הערכת נכסים איתות של Ectodermal epithelia במהלך פיתוח Craniofacial
March 24th, 2011
מאמר זה מתאר השתלת רקמות טכניקה שנועדה לבדוק את איתות ותכונות של דפוסים האאקטודרם משטח cephalic במהלך הפיתוח craniofacial.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור עוברים כימריים על ידי השתלת אקטודרם מעוברי תורם ללסת העליונה המתפתחת של עוברי אפרוחים. זה מושג על ידי הסרת העור התורם להשתלה. ואז האתר המארח מוכן לחריטה.
השלב האחרון של ההליך הוא למקם את רקמת התורם באתר המארח ולהצמיד את השתל למקומו. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות השתלה בלעדית של אקטודרם תורם, ובאמצעות ניתוח מולקולרי ומורפולוגי ניתן לקבוע את תפקודו של עור התורם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית, כגון זיהוי תפקידן של רקמות שונות במהלך מורפוגנזה.
מישתדגים את ההליך תהיה ד"ר דיאן, שהיא חוקרת בכירה מהמעבדה שלנו. לפני שתתחיל בהליך זה, הכן מדיה וודא שכל הפתרונות הנדרשים נגישים ובטמפרטורה הנכונה. לאחר מכן, תוך כדי לבישת מגן עיניים נאות, משוך צינורות מיקרו נימי לנקודה עדינה מעל להבת אלכוהול.
להכנת סיכות זכוכית יש לחדד מחטי טונגסטן על ידי החזקתן בלהבה של לפיד פרופאן. התחל במיצוי העובר התורם מהקליפה על ידי הנחת פיסת סרט על קצה הביצית. לאחר מכן מעטפת השתמש בקצה של מחט חיתוך כדי ליצור חור קטן במרכז הסרט.
הכנס מזרק של 10 מיליליטר ומחט היפודרמית בגודל 18 לתוך החור, והסר מיליליטר אחד של אלבומין מהביצה. ואז בעזרת מחט דיסקציה, צרו חור קטן בחלק העליון של הקליפה. הניחו פיסת סרט שנייה כדי לכסות את החור הזה.
חותכים פתח עגול בביצה בעזרת שני זוגות מלקחיים. תפסו את העובר והניחו אותו בכלי PBS קר כקרח לשטיפה. לאחר הסרת ראש העובר, הנח אותו בצלחת תרבית רקמה המכילה DMEM בטמפרטורת החדר, ללא סרום.
הניחו את המנה מתחת למיקרוסקופ החיתוך תוך כדי החזקת הראש בעזרת מלקחיים. השתמש במספריים קפיציים כדי לנתח את הלסת העליונה והלגון משאר הראש. לאחר מכן בעזרת מחזיק להב עם סכין גילוח חד, חתוך את תהליך האף הקדמי מהלסת העליונה.
השתמש בפיפטה כדי להעביר את תהליך האף הפרונטון לצלחת פטרי בגודל 30 מילימטר המכילה נפח מספיק של דיס ב-PBS ולדגור על קרח למשך 20 דקות. לאחר שחלף זמן הדגירה, שאפו את תמיסת הדיספה מבלי להפריע לרקמה. לאחר מכן יש לכסות לחלוטין את הרקמות ב-DMEM המכיל 1% BSA.
כדי לעצור את העיכול, העבירו את הרקמה לכלי תרבית חדש. ואז עובד תחת מיקרוסקופ מנתח. החזק את הרקמה עם מחט טונגסטן לא מושחזת באמצעות מחט טונגסטן מושחזת.
הפרד את האקטודרם על ידי קילופו הרחק מהרקמות האחרות. לאחר ההכנה, אחסן את רקמת השתל ב-DMEM עם BSA על קרח עד שהמארח מוכן להשתלה. בשיטה שהודגמה קודם לכן, צור חלון בביצת התרנגולת.
מניחים את הביצה המכילה את העובר מתחת למיקרוסקופ החיתוך באמצעות שני זוגות מלקחיים. אחוז בקרום ה-IGN ובמי השפיר וקרע בעדינות כדי ליצור חור ולחשוף את העובר המארח. סובב את הראש על ידי הנחת זוג מלקחיים על עין ימין והפעלת לחץ תוך החזקת הראש יציב.
השתמש בלשונות ובמחט כדי להסיר את העור המארח כדי להכיל את השתל. הוסף שני מיקרוליטרים של אדום ניטרלי לצלחת הפטרי המכילה את השתלים המוכנים. השתמש בפיפטה מזכוכית כדי להעביר את השתל למארח.
הנח את השתל במקומו כדי להחליף את האקטודרם שהוסר. הכנס סיכת זכוכית בכל פינה של הרקמה המושתלת כדי להצמיד את השתל למקומו לאחר ההשתלה. סגור את החלון בחוזקה בעזרת סרט.
החזר את העובר לאינקובטור עד לשלב ההתפתחות הנדרש לניתוח, תמונה זו מציגה רקמה מ-URA של גוזל שליו שהוכתמה בנוגדנים ספציפיים לשליו נגד Q-C-P-N-A. הרקמה המושתלת ממוקמת בין שני החצים. אין עדות לצביעת QCPN ברקמה מסוג meen ממראה פעמון אפרוח עכבר נראית כאן שוב, הרקמה המושתלת ממוקמת בין שני החצים ב-C שתי הכלאה עם אישור ספציפי לסימן B שני רצף חוזר.
בשיקוף מחלקה ראשונה, גנים מגלים כי ביטוי של סימן B 2 מוגבל לחלק המורכב מהשתל המוצג כאן כתמונה של מראה פעמון אפרוח שליו שנצבעה בטריכרום, צביעת טריכרום הופכת את הקולגן והעצם לכחולים בצבע. שכפול שלד הלסת העליונה נראה כפי שמצוין על ידי החץ. תמונה זו מציגה מראה פעמון של אפרוח עכבר שהוכתמה שוב בטריכרום.
נראה שכפול של שלד הלסת העליונה. תמונה זו מציגה רדיואקטיבי ב-C שתי הכלאות של ביטוי BMP רגיל שבע במצ'י של עובר אפרוח רפסוד המוצג כאן הוא רקמה ממראה פעמון אפרוח עכבר. ניתן לראות כי ביטוי BMP 7 מושרה במכיון הסמוך לשתל כפי שמצוין על ידי החץ.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתפעל עוברי אפרוחים כדי להעריך מנגנונים המווסתים את התפתחות התהליך הקדמי והאף.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקת השתלת רקמות שמטרתה יצירת עוברים כימריים כדי לחקור את תכונות האיתות והדפוס של האקטודרם הקפלי העילי במהלך התפתחות גולגולת-פנים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביולוגיה התפתחותית
- התפתחות גולגולת-פנים
- הנדסת רקמות
רקע
- המחקר מתמקד בתפקיד האקטודרם במורפוגנזה של גולגולת-פנים.
- הבנת אינטראקציות רקמות חיונית לביולוגיה התפתחותית.
- עובריים כימריים מספקים תובנות לגבי תפקוד רקמות והתפתחות.
- טכניקה זו יכולה לעזור לזהות את התרומות של רקמות שונות במהלך ההתפתחות.
מטרת המחקר
- לבדוק את תכונות האיתות של האקטודרם הקפלי העילי.
- לנתח את השפעות הדפוס של האקטודרם במהלך התפתחות גולגולת-פנים.
- לחקור את תפקיד האקטודרם התורם בהתפתחות הרקמות המארחות.
שיטות ששימשו
- השתלת אקטודרם מעובר תורם לעובר תרנגולת.
- הכנת אתר המארח להשתלה.
- מיקום והצמדה של רקמת התורם לאתר המארח.
- ניתוח מולקולרי ומורפולוגי של הרקמה המושתלת.
תוצאות עיקריות
- נצפתה השתלה מוצלחת של האקטודרם התורם.
- ניתוח מולקולרי חשף את התפקיד הפונקציונלי של האקטודרם התורם.
- התוצאות תורמות להבנת האינטראקציות בין הרקמות במהלך ההתפתחות.
- הממצאים מספקים תובנות לגבי מנגנוני המורפוגנזה של גולגולת-פנים.
מסקנות
- טכניקת ההשתלה יעילה לחקר תפקוד האקטודרם.
- התוצאות משפרות את הידע על תהליכי ההתפתחות של גולגולת-פנים.
- שיטה זו יכולה לשמש לחקירה נוספת של שאלות בביולוגיה התפתחותית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables mechanistic interrogation of tissue signaling in craniofacial morphogenesis, supporting target validation in developmental pathways. By establishing chimeric models, researchers can assess ectoderm-derived signaling properties relevant to congenital disorder mechanisms. The approach provides a disease-relevant system for de-risking hypotheses about epithelial-mesenchymal interactions in early development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Tests signaling properties of donor ectoderm to clarify molecular mechanisms in facial development.
- Operational Value: Uses nucleolar or repetitive element markers to distinguish host and donor tissues for unambiguous lineage tracing.
- Scientific Value: Enables functional assessment of ectoderm from mutant embryos to link genotype to phenotypic patterning outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream molecular and morphological analysis of signaling induction.
- Operational Value: Standardizes graft placement and affixation to ensure reproducible engraftment across experimental conditions.
- Scientific Value: Supports quantitative readouts such as BMP7 expression in adjacent mesenchyme to measure pathway activation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Establishes disease-relevant system using mouse ectoderm to model human craniofacial mutant phenotypes.
- Operational Value: Enables continuity from discovery through preclinical validation by testing tissue interactions in a vertebrate embryo model.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by isolating ectoderm function in patterning upper jaw skeleton duplication.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where tissue transplantation assays clarify signaling hierarchies before target prioritization in craniofacial pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of ectoderm signaling in frontonasal process development through chimeric embryo generation.
- Screening: Describes assay readiness via standardized host site preparation and graft positioning for consistent molecular readouts.
- Analytics: Highlights molecular analysis (e.g., in situ hybridization, immunostaining) and morphological scoring (e.g., trichrome staining) to evaluate signaling outcomes.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling testing of mutant mouse ectoderm in chick hosts to model human developmental variants.
- Enterprise Reuse: frames the chimera platform as a reusable capability for testing multiple donor tissues or genetic variants across studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct assessment of ectoderm-induced signaling in host tissues.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined transplantation steps and tissue-specific markers for donor-host discrimination.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in epithelial-mesenchymal signaling pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on validated ectoderm signaling in craniofacial morphogenesis models.
Implementation Considerations
- Required expertise in embryonic dissection, tissue handling, and chimeric embryo culture.
- Instrumentation needs include dissecting microscope, microcapillary tools, and tissue culture setup for embryo manipulation.
- Cross-team standardization requires consistent host staging, graft viability assessment, and molecular analysis protocols.
- Adaptation considerations across model systems involve optimizing digestion times and culture media for different donor species (quail, mouse).
- Practical limitations include graft viability windows and host embryo survival rates post-transplantation, as noted in procedural timing constraints.
