NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

מערכת שימור הדגימות של NanoDrop היא טכנולוגיה חדשנית המשתמשת במתיחות הפנים הטבעית של נוזלים כדי להחזיק ולמדוד דגימות בנפח מיקרו בין שני מעמדים אופטיים, ללא שימוש ב-QTS או בנימים. כמות קטנה של מיקרוליטר אחד של דגימה מועברת בפיפט ישירות אל חלקו העליון של המשטח האופטי התחתון. עם סגירת זרוע הספקטרומטר, נוצרת עמודת נוזל בין המעמדים האופטיים העליון והתחתון.

באמצעות מתח פנים היוצר נתיב אופטי אנכי, אורך הנתיב האנכי יכול להשתנות באופן אוטומטי ובזמן אמת במהלך המדידה. קיצור אורך הנתיב מאפשר מדידה של ריכוזים גבוהים יותר, ובכך מסיר ביעילות את הצורך בביצוע דילול עבור רוב דגימות החומצות הגרעיניות. יתרה מכך, מערכת שימור הדגימה מאיצה את התהליך הניסויי באמצעות ניקוי מהיר, המורכב פשוט מניגוב של המשטחים האופטיים בעזרת מטלית מעבדה.

היום נדגים שני נהלים לקביעת ריכוז חומצות גרעיניות באמצעות מכשור מיקרו-נפח של Thermo Scientific. הפרוטוקול הראשון הוא מדידה ישירה של חומצות גרעיניות באמצעות הספקטרופוטומטר NanoDrop 2000 C. הפרוטוקול השני הוא מדידה עקיפה של חומצות גרעיניות באמצעות פלואורסצנציה בעזרת הספקטרומטר NanoDrop 3000 fluoro.

כדי להתחיל, נקה את המשטחים האופטיים העליונים והתחתונים של מערכת החזקת הדגימות בספקטרופוטומטר למיקרו-נפח על ידי העברת 2-3 µL של מים דה-יוניים נקיים למשטח האופטי התחתון. סגור את זרוע המנוף וודא שהבסיס העליון בא במגע עם המים הדה-יוניים. הרם את זרוע המנוף ונגב את שני המשטחים האופטיים בעזרת מטלית מעבדה נקייה, יבשה וללא סיבים.

לאחר מכן, פתחו את תוכנת ה-NanoDrop ובחרו באפליקציה לחומצות גרעיניות. השתמשו בפיפט מכויל לנפחים קטנים כדי לבצע מדידת Blank (ביקורת) על ידי טפטוף של 1 µL מהבופר על המשטח האופטי התחתון. הורידו את זרוע המנוף ובחרו ב-blank באפליקציה לחומצות גרעיניות.

לאחר השלמת מדידת הבלנק, נקה את שני המשטחים האופטיים בעזרת נייר ניגוב למעבדה. כפי שנעשה קודם לכן, בחר את הקבוע המתאים לדגימה שברצונך למדוד. לאחר מכן, טפטף 1 µL מדגימת החומצה הגרעינית על המעמד האופטי התחתון וסגור את זרוע המנוף.

מכיוון שהמדידה אינה תלויה בנפח, הדגימה רק צריכה לגשר על המרווח שבין שני המשטחים האופטיים. כדי לבצע מדידה, יש לבחור באפשרות measure בתוכנת היישום; התוכנה תחשב באופן אוטומטי את ריכוז החומצות הגרעיניות ואת יחסי הניקיון. לאחר מדידת הדגימה, יש לבחון את הפלט הספקטרלי. לדגימה טיפוסית של חומצה גרעינית יהיה פרופיל אופייני מאוד.

אינדיקטורים ספקטרליים לדגימה באיכות נמוכה כוללים שקעים באורך הגל באגן ובשיא של 260 nanometer. מקורות נפוצים של מזהמים הקשורים לטכניקות ספציפיות של בידוד חומצות גרעיניות כוללים phenol, triol ומיצוי בעמודה. במקרה של מיצוי phenol triol, זיהום משאריות של ריאגנט עשוי להצטייר כספקטרה חריגה בין 220 ל-240 nanometer, וכן כהסטות באזור של 260 עד 280 nanometer.

לעומת זאת, שאריות של guanidine ממיצוי העמודה עשויות לתרום לפיסגה סביב 230 ננומטר ולהסטה של השפל מ-230 ננומטר לכ-240 ננומטר. כדי להעריך במדויק את טהרת הדגימה, יש לנתח את היחסים 2 62 80 ו-2 62 30 בשילוב עם האיכות הספקטרלית הכללית. חומצות גרעין טהורות מניבות בדרך כלל יחס 2 62 80 של כ-1.8 עבור DNA וכ-2.0 עבור RNA.

יחס זה תלוי ב-pH ובחוזק היוני של התמיסה הבאפר המשמשת לביצוע מדידות הבלנק והדגימה. מכשיר ה-Banana drop 3, 300 fluoro spectrometer משתמש באותה מערכת פטנטה לשמירת דגימה בנפח מיקרו כפי שקיימת בספקטרופוטומטר NanoDrop 2000 C. מכיוון שמדידות פלואורסצנציה מבוצעות עם כמות דגימה של מיקרוליטר אחד בלבד, המשתמש בוחר אחת משלוש נורות LED כמקור העירור, היורה על הדגימה באופן אופקי.

לאחר מכן, הפלואורסצנציה של הדגימה נאספת בזווית של 90 מעלות באופן אנכי לתוך ספקטרומטר פנימי. כדי להדגים כימות של חומצות גרעין בנפחים זעירים ברגישות גבוהה באמצעות ה-NanoDrop 3, 300, נעשה שימוש בערכה של PicoGreen fluorescence. ראשית, יש להביא את סטנדרטי הערכה ואת כל דגימות החומצה הגרעינית לטמפרטורת החדר. דגימות פלואורסצנטיות הן רגישות לאור ויש לשמור אותן במבחנות ענבר או במבחנות עטופות באלומיניום.

הכינו כמות מספקת של באפר 1XTE עבור כל התמיסות הסטנדרטיות והדגימות שיימדדו, וכן עבור תמיסת העבודה של pico green שתידרש. הכינו באפר 1XTE על ידי דילול של באפר 20XTE המסופק עם מים נקיים מנוקלאז (nucleus free water) בהתאם לפרוטוקול היצרן. נפחי התגובה יכולים לנוע בין 200 microliters ועד ל-10 microliters.

בדוגמה זו, נכין נפחי תגובה של 10 µL. לאחר מכן, הכינו סדרת דלילות של סטנדרטים של DNA דו-גדילי ומבחנות או שפופרות נקיות מנוקלאז. אלו יכסו את טווח הריכוזים הצפוי של דגימות ה-DNA הבלתי ידועות.

העבירו חמישה µL מכל אחד מתמיסות הסטנדרט של ה-DNA דו-גדילי המדולל למבחנה בענבר או למבחנה מכוסה ברדיד אלומיניום המסומנת באופן אינדיבידואלי ונטולת נוקלאז. לאחר מכן, העבירו מנה של חמישה µL מכל דגימת DNA דו-גדילי רלוונטית למבחנה המתאימה המוגנת מאור. לאחר הכנת תמיסת העבודה של Pico Green לפי פרוטוקול היצרן, העבירו נפח שווה של התמיסה לכל מבחנה המכילה סטנדרט של DNA דו-גדילי או דגימה של DNA דו-גדילי, ובמקרה זה חמישה µL.

ערבבו נפחים שווים של באפר XTE ותמיסת עבודה של Pico Green. להכנת הביקורת השלילית, המשמשת כתמיסת ייחוס, ערבבו את תכולת כל מבחנה ביסודיות באמצעות פיפוט עדין והמתינו לדגירה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

יש להביא את כל התמיסות הסטנדרטיות והדגימות לטמפרטורה שווה לפני המדידה, שכן הטמפרטורה משפיעה על האות הפלואורסצנטי. להכנת המכשיר ולביצוע המדידות, נקה תחילה את המשטחים העליונים והתחתונים של מערכת עיגון הדגימות, וטפטף שתיים עד שלוש µL של מים דאיוניים על המשטח האופטי התחתון הסגור. לאחר מכן, פתח את זרוע המנוף ונגב את התושבות העליונה והתחתונה בעזרת נייר ניגוב מעבדה נקי וללא סיבים.

יש לוודא כי המשטחים נקיים מסיבים לפני ההמשך, שכן סיבים עלולים להפגין פלואורסצנציה בנוכחות מקור עירור ולהפריע למדידה. פתח את תוכנת המכשיר.

בחר באפליקציית חומצות גרעיניות ובחר באפשרות pico green DNA דו-גדילי; טפטף 2 µL של 1 XTE למשטח התחתון. סגור את זרוע המנוף ובחר blank בשדה תוכנת המכשיר. לאחר השלמת ה-blank, ספוג את תמיסת ה-blank משני משטחי מערכת שימור הדגימה.

בשלב הבא, ערבבו את תמיסת הייחוס באמצעות פיפוט עדין תוך שימוש בטיפים בעלי ספיחה נמוכה. העבירו באמצעות פיפטה 2 µL מתמיסת הייחוס אל המעמד התחתון וסגרו את זרוע המנוף. בחרו ב-reference תחת לשונית ה-standards ובחרו את היחידות הרצויות.

לחצו על measure כדי להתחיל את מחזור המדידה. כאשר מחזור המדידה מסתיים, פתחו את זרוע המנוף ונגבו ביסודיות את משטחי מערכת שימור הדגימה. מדדו עד חמש חזרות של רהיט הר reference, תוך שימוש ב-Eloqua חדש עבור כל חזרה.

חזור על התהליך עבור התמיסות הסטנדרטיות הנוספות כדי לבנות עקומת כיול. ניתן להשתמש בעד שבע תמיסות סטנדרטיות. התוכנה תוכננה לאחסן עד חמש חזרות עבור כל תמיסה סטנדרטית.

מבצעים ממוצע של החזרות עבור התקנים כדי ליצור עקומת כיול, שבאמצעותה נקבעים באופן אוטומטי ריכוזי הדגימות. לאחר השלמת עקומת הכיול, יש לבחור בלשונית הדגימות (samples), להזין את פרטי זיהוי הדגימה הרלוונטיים ולמדוד כל דגימה לא ידועה. עקומה תקפה מעידה על כך שהושג מספר התקנים המינימלי הנדרש.

ריכוז ה-DNA נקבע באופן אוטומטי על בסיס עקומת הסטנדרט. מכשיר NanoDrop למיקרו-נפחים יכול לקבוע את ריכוז החומצות הגרעיניות באמצעות מדידות A260 ישירות או בשיטות פלואורומטריות עקיפות. ניתן להשתמש בספקטרופוטומטרי NanoDrop גם לכימות חלבונים באמצעות בליעה ישירה ב-A280 או באמצעות בדיקות קולורימטריות לחלבונים.