הערכת נכסים איתות של Ectodermal epithelia במהלך פיתוח Craniofacial
24 במרץ 2011
מאמר זה מתאר השתלת רקמות טכניקה שנועדה לבדוק את איתות ותכונות של דפוסים האאקטודרם משטח cephalic במהלך הפיתוח craniofacial.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור עוברים כימריים על ידי השתלת אקטודרמה מעוברים תורמים ללסת העליונה המתפתחת של עוברים של אפרוח. דבר זה מושג תחילה על ידי הסרת הדֶרמה של התורם לצורך השתלה, ולאחר מכן הכשרת אתר המאחס להשתלה.
השלב הסופי של הפרוצדורה הוא הנחת רקמת התורם באתר המאחס וקיבוע השתל במקומו. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות קליטה בלעדית של אקטודרמה של תורם, ובאמצעות ניתוח מולקולרי ומורפולוגי, ניתן לקבוע את התפקוד של ה-recod derm של התורם. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה של ההתפתחות, כגון זיהוי תפקידן של רקמות שונות במהלך המורפוגנזה.
את הפרוצדורה תדגים ד"ר Diane, חוקרת בכירה מהמעבדה שלנו. לפני תחילת הפרוצדורה, הכינו את המצעים וודאו שכל התמיסות הדרושות זמינות ובטמפרטורה הנכונה. לאחר מכן, תוך כדי ענידה של הגנה מתאימה לעיניים, משכו צינורות מיקרו-קפילריות לנקודה דקה מעל להבת אלכוהול.
כדי להכין סיכות זכוכית, השחילו מחטי טונגסטן על ידי החזקתם בלהבה של מבער פרופאן. התחילו בחילוץ העובר התורם מהקליפה על ידי הנחת פיסת סרט דביק מעל קצה הביצה. לאחר מכן, השתמשו בחוד של מחט דיסקציה כדי ליצור חור קטן במרכז הסרט.
החדירו מזרק של 10 מיליליטר ומחט היפודרמית במידה 18 לתוך החור, ושאבו מיליליטר אחד של אלבומין מהביצה. לאחר מכן, באמצעות מחט דיסקציה, צרו חור קטן בחלק העליון של הקליפה. הניחו פיסת סרט adhesive שנייה כדי לכסות חור זה.
בצעו פתיחה מעגלית בביצה באמצעות שני זוגות פינצטות. אחזו בעובר והעבירו אותו לכלי עם PBS קר מאוד לשטיפה. לאחר הסרת ראשו של העובר, הניחו אותו בכלי לתרבית רקמות המכיל DMEM ללא סרום בטמפרטורת החדר.
הנח את הצלחת תחת מיקרוסקופ נתיחה תוך כדי החזקת הראש בעזרת פינצטה. השתמש במספרי קפיץ כדי לבצע נתיחה גסה של הלסת העליונה וה-lagon משאר הראש. לאחר מכן, באמצעות ידית להב עם להב תער חד, גזור את התהליך הנחרי-מצחי (frontal nasal process) מהלסת העליונה.
השתמש בפ pipette כדי להעביר את ה-fronton nasal process לתוך צלחת פטרי של 30 מילימטר המכילה נפח מספיק של diss ב-PBS והדגר על קרח למשך 20 דקות. לאחר תום זמן ההדגרה, שאב את תמיסת ה-dispa מבלי להפריע לרקמה. לאחר מכן, כסה את הרקמות לחלוטין ב-DMEM המכיל 1%BSA.
כדי להפסיק את העיכול, העבירו את הרקמה לצלחת תרבית חדשה. לאחר מכן, בעבודה תחת מיקרוסקופ דיסקציה, החזיקו את הרקמה בעזרת מחט טונגסטן לא מחודדת ובעזרת מחט טונגסטן מחודדת.
הפרידו את האקטודרמה על ידי קילופה מהרקמות האחרות. לאחר ההכנה, אחסנו את רקמת השתל ב-DMEM עם BSA על קרח עד שהמארח יהיה מוכן להשתלה. באמצעות השיטה שהודגמה קודם לכן, צרו חלון בביצת התרנגולת.
הניחו את הביצה המכילה את העובר תחת מיקרוסקופ dissection באמצעות שני זוגות פינצטות. תפסו את קרום ה-IGN ואת השליה (amnion) וקרעו אותם בעדינות כדי ליצור חור ולחשוף את עובר המארח. סובבו את הראש על ידי הנחת זוג פינצטות על העין הימנית והפעלת לחץ תוך כדי החזקת הראש במצב יציב.
השתמשו בפינצטה ובמחט כדי להסיר את הדרמיס של המארח לצורך קליטת השב transplanted. הוסיפו שני µL של neutral red לפיתרי עם השתבצים המוכנים. השתמשו בפיפטה מזכוכית כדי להעביר את השב transplanted למארח.
מקם את הש Transplant במיקום להחלפת האקטודרמה שהוסרה. הכנס סיכת זכוכית בכל פינה של הרקמה המושתלת כדי לקבע את הש Transplant במקומו לאחר ההשתלה. סגור את החלון היטב באמצעות סרט דבק.
החזירו את העובר לאינקובטור עד לשלב ההתפתחות הנדרש לניתוח; תמונה זו מציגה רקמה מ-URA של גוזל ברקדן שנצבעה עם נוגדן ספציפי לברקדן נגד Q-C-P-N-A. הרקמה המושתלה ממוקמת בין שני החיצים. אין עדות לצביעת QCPN ברקמה של עכבר בכימרת עכבר-ברקדן המוצגת כאן; שוב, הרקמה המושתלה ממוקמת בין שני החיצים ב-C; ב-2, היברידיזציה עם פרובה ספציפית לרצף החוזר B2.
בבדיקת השחזור של גנים מסוג מחלקה אחת (class one genes) מתגלה כי הביטוי של sign B two מוגבל לאזור הכולל את השסתי המוצגת כאן כדמות של כימרה של אפרוח יונה, אשר נצבעה בצביעת טריכרום (trichrome). צביעת טריכרום צובעת קולגן ועצם בצבע כחול. שכפול של שלד הלסת העליונה נראה כפי שמצוין על ידי החץ. תמונה זו מציגה כימרה של אפרוח עכבר שנצבעה שוב בצביעת טריכרום.
ניתן לראות שכפול של שלד הלסת העליונה. תמונה זו מראה היברידיזציה רדיואקטיבית במעקב אחר ביטוי נורמלי של BMP 7 במזנכימה של עובר אפרוח מושתל, כאשר הרקמה המוצגת כאן היא מרקמה של כימרה של עכבר ואפרוח. ניתן לראות כי ביטוי BMP 7 השרה במזנכימה הסמוכה להשתלה, כפי שמוצג על ידי החץ.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע מניפולציות בעוברי אפרוח כדי להעריך מנגנונים המווסתים את התפתחות התהליכים המצחיים והנחריים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקה להשתלת רקמה שמטרתה יצירת עוברים כימריים כדי לחקור את תכונות האיתות והדפוס של האקטודרמה צפירית שטחית במהלך ההתפתחות הקרניו-פציאלית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה התפתחותית
- התפתחות קרניו-פציאלית
- הנדסת רקמות
רקע
- המחקר מתמקד בתפקידו של האקטודרם במורפוגנזה קרניו-פציאלית.
- הבנת אינטראקציות בין רקמות היא קריטית לביולוגיה התפתחותית.
- עוברי כימרה מספקים תובנות לגבי תפקוד רקמות והתפתחותן.
- טכניקה זו יכולה לסייע בזיהוי התרומה של רקמות שונות במהלך ההתפתחות.
מטרת המחקר
- לבחינת תכונות האיתות של אקטודרמה צפלית שטחית.
- לניתוח השפעות הדפוס של האקטודרמה במהלך התפתחות הפנים והגולגולת.
- לבחינת תפקידה של אקטודרמה תורמת בהתפתחות רקמת המארח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השתלה של אקטודרם מעוברי תורם לעוברי אפרוח.
- הכנת אתר המארח להשתלה.
- מיקום וקיבוע של רקמת התורם באתר המארח.
- ניתוח מולקולרי ומורפולוגי של הרקמה המשתלת.
תוצאות עיקריות
- נצפתה השתרה מוצלחת של אקטודרמה מתורם.
- ניתוח מולקולרי חשף את התפקיד הפונקציונלי של האקטודרמה מהתורם.
- התוצאות תורמות להבנת אינטראקציות בין רקמות במהלך ההתפתחות.
- הממצאים מספקים תובנות לגבי המנגנונים של מורפוגנזה קרניו-פציאלית.
מסקנות
- טכניקת ההשתלה יעילה לחקר תפקוד האקטודרמה.
- התוצאות מרחיבות את הידע על תהליכי התפתחות הפנים והגולגולת.
- ניתן ליישם שיטה זו להמשך חקירה של שאלות בביולוגיה של ההתפתחות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת בירור מכניסטי של סיגנל תאי ברקמות במהלך מורפוגנזה קרניו-פציאלית (של הפנים והגולגולת), ובכך היא תומכת בתיקוף מטרות במסלולי התפתחות. באמצעות הקמת מודלים כימריים, חוקרים יכולים להעריך תכונות סיגנל שמקורן באקטודרמה, הרלוונטיות למנגנונים של הפרעות מולדות. גישה זו מספקת מערכת הרלוונטית למחלה לצורך הפחתת סיכונים (de-risking) של היפותזות הנוגעות לאינטראקציות אפיתליאליות-מזנכימליות בשלבי התפתחות מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן תכונות סיגנלינג של אקטודרמה תורמת כדי להבהיר מנגנונים מולקולריים בהתפתחות הפנים.
- ערך תפעולי: משתמש בסמני גרעינון או אלמנטים חוזרים כדי להבדיל בין רקמות המארח לתורם לצורך מעקב שושלת לא משתמע לשני פשרויות.
- ערך מדעי: מאפשר הערכה פונקציונלית של אקטודרמה מעוברי מוטציה כדי לקשר בין הגנוטיפ לתוצאות של דפוס הפנוטיפ.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לצורך אנליזה מולקולרית ומורפולוגית של השראה של אותות (signaling induction) בשלבים הבאים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של מיקום והצמדת השתל כדי להבטיח השתרה (engraftment) הניתנת לשחזור בתנאים ניסיוניים שונים.
- ערך מדעי: תמיכה במדדים כמותיים, כגון ביטוי של BMP7 במזנכימה סמוכה, למדידת הפעלת המסלול.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: ביסוס מערכת רלוונטית למחלה באמצעות אקטודרמה של עכבר למידול פנוטיפים של מוטציות קרניו-פציאליות אנושיות.
- ערך תפעולי: מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי בדיקת אינטראקציות רקמה במודל של עובר חולייתנים.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד תפקוד האקטודרמה בתבניית שכפול של שלד הלסת העליונה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה מתאימה לתהליכי עבודה בשלבי גילוי מוקדמים, שבהם בדיקות השתלת רקמות מבהירות היררכיות של אות (signaling) לפני תיעודו של יעד בעדיפות גבוהה במסלולים קראניופציאליים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי שיוטח של האקטודרמה בפיתוח התהליך הפרונטו-נזאלי באמצעות יצירת עוברי כימרה.
- סריקה: מתאר את המוכנות של הבדיקה באמצעות הכנה סטנדרטית של אתר המארח ומיקום השתל לקבלת תוצאות מולקולריות עקביות.
- אנליטיקה: מדגיש ניתוח מולקולרי (למשל, in situ hybridization, צביעה אימונוהיסטוכימית) והערכה מורפולוגית (למשל, צביעת טריכרום) להערכת תוצאות השיוטח.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות לבדיקת אקטודרמה של עכברים מוטנטיים במארחי אפרוחים לצורך מידול של וריאנטים התפתחותיים אנושיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את פלטפורמת הכימרה כיכולת הניתנת לשימוש חוזר לבדיקת רקמות תורם מרובות או וריאנטים גנטיים במחקרי שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות הערכה ישירה של סיגנלינג מושרה-אקטודרמה ברקמות המארח.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות שלבי השתלה מוגדרים וסממנים ספציפיים לרקמה להבחנה בין התורם למארח.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשכת התהליך (go/no-go) על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במסלולי סיגנלינג אפיתליאליים-מזנכימליים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מטרות מותאם סיכון המבוסס על סיגנלינג אקטודרמלי מאושש במודלים של מורפוגנזה קרניו-פציאלית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה עוברית, טיפול ברקמות ותרביות של עוברים כימריים.
- דרישות הציוד כוללות מיקרוסקופ דיסקציה, כלי מיקרו-קפילריה ומערכת לתרבית רקמות למניפולציה של עוברים.
- סטנדרטיזציה בין צוותים מחייבת שלבים עקביים של המארח, הערכת חיוניות השתו Transplant והסכמי פרוטוקול לניתוח מולקולרי.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודל כוללים אופטימיזציה של זמני עיכול ומצעי תרבית עבור מיני תורמים שונים (סלוק, עכבר).
- מגבלות מעשיות כוללות חלונות חיוניות של השתו Transplant ושיעורי הישרדות של עובר המארח לאחר השתלה, כפי שצוין במגבלות התזמון של הפרוצדורה.
