96 Q-R-T-P-C-R על ידי טעינת השבב. טענו תחילה את הדגימות ולאחר מכן את הבדיקות, לנפח סופי של 5 µL לכל כניסה ל-IFC.

שנית, הרץ את סקריפט טעינת התערובת (load mix) כדי להטעין את הדגימות והבדיקות לשבב. עם סיום הסקריפט, קלף את סרט המגן מהשבב שהוטען והסר חלקיקי אבק או לכלוך מפני השבב באמצעות סרט דביק. כעת הגדר את תוכנית ההגברה של המערכת הביולוגית.

הטעינו את השבב למערכת והפעילו את התוכנית. ניתן לנתח את התוצאות באמצעות תוכנת fluid dime כדי לקבל עקומות הגברה, מפות חום של השבב כולו וערכי CT עבור כל באער, תוך שימוש במוצרי pre PCR, שזוהרו באמצעות הפרדה לפי גודל על ג'לי poly acrylamide טבעיים, של DG CR eight מסוג wild type ושל ER null mutant.

ה-RNA הוכן בהשוואה לפרוטוקולים קודמים. מיקרו-RNA רב יותר ואובדן של אותות חיוביים שגויים מתרחשים הן ברקע של DGCR8 null והן ברקע של ER null הודות לשלב הטיהור. בנוסף, הגישה המעודכנת של QR TPCR R מאפשרת סיווג נכון של RNA קטן נדיר התלוי ב-Dicer שאינו תלוי ב-Dgcr8.

כאן, 48 דגימות cera מחולים ומקבוצות ביקורת נסרקו כדי לבדוק שינויים בביטוי של 384 microRNAs שונים. הנתונים נורמלו עבור כל דגימה על ידי החסרת החציון המתאים וללא שימוש ב-spike בביקורות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו multiplex Q-R-T-P-C-R על פלטפורמת flu line יכול לשמש לאפיון סימולטני של מאות micronase במדגמים רבים, גם כאשר מתחילים עם כמות מוגבלת מאוד של RNA.