פוליאתילן גליקול יעיל (PEG) מתווכת טרנספורמציה של מוס Physcomitrella patens
19 באפריל 2011
שיטה פשוטה ויעילה להפוך Physcomitrella pantens Protoplasts מתואר. שיטה זו מותאמת פרוטוקולים Physocmitrella Protonemal protoplast ו ארבידופסיס Protoplast mesophyll שינוי 1.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להפוך פרוטופלסטים של SCO Metre. זה מושג על ידי עיכול הצמחים תחילה עם Drizly. לאחר מכן, הפרוטופלסטים נשטפים במניטול כדי להסיר את הדריזלי ולאחר מכן מודגרים עם DNA ויתד.
לבסוף, הפרוטופלסטים שעברו טרנספורמציה נמרחים על צלחות ומודגרים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות. ההצגה הזו שינתה פרוטופלסטים המבטאים חלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תדגים את ההליך Y lu, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יעילה ומייצרת באופן עקבי פרוטופלסטים המבטאים את החלבון המעניין כדי לבודד טחב פרוטופלסטים מתחילים בהוספת תשעה מיליליטר של מניטול 8% לצלחת פטרי באמצעות מרית מניחים טחב בן חמישה עד שבעה ימים משתיים עד שלוש PP NH ארבע צלחות לתוך המניטול. אנא עיין בפרוטוקול הכתוב הנלווה למתכוני ריאגנטים אלה ונוספים. לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטר של 2% ודגרו בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין למשך שעה.
מסננים את התערובת דרך רשת של 100 מיקרון לקבלת תרחיף הומוגני ירוק. ואז סובב את המסנן בחום של 250 גרם למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט בעדינות רבה.
השעו מחדש את הפרוטופלסטים ב -500 מיקרוליטר של 8% מניטול. לאחר מכן הוסף 9.5 מיליליטר נוספים של 8% מניטול. וודא שהפרוטופלסטים תלויים במלואם.
בצע את שלבי הכביסה פעמיים נוספות על ידי סיבוב התמיסה שוב ב -250 גרם למשך חמש דקות. השלכת הסופרנטנט והחייאת הפרוטופלסטים. ראשון ב -500 מיקרוליטר.
ואז 9.5 מיליליטר של 8% מניטול באמצעות ציטומטר המו. ספרו את מספר הפרוטופלסטים ב-10 מיקרוליטר של המתלה כדי להפוך את ה-DNA לפרוטופלסטים המבודדים. ראשית, סובבו את תערובת הפרוטופלסטים בחום של 250 גרם למשך חמש דקות.
הסר את הסופרנטנט השהה מחדש את הפרוטופלסטים ב-1.6 מיליון למיליליטר בתמיסת MMG. דגרו את המתלה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר מכן, הוסף 600 מיקרוליטר מתמיסת Protoplasts לצינור תרבית המכיל 60 מיקרוגרם DNA. ניער.
מוסיפים בעדינות 700 מיקרוליטר תמיסת סידן PEG ומנערים. ובכן דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות במהלך תקופת המתנה זו. מכסים את צלחות ה- PRMB בצלופן.
לאחר מכן יש לדלל את המתלה בשלושה מיליליטר W, חמש תמיסה, להסתובב ב -250 גרם למשך חמש דקות. כדי להסיר את השעיית ה-PEG, הפרוטופלסטים בשני מיליליטר של צלחת PRMT מיליליטר אחד לכל צלחת PRMB מכוסה בצלופן. שמור את הצלחות על 25 מעלות צלזיוס בתא גידול.
לבסוף, ארבעה ימים לאחר הטרנספורמציה, העבירו את הצלופן לצלחות בחירה טריות. איור זה מציג דוגמה לצמחים בני 18 יום שהתחדשו מפרוטופלסטים, שעברו טרנספורמציה עם 15 מיקרוגרם של פלזמה סופר מפותלת, DNA, הנושאת קלטת עמידות להיגרומיצין. כאן, 30 מיקרוגרם של אותו פלסמיד סופר מפותל, DNA, הפכו לפרוטופלסטים.
60 מיקרוגרם של DNA משובץ הומרו בדגימה זו. ולבסוף, צמחים אלה התחדשו מפרוטופלסטים שעברו טרנספורמציה עם 120 מיקרוגרם של אותו DNA פלזמה מפותל במיוחד הנושא את קלטת העמידות להיגרומיצין. יעילות הטרנספורמציה אינה מושפעת מריכוזי DNA של עד 60 מיקרוגרם.
עם זאת, ריכוזים גבוהים יותר של DNA מזיקים להליך זה. הנתונים מצביעים על כך ששיטה זו מספקת תוצאות עקביות על פני מגוון רחב של כמויות DNA פעם בסמסטר. טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כמו RNAi חולף ונוקאאוט גנים על מנת לענות על שאלות נוספות על תפקוד הגנים.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה לטרנספורמציה של פרוטופלסטים של Physcomitrella patens. הטכניקה מותאמת מפרוטוקולים קיימים לטרנספורמציה של פרוטופלסטים ומטרתה להניב תוצאות עקביות ומוצלחות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של צמחים
- הנדסה גנטית
- ביולוגיה של התא
רקע
- פרוטופלסטים הם תאי צמח שדפנות התאים שלהם הוסרו.
- טכניקות טרנספורמציה הן חיוניות לחקר תפקוד גנים בצמחים.
- Physcomitrella patens משמש כאורגניזם מודל במחקר צמחים.
- שיטות קיימות לטרנספורמציה של פרוטופלסטים עלולות להיות מורכבות וגוזלות זמן.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול יעיל לטרנספורמציה של פרוטופלסטים של Physcomitrella patens.
- לשפר את היעילות והמהימנות של טרנספורמציית פרוטופלסטים.
- להקל על מחקרים גנטיים נוספים בטחב.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- עיכול רקמת טחב באמצעות Drizly לבידוד פרוטופלסטים.
- שטיפת פרוטופלסטים במניטול להסרת מזהמים.
- טרנספורמציה של פרוטופלסטים מבודדים באמצעות DNA בעזרת PEG.
- דגירה של פרוטופלסטים שעברו טרנספורמציה על מצע ברירה.
תוצאות עיקריות
- פרוטופלסטים שעברו טרנספורמציה ביטאו בהצלחה חלבונים פלורסצנטיים.
- השיטה הראתה יעילות טרנספורמציה עקבית בריכוזי DNA שונים.
- נמצא כי ריכוזי DNA גבוהים יותר פוגעים בהצלחת הטרנספורמציה.
- ניתן להשלים את הפרוצדורה כולה תוך כשלוש שעות.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה מהימנה לטרנספורמציה של פרוטופלסטים של Physcomitrella patens.
- היא מאפשרת ביצוע ניסויים עוקבים כגון RNAi זמני ושבירת גנים (gene knockouts).
- הפרוטוקול עשוי לסייע משמעותית בהבנת תפקוד גנים בטחב.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טרנספורמציה של פרוטופלסטים של Physcomitrella patens בתיווך PEG מאפשרת העברה יעילה וניתנת לשחזור של גנים, ובכך תומכת בגנומיקה תפקודית בעלת תפוקה גבוהה במערכות צמחים. יכולת זו היא קריטית עבור צוותי גילוי מוקדם המבקשים לבחון תפקוד גנים, לתקף מטרות ולהאיץ את פיתוח הבנת המסלולים הביולוגיים במודל הניתן לטיפול גנטי. הפוטנציאל של השיטה לשבירה (scalability) ולסטנדרטיזציה הופך אותה לבעלת ערך לסריקה גנטית של פוביליאו של תרכובות ולהפחתת סיכונים מכניסטיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה מהירה של תפקוד גנים באמצעות הולכה יעילה של DNA לתאי טחב.
- תומך בת targeting של גנים בתדירות גבוהה לצורך תיקוף תפקודי של מטרות וניתוח מסלולים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות לביצוע שינויים גנטיים מדויקים במערכת מודל.
- משפר את רמת הביטחון החזויה עבור היפותזות ביולוגיות המשך.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק פרוטוקול סטנדרטי ליצירת מספר רב של טרנספורמנטים עבור בדיקות סריקה.
- מספק יעילות טרנספורמציה הניתנת לשחזור, התומכת באמינות ובשקיפות (scalability) של הבדיקה.
- מאפשר הכנה של מערכות ביולוגיות מועמדות להערכת תרכובות וסריקה פנוטיפית.
- מפחית את התלות בציוד מיוחד, ובכך מגביר את הנגישות עבור צוותים הפיתוח של הבדיקות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מאפשר יישומים המשכיים כגון RNAi זמני ומחקרי knockout של גנים הרלוונטיים למודלים של מחלות.
- תומך ברצף מהגיית גנים ועד לאישור פרה-קליני במערכות מבוססות צמחים.
- מספק פלטפורמה לחקירת ביומרקרים תרגומיים כאשר היא מותאמת למסלולים הרלוונטיים למחלה.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
פרוטוקול טרנספורמציה זה משתלב ברצף השלבים שבין הגילוי המוקדם לזיהוי מובילים, ומאפשר מניפולציה גנטית, תיקוף מטרות ופיתוח בדיקות במודלים של צמחים.
- ביולוגיה של גילוי: מקלה על בדיקת היפותזות והבהרת מסלולים באמצעות הובלה יעילה של גנים וניתוח ביטוי.
- סריקה: תומכת במוכנות ובשחזור של בדיקות על ידי יצירת אוכלוסיות טרנספורמנטים עקביות.
- אנליטיקה: מספקת פלטים כמותיים, כגון יעילות טרנספורמציה וביטוי חלבון, לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר טרנסלציוני: מאפשרת מחקרים גנטיים המנחים פיתוח מודלים פרה-קליניים וזיהוי סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה יכולת טרנספורמציה סטנדרטית ורב-שימוש עבור מחקרים גנטיים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי תפקוד גנים.
- ערך תפעולי: מספק סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת התרחבות (scalability) עבור תהליכי עבודה של טרנספורמציה גנטית.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפקה חסונה של נתונים בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מטרות ומסלולים גנטיים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאי צמחים ובטכניקות סטריליות עבור בידוד והטרנספורמציה של פרוטופלסטים.
- נדרשת גישה לתשתית מעבדה בסיסית, כולל סנטריפוגציה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית לצורך תיקוף התוצאות.
- נדרש סטנדרטיזציה של פרמטרי ההטרנספורמציה בין צוותים שונים להבטחת הדירות הפרויקטים.
- ייתכן שיידרש התאם לשימוש במינים של צמחים או במערכות מודל אחרות מעבר ל-Physcomitrella patens.
- יעילות ההטרנספורמציה רגישה לריכוז ה-DNA, כאשר כמויות גבוהות יותר עלולות להזיק.
