Name: פוליאתילן גליקול יעיל (PEG) מתווכת טרנספורמציה של מוס Physcomitrella patens /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: למדו שיטה יעילה להנדסה גנטית בצמחים באמצעות טרנספורמציית פרוטופלסטים של Physcomitrella patens עם פוליאתילן גליקול. הפרוטוקול מאפשר ביטוי עקבי של חלבונים פלואורסצנטיים ותומך בניסויים כמו RNAi זמני ונוקאאוט גני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LV נתמך על ידי ה-NSF (IOS 1002837)

1. ביצוע Protoplasts <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9 מ"ל של 8% מניטול כדי בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מרית, את האזוב בן 7 יום 2-3 PPNH4 צלחות של 5 - ב mannitol את צלחת פטרי המכילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ"ל של Driselase 2% (Sigma D9515-25 גרם) כדי בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת פטרי בטמפרטורת החדר עם עדין רועדת במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה protoplast באמצעות רשת של 100 מיקרומטר (BD פלקון 352,350). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ההשעיה מסוננים על 250 גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את protoplasts בעדינות עם μL 500 mannitol של 8%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9.5 מ"ל mannitol 8% בצינור תרבות. ודא protoplasts תלויים לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על סינון מחדש ההשעיה צעדים (1.6, 1.7 ו -1.8) פעמיים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 10 μL הפתרון protoplast ולספור את protoplasts ב hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל את מספר protoplast באזור 16 מרובע על ידי 10,000 להשיג את מספר protoplasts לכל מ"ל (ראו תרשים 1). </li></ol> 2. טרנספורמציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ההשעיה protoplast ב 250 גר 'במשך 5 דקות. הסר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות protoplasts בפתרון MMg בריכוז של 1.6 מיליון protoplasts / mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על השעיית protoplast בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 600 μL ההשעיה protoplast לתוך צינור תרבות המכיל 60 מיקרוגרם DNA. מערבולת הצינור בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 700 μL של פתרון PEG / Ca לתוך תערובת protoplast / הדנ"א. מערבולת הצינור בעדינות עד לקבלת תערובת הומוגנית כולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו המתנה, לכסות פ.ר.מ.-B צלחות עם צלופן (80 עיגולים בקוטר מ"מ, א.א. אריזות בע"מ, בריטניה); לאפשר צלופן כדי מימה על פני צלחת דקות לפחות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מרית, להסיר בועות אוויר שנלכדו בין צלופן ואת צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התערובת עם 3 מ"ל של תמיסת W5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין את התערובת על 250 גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות protoplasts ב 2 מ"ל נמס של פ.ר.מ.-T (לפני הוספתו protoplasts הפתרון הזה אפשר לשמור נוזלי 42 ° C). צלחת של 1 מ"ל מחדש להשעות protoplasts לכל צלחת פ.ר.מ.-B מכוסה בצלופן. לעטוף את הצלחות עם micropore (3M, בריאות). שמור על צלחות של 25 מעלות צלזיוס בתא הגידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, ניתן protoplasts מחדש תלויה מ"ל 1 של המדיום ציפוי נוזלי מ"ל מצופה 0.5 בצלחת פ.ר.מ.-B מכוסה בצלופן. זה מאפשר התחדשות מהירה, אך מספר צמחים התחדשות נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא צמיחה מוגדר עבור 16 שעות. אור 8 שעות. מחזור כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הצלופן על הצלחת מבחר טרי 4 ימים לאחר השינוי. </li></ol> 3. נציג תוצאות: דוגמה לשינוי מוצג באיור 2. ה-DNA נעשה שימוש בדוגמה זו היתה supercoiled 7.8 kb פלסמיד שנשא קלטת עמידים hygromycin. כמות protoplasts מצופה הופחת ל -50% עבור הצילום. התמונות צולמו כשבועיים לאחר הצמחים הועברו צלחות הבחירה. יעילות השינוי אינו מושפע ריכוז ה-DNA של עד 60 מיקרוגרם. ריכוזים גבוהים יותר של ה-DNA משפיעים לרעה על יעילות הטרנספורמציה. הנתונים הראו כי שיטה זו מספקת תוצאה עקבית לאורך טווח רחב של כמות ה-DNA. שיטה זו יכולה גם ליצור transformants יציב ביעילות כפי שמוצג בטבלה 1, אנו יכולים לקבל על 4 transformants יציב לכל מיקרוגרם של ה-DNA לינארית, אשר הוא הרבה יותר גבוה ממה שדווח קודם לכן 14. כמו כן, אנו נבחן את ההשפעה של הלם החום על יעילות הטרנספורמציה ידי הפיכת פלסמיד supercoiled נושאת גן חלבון פלואורסצנטי כסמן. הלם החום בוצע 10 דקות לאחר הדגרה בטמפרטורת החדר (בתוך שלב 2.6) על ידי דוגרים את התערובת באמבט מים C ° 45 במשך 3 דקות. התערובת הודגר בתוך אמבט מים בטמפרטורת החדר מיד לאחר הלם החום 17 דקות. תוצאות נרשמו 22 שעות לאחר השינוי. יחס transformants שהושגו עם או בלי הלם החום היו דומים מאוד (~ 25%), אך ראינו השפעה שלילית של הלם החום על הכדאיות של protoplasts (מידע לא מוצג). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. מבט protoplasts ב hemocytometer. החלק הדרוש ספירת protoplast הוא הצביע על ידי ריבוע אדום. הערה 16 ​​ריבועים נדרש לספור protoplasts (ראה 1.11); התמונה מראה ספירה של 24 protoplasts (240,000 תאים / מ"ל). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. תמונות של 18 יום transformants בן חלוף. Protoplasts היו טרנסנוצר עם כמות המצוין של פלסמיד supercoiled. ת: 15μg; B: 30μg: C: 60μg; D: 120μg. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> כמות ה-DNA (מיקרוגרם) </td><td> יעילות (tranformants / DNA מיקרוגרם) </td></tr><tr><td> 15, supercoiled פלסמיד </td><td> 120 ± 24 </td></tr><tr><td> 30, supercoiled פלסמיד </td><td> 145 ± 54 </td></tr><tr><td> 60, supercoiled פלסמיד </td><td> 121 ± 60 </td></tr><tr><td> 120, supercoiled פלסמיד </td><td> 71 ± 38 </td></tr><tr><td> 60, לינארית פלסמיד </td><td> 4 ± 1 </td></tr></tbody></table> 1. טבלת טרנספורמציה יעילות בסכומים DNA שונים.

<ol><li>Abel, S., Theologis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+Arabidopsis+leaf+protoplasts%3A+a+versatile+experimental+system+to+study+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression.</a> Plant J. 5, 421-427 (1994).</li>
<li>Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bryophytes+as+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bryologist%22%5BJournal%5D)">Bryophytes as model systems.</a> Bryologist. 103, 128-133 (2000).</li>
<li>Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant J. 11, 1195-1206 (1997).</li>
<li>Schaefer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in Physcomitrella patens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).</li>
<li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).</li>
<li>Cove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The moss Physcomitrella patens.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).</li>
<li>Kamisugi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%3A+homologous+recombination%2C+concatenation+and+multiple+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration.</a> Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formin-mediated+actin-filament+elongation+is+essential+for+polarized+plant+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).</li>
<li>Sawahel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+DNA+into+Physcomitrella+protonemal+tissue+by+using+the+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun.</a> Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).</li>
<li>Schaefer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transformation+of+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Stable transformation of the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).</li>
<li>Cho, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+bombardment+mediated+transformation+and+GFP+expression+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).</li>
<li>Ashton, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bryophyte+Physcomitrella+patens+replicates+extrachromosomal+transgenic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements.</a> New Phytol. 146, 391-402 (2000).</li>
<li>Hohe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+and+highly+standardized+transformation+procedure+allows+efficient+production+of+single+and+multiple+targeted+gene-knockouts+in+a+moss%2C+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens.</a> Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+is+essential+for+tip+growth+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המוצגת כאן מאפשרת שינוי ה-DNA פשוטה ועקבית לתוך protoplasts Physcomitrella patens. שיטה זו פותחה במקור עבור ארבידופסיס 1, אבל כאן הוכיחה כי היא מבצעת היטב עם protoplasts של Physcomitrella patens, צמח פשוט שונה. לכן, בשיטה זו ניתן להחיל על מיני צמחים אחרים עם שינויים קלים. שינויים אפשריים אופטימיזציה כוללים ריכוז protoplast ב MMg, זמן הדגירה בפתרון MMg PEG ו / Ca. אנו בוחרים להשתמש DNA 60 מיקרוגרם בניסויים שגרתית שלנו, כי מספר transformants מגדילה באופן ליניארי עם ריכוז ה-DNA עד לנקודה זו (טבלה 1). אנחנו יכולים לקבל כ 7000 transformants חולף או 200 transformants יציב על מהפך 60 מיקרוגרם אחד DNA, המאפשר הקרנת ניתוח נוסף של אוכלוסייה גדולה של צמחים. Protoplasts טרנספורמציה יכול להיות או להפיץ בינוני עם ציפוי נוזלי או פ.ר.מ.-T. למרות היעילות התחדשות נמוך כאשר בינוני ציפוי נוזלי משמש, אנו בוחרים בשיטה זו כאשר protoplasts הפכו עם פלסמידים supercoiled. ככל הראה בטבלה 1, טרנספורמציות לעשות עם ה-DNA פלסמיד supercoiled ליצור transformants רבים יותר וכך, אנחנו עדיין יכולים להשיג מספר גדול של צמחים עם בינוני ציפוי נוזלי. יתר על כן, הפצת protoplasts בינוני עם ציפוי נוזלי מאפשר התחדשות מהירה, וזה חשוב עבור ניסויים הקשורים פנוטיפים חולף, כמו RNAi להפיל ניסויים 9,15. בנוסף העדר אגר העליון מאפשר בידוד צמח קל immunostaining ו RT-PCR 9,15.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> מרכיב </td></tr><tr><td> PPNH 4 </td><td> 1.84 mM KH 2 PO 4 3.4 mM Ca (NO 3) 2 1 mM MgSO 4 2.72 Diammonium mM tartrate 54 מיקרומטר FeSO 4 0.7 H 2 O 9.93 מיקרומטר H 3 BO 3 1.97 מיקרומטר MnCl 0.4 2 H 2 O 0.23 מיקרומטר CoCl 0.6 2 H 2 O 0.19 מיקרומטר ZnSO 4. 7H 2 O 0.22 מיקרומטר CuSO 4. 5H 2 O 0.10 מיקרומטר Na 2 מו 4 .2 H 2 O 0.168 מיקרומטר KI הוסף אגר 0.7% עבור בינוני מוצק. </td></tr><tr><td> פ.ר.מ.-B </td><td> PPNH 4 עם mannitol 6% ו 0.8% אגר. הוסף 10 מ&quot;ל 1M CaCl 2-1 L לפני שמזג צלחות. </td></tr><tr><td> פ.ר.מ.-T </td><td> PPNH 4 עם mannitol 6% ו -0.6% אגר. הוסף 0.5 מ&quot;ל 1M CaCl 2-50 מ&quot;ל לפני השימוש. </td></tr><tr><td> ציפוי נוזלי בינוני </td><td> PPNH 4 עם mannitol 8.5% ללא אגר. הוסף 0.5 מ&quot;ל 1M CaCl 2-50 מ&quot;ל לפני השימוש. </td></tr><tr><td> 2% Driselase </td><td> הוסף 4 גרם של Driselase (Sigma D9515-25 גרם) עד 200 מ&quot;ל של מניטול 8%. מערבבים בעדינות למשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר, דגירה 30 דקות. ב 4 ° C, ומערבבים בעדינות במשך 5 דקות. בטמפרטורת החדר. ספין 2,500 גרם ל 10 דקות, להשליך גלולה. מסנן עם 0.22 מיקרומטר, ולאחסן קפוא כמו aliquots 10 מ&quot;ל. להפשיר בתוך אמבט מים בטמפרטורת החדר לפני השימוש. </td></tr><tr><td> MMg </td><td> 0.4 מ &#39;mannitol 15 מ&quot;מ MgCl 2 4 מ&quot;מ MES (pH 5.7) </td></tr><tr><td> PEG / Ca </td><td> 4 גרם PEG4000 3 מ&quot;ל H 2 O 2.5 מ&quot;ל 0.8 M mannitol 1 מ&quot;ל 1M CaCl 2 </td></tr><tr><td> W5 </td><td> 154 mM NaCl 125 mM CaCl 2 5 מ&quot;מ KCl 2 מ&quot;מ MES (pH 5.7) </td></tr></tbody></table>

פוליאתילן גליקול יעיל (peg) מתווכת טרנספורמציה של מוס physcomitrella patens</em

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

<p class="jove_content"&gt; שיטה פשוטה ויעילה להפוך<em&gt; Physcomitrella pantens</em&gt; Protoplasts מתואר. שיטה זו מותאמת פרוטוקולים<em&gt; Physocmitrella</em&gt; Protonemal protoplast ו<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; Protoplast mesophyll שינוי<sup&gt; 1</sup&gt;. בשל יכולתו לעבור mitotic יעיל הומולוגיים רקומבינציה<em&gt;, Physcomitrella patens</em&gt; התפתחה כמערכת מודל חשוב בשנים האחרונות<sup&gt; 2</sup&gt;. יכולת זו מאפשרת תדרים גבוהים של גן מיקוד<sup&gt; 3-9</sup&gt;, אשר לא בא לידי ביטוי במודל צמחים אחרים כגון<em&gt; ארבידופסיס</em&gt;. כדי לנצל את מלוא היתרונות של מערכת זו, אנו צריכים שיטה יעילה וקלה להעביר דנ&quot;א לתוך התאים אזוב. הדרכים הנפוצות ביותר להפוך את זה אזוב הם הפצצה החלקיקים<sup&gt; 10</sup&gt; ו - PEG בתיווך DNA ספיגת<sup&gt; 11</sup&gt;. למרות ההפצצות החלקיקים יכול לייצר שינוי יעילות גבוהה<sup&gt; 12</sup&gt;, אקדחים הגן אינם זמינים למעבדות רבות הפרוטוקול קשה לתקנן. מצד שני, השינוי PEG בתיווך אינה דורשת ציוד מיוחד, והוא יכול להתבצע במעבדה כלשהי עם ברדס סטרילית. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור שינוי של protoplasts אזוב. שיטה זו יכולה לייצר יותר מ 120 transformants חולף לכל מיקרוגרם של ה-DNA, אשר מהווה שיפור של פרוטוקול היעילה ביותר שדווח קודם לכן<sup&gt; 13</sup&gt;. בשל יעילותה, פשטות, שחזור, שיטה זו ניתן ליישם פרויקטים הדורשים מספר רב של transformants כמו גם שינוי השגרה.</p

שיטה פשוטה ויעילה להפוך<em&gt; Physcomitrella pantens</em&gt; Protoplasts מתואר. שיטה זו מותאמת פרוטוקולים<em&gt; Physocmitrella</em&gt; Protonemal protoplast ו<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; Protoplast mesophyll שינוי<sup&gt; 1</sup&gt;.

פוליאתילן גליקול יעיל (PEG) מתווכת טרנספורמציה של מוס Physcomitrella patens</em

מתוארה כאן שיטה פשוטה ויעילה לטרנספורמציה של פרוטופלסטים של Physcomitrella patens. שיטה זו מותאמת מפרוטוקולים עבור Physcomitrella...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע טרנספורמציה של פרוטופלסטים של SCO Metre. הדבר מושג תחילה על ידי עיכול הצמחים באמצעות Drizly. לאחר מכן, הפרוטופלסטים נשטפים עם mannitol כדי להסיר את ה-drizly, ואז מדגירים אותם עם DNA ו-peg.לבסוף, הפרוטופלסטים שעברו טרנספורמציה נפרסים על צלחות ועוברים אינקובציה. לבסוף, ניתן לקבל תוצאות המראות פרוטופלסטים שעברו טרנספורמציה ומבטאים חלבונים המסומנים פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. את הפרוצדורה תדגים Y lu, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא יעילה ומייצרת בעקביות פרוטופלסטים המבטאים את החלבון המבוקש. כדי לבודד פרוטופלסטים של אזוב, התחילו בהוספת תשעה מיליליטרים של 8% mannitol לפיתרי, באמצעות שפתולה. העבירו אזוב בן חמישה עד שבעה ימים משתי עד שלוש צלחות PP NH 4 אל תוך ה-mannitol. אנא עיינו בפרוטוקול הכתוב המצורף עבור שלב זה ועבור מתכוני ריאגנטים נוספים. לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטרים של 2% drizly והדגרימו בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין למשך שעה אחת.סננו את התערובת דרך רשת של 100 micron כדי לקבל סספנסיה ירוקה הומוגנית. לאחר מכן, סובבו את התסנן במהירות של 250 G למשך חמש דקות. השליכו את הנוזל העילי בזהירות רבה.שחזר את הפרוטופלסטים ב-500 microliters של 8%mannitol. לאחר מכן, הוסף 9.5 milliliters נוספים של 8%mannitol. ודא שהפרוטופלסטים תלוים באופן מלא בתמיסה.בצעו את שלבי השטיפה פעמיים נוספות על ידי סבב צנטריפוגה נוסף של התמיסה ב-250 G למשך חמש דקות. השליכו את העלייה (supernatant) והשביו את הפרוטופלסטים. ראשית ב-500 microliters.לאחר מכן, יש להוסיף 9.5 milliliters של 8% mannitol ולהשתמש ב-hemo cytometer. ספרו את מספר הפרוטופלסטים ב-10 microliters של התרחוף כדי להעביר DNA אל הפרוטופלסטים המבודדים. ראשית, סובבו את תערובת הפרוטופלסטים ב-250 G למשך חמש דקות.הסיר את הנוזל העליון וסספנד מחדש את הפרוטופלסטים בריכוז של 1.6 מיליון למילילטר בתמיסת MMG. הדגר את התמיה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר מכן, הוסף 600 מיקרוליטר של תמיסת הפרוטופלסטים למבחנה המכילה 60 מיקרוגרם של DNA. נער.הוסיפו בעדינות 700 µL של תמיסת PEG סידן ונערבבו. דגרו היטב את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות במהלך תקופת המתנה זו. כסו את פלטות ה-PRMB בניילון נצמד.לאחר מכן, יש לדלל את התרחיף עם שלושה מיליליטרים של תמיסת W five ולסובב ב-250 G למשך חמש דקות. כדי להסיר את ה-PEG, יש לערבב מחדש את הפרוטופלסטים בשני מיליליטרים של PRMT ולהעביר מילליטר אחד לכל לוח PRMB המכוסה בסלופן. יש לשמור את הלוחות בטמפרטורה של 25 °C בתא גידול.לבסוף, ארבעה ימים לאחר הטרנספורמציה, העבירו את הסלופן לצלחות ברירה טריות. דמות זו מראה דוגמה לצמחים בני 18 ימים שחוּדשו מפרוטופלסטים, אשר עברו טרנספורמציה עם 15 micrograms של DNA פלסמיד super coiled, הנושא קסטה לעמידות להיגרומיצין. כאן, 30 micrograms של אותו DNA פלסמיד super coiled הועברו בטרנספורמציה לפרוטופלסטים.60 מיקרוגרם של DNA פלייד הוכנסו בטרנספורמציה למדגם זה. ולבסוף, צמחים אלו שוחזרו מפרוטופלסטים שעברו טרנספורמציה עם 120 מיקרוגרם של אותו DNA פלסמידי סופר-סלילי הנושא את קסטת העמידות להיגרומיצין. יעילות הטרנספורמציה אינה מושפעת מריכוזי DNA של עד 60 מיקרוגרם.עם זאת, ריכוזים גבוהים יותר של DNA פוגעים בהליך זה. הנתונים מעידים כי שיטה זו מספקת תוצאות עקביות על פני טווח רחב של כמויות DNA בכל סמסטר. ניתן לבצע טכניקה זו בשלוש שעות אם היא מבוצעת כהלכה.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון RNAi זמני ושביטת גנים (gene knockouts) על מנת לענות על שאלות נוספות בנוגע לתפקוד הגנים.

efficient-polyethylene-glycol-peg-mediated-transformation-moss

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הפרוטוקול מתאר ביטוי חלבון באמצעות שמרים...

ביטוי של חלבונים רקומביננטי השמרים Methylotrophic Pichia pastoris</em

מאמר זה מתאר את השינוי הגנטי של unicellular אצה...

שינוי גנטי של Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

A-תפוקה גבוהה, אוטומטית, מתודולוגיה ייצור וטרנספורמציה טבק פרוטופלאסט מתוארת. המערכת הרובוטית מאפשרת ביטוי גנים מקביל מסיבי וגילוי במודל BY-2 המערכת שאמורה להיות לתרגום לגידולים שאינם מודל.

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

אנו מתארים אסטרטגית החלפת גנים חזקה כדי גנטי לתפעל פטריית תועבת Ustilago maydis. פרוטוקול זה מסביר כיצד ליצור מוטציות מחיקות לחקור פנוטיפים זיהום. זה יכול להתארך עד לשנות את הגנים בכל דרך רצויה, למשל, על ידי הוספת רצף קידוד תג חלבון פלואורסצנטי.

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

פיתחנו פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הכנת כמויות גדולות של סויה protoplasts ללמוד מנגנוני איתות ולניהולו מורכבים בתאים חיים.

שיטה פשוטה עבור בידוד של סויה Protoplasts, ליישום ניתוחים ביטוי גנים ארעית

שינוי בתיווך Agrobacterium באמצעות שיטת פרחוני-מח ש יכול להיות מועסק בהצלחה כדי ליצור שורות הטרנסגניים יציב של המודל extremophyte Schrenkiella parvula. אנו מציגים פרוטוקול שונה מזו עבור תודרנית לבנה, בהתחשב גידול שונים והרגלי הפיזיולוגיות של extremophyte.

צמח צמיחה ושינוי בתיווך Agrobacterium פרחוני-מח ש של Extremophyte Schrenkiella parvula

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בתפוקה גבוהה להעברה זמנית של מיליוני פרוטופלסטים של תירס לבדיקת ספריות גדולות של פלסמידים בתאי מזופיל תירס.

טרנספקציה ניתנת להרחבה של פרוטופלסטים של מזופיל תירס

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בטרנספורמציה בתיווך גידולים אגרובקטריום (AMT) לשילוב גנים בעלי עניין בגנום הגרעיני של המיקרו-אצות הירוקות Chlorella vulgaris, מה שמוביל לייצור טרנספורמנטים יציבים.

Agrobacterium tumefaciens-מתווך גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, Chlorella vulgaris

אנו מציגים פרוטוקול פשוט, יעיל וניתן לשכפול לטרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום של Phytophthora palmivora, שמתאים גם ל-P. capsici.

שיטה מפושטת לטרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום של Phytophthora palmivora

גידול כמה סוגים פשתן תחת תוצאות מתח מזין וריאציה גנומית בתוך משנה של הגנום ושונות פנוטיפי. הכניסה מורכבים באתר מסוים מזוהה עם צמיחה תחת משטרי תזונה שונים עם שינויים בביטוי הגנים סביב באתר זה.

מושרה לסביבה תורשתי שינויים פשתן

למדו שיטה יעילה להנדסה גנטית בצמחים באמצעות טרנספורמציית פרוטופלסטים של Physcomitrella patens עם פוליאתילן גליקול. הפרוטוקול מאפשר ביטוי עקבי של חלבונים פלואורסצנטיים ותומך בניסויים כמו RNAi זמני ונוקאאוט גני.

פוליאתילן גליקול יעיל (PEG) מתווכת טרנספורמציה של מוס Physcomitrella patens

גלה סרטונים נוספים