Name: NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: למד כיצד לכמת חומצות גרעין במיקרו-נפח באמצעות מערכות NanoDrop 2000 C ו-3,300. השיטה מאפשרת מדידות ישירות ופלואורומטריות עם נפח מדגם מינימלי של מיקרוליטר אחד בלבד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ריצ&#39;רד וו Beringer דוד L. אש, יישומים מדענים, תרמו מוצרים מדעי NanoDrop, סיוע טכני הצילומים.

1. Microvolume כימות חומצות גרעין שימוש 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל, לנקות את המשטחים אופטי העליון והתחתון של מערכת מדגם ספקטרופוטומטר microvolume השמירה על ידי pipetting 2-3 μL deionized מים נקיים על פני השטח אופטי נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את זרוע המנוף, על מנת להבטיח כי הדום העליון בא במגע עם המים deionized. הרם את זרוע המנוף לנגב הן משטחים אופטיים עם ונטולת מוך נקי ויבש מעבדה לנגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת NanoDrop ובחר ביישום חומצות גרעין. השתמש נפח קטן, pipettor מכויל לבצע מדידה ריק על ידי מחלק 1 μL של המאגר על גבי משטח אופטי נמוך. מנמיכים את זרוע המנוף בחר "ריק" ביישום חומצות גרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המדידה ריק תושלם, גם משטחים נקיים אופטי עם ונטולת מוך נקי ויבש מעבדה לנגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את קבוע מתאים המדגם זה כדי להימדד. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לדוגמה סוג </td><td> בחר אפשרות </td><td> קבועים המשמשים לחישוב ריכוז </td></tr><tr><td> dsDNA </td><td> DNA-50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNA </td><td> DNA-33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> RNA-40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> אוליגו </td><td> מנהג </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. אופיינית ריכוז חומצת גרעין טווחי עבור A280 מדידות ישירות באמצעות ספיגת NanoDrop microvolume ספקטרופוטומטר, ספקטרופוטומטר קובט מסורתיים מבוססי המשמשים עם microcell TrayCell קובט, וכן fluorospectrometer NanoDrop microvolume בשיתוף עם assay PicoGreen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 1 μL המדגם חומצות גרעין על הכן אופטי נמוך ולסגור את זרוע המנוף. כי המדידה היא בנפח עצמאית, המדגם צריך רק כדי לגשר על הפער בין שני משטחים אופטיים עבור המדידה להתבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר "מדוד" תוכנת היישום. התוכנה יחשב באופן אוטומטי את גרעין ריכוז טוהר יחס חומצה. בעקבות מדידה מדגם, לסקור את הפלט רפאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התוכנה יחשב באופן אוטומטי את גרעין ריכוז טוהר יחס חומצה. בעקבות מדידה מדגם, לסקור את התמונה ספקטרלי כדי להעריך את איכות המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמה טיפוסית חומצות גרעין יהיה פרופיל אופייני מאוד. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. מדגם טיפוסי חומצות גרעין יהיה פרופיל אופייני מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקורות נפוצים של מזהמים הקשורים ספציפית טכניקות בידוד גרעין חומצה כוללים להפקת פנול / Trizol ועמודה. במקרה של מיצוי פנול / Trizol, זיהום מגיב השיורי עשוי להיות מסומן על ידי ספקטרום נורמלי בין 220-240 ננומטר, כמו גם על ידי משמרות באזור 260-280 ננומטר. לעומת זאת, guanidine שיורית מתוך מיצוי טור עשויים לתרום שיא ליד 230 ננומטר שינוי השוקת מ 230 ננומטר של כ 240 ננומטר. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. המשמרות את העליות והמורדות של דגימות B ו-C לעומת מדגם להמחיש כיצד מזהמים יכולים להשפיע על ספקטרום של דגימות חומצות גרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך נכונה איכות המדגם, 260/280 או 260/230 יחס צריך להיות מנותח בשילוב עם איכות רפאים הכולל. חומצות גרעין טהור בדרך כלל תשואה יחס של 260/280 ~ 1.8 ו 260/280 יחס של 2.0 ~ עבור DNA ו-RNA, בהתאמה. יחס זה תלוי pH וחוזק היוני של המאגר המשמש לייצור הריק ומדידות במדגם. פתרונות חומציים יהיה מתחת מייצגים את היחס של 0.2-0.3, ואילו הפתרון הבסיסי יהיה מעל מייצגים את היחס של 0.2-0.3. יחסי טוהר שונה באופן משמעותי עלול להעיד על נוכחות של מזהמים חלבון פנול או אחרים לספוג חזק ליד או 280 ננומטר. יחס 260/230 טוהר הוא מדד השנייה של טוהר DNA עם ערכי חומצת "טהור" גרעין בדרך כלל בטווח של 1.8-2.2. יחסי טוהר כי נמוכים משמעותית את ערכי צפוי עשוי להצביע על הטכניקה בידוד בשימוש עשויים לדרוש אופטימיזציה נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הספקטרופוטומטרים NanoDrop יכול לשמש גם לכמת חלבונים באמצעות ספיגת ישיר או באמצעות מבחני חלבון colorimetric. כדי להבטיח בטור reproducibility נכונה, 2-μl דגימות מומלץ עבור דגימות חלבון. עיין וידאו יופיטר הבאים: קביעת ריכוז חלבון Microvolume באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610</a> </li></ol>s = "jove_title"&gt; 2. רגישות גבוהה Microvolume quantitation חומצות גרעין שימוש Fluorospectrometer NanoDrop 3300 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפגין רגישות גבוהה quantitation microvolume חומצות גרעין באמצעות NanoDrop 3300, ערכה הקרינה PicoGreen משמש. כדי להתחיל, לאזן את הסטנדרטים ערכת וכל דגימות חומצות גרעין לטמפרטורת החדר. דגימות פלורסנט אור רגיש יש לשמור ענבר או צינורות אלומיניום עטופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1x מספיק חיץ TE לכל הסטנדרטים דגימות כדי להימדד כמו גם לפתרון PicoGreen לעבוד כי יהיה צורך. הכן חיץ 1xTE על ידי דילול בתנאי 20x TE חיץ עם מים nuclease חופשי לכל פרוטוקול של היצרן. כרכים תגובת יכול לנוע בין 200 ל μL ul קטנה כמו 10. בדוגמה זו, 10 כרכים התגובה μL יהיה מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סדרתי סטנדרטים בדילול dsDNA בריכוז 2x הרצוי הסופי nuclease ללא צלוחיות או צינורות. העברת 5 μL של כל אחד מן הסטנדרטים dsDNA בדילול אל הפרט שכותרתו nuclease ללא ענבר או קרקרים צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 Aliquot μL של המדגם כל dsDNA עניין לתוך ענבר nuclease ללא שכותרתו כראוי או קרקרים צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון PicoGreen עובד על פי פרוטוקול של היצרן. העברת נפח שווה של הפתרון PicoGreen עובדים כדי שכל אחת מהן מכילה גם צינור רגיל או מדגם של עניין (5 μL בדוגמה זו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב כרכים שווה של 1x TE חיץ פתרון PicoGreen לעבוד כדי להכין את השליטה שלילית, המהווה פתרון התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תכולת שפופרת כל תגובה ביסודיות על ידי pipetting עדין דגירה התגובות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. כל הסטנדרטים דגימות צריך להיות equilibrated לטמפרטורה זהה לפני המדידה כאות הקרינה מושפעת טמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את המכשיר לבצע מדידות, תחילה לנקות את המשטח העליון והתחתון של מערכת השמירה המדגם. 2-3 Pipet μL של מים על פני השטח deionized אופטי נמוך, סגור ולאחר מכן פתח את זרוע המנוף, ומוחה את כנים העליון והתחתון עם נקייה ונטולת מוך, נגב מעבדה. ודא משטחים חופשיים של מוך לפני שתמשיך כמו מוך יכול להציג פלואורסצנציה בנוכחות מקור עירור והוא יכול להפריע המדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנה במכשיר, בחר את "חומצות גרעין" יישומים, ובחר את "PicoGreen-dsDNA" אפשרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ריק המכשיר, להוסיף 2 μL של 1x TE אל הכן התחתון, לסגור את הזרוע, ולחצו על "ריק" בתחום התוכנה במכשיר. לאחר השלמת ריק, כתם את הפתרון ריק משני משטחים של מערכת השמירה המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הפתרון על ידי התייחסות pipetting עדין. בעזרת טיפים שימור נמוך, μL 2 פיפטה על הדום התחתונה ולסגור את הזרוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר "הפניה" בסוג המדידה, בחר את היחידות הרצויות. לחץ על "מדוד" ליזום את מחזור המדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מחזור המדידה היא מוחלטת, לפתוח את היד וביסודיות למחוק את השמירה מדגם משטחים המערכת. מדוד עד חמש משכפל התייחסות, באמצעות aliquot טרי לשכפל כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך עבור הסטנדרטים נוסף לבנות עקומת סטנדרטי. עד שבעה תקנים ניתן להשתמש. התוכנה נועדה לאחסן עד חמישה משכפל עבור כל תקן. משכפל סטנדרטים הם בממוצע כדי ליצור עקומת סטנדרט שממנו ריכוזי מדגם נקבעים באופן אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עקומת הסטנדרטי הוא שלם, בחר את "דוגמאות" הכרטיסייה, הזן את המידע המתאים מזהה מדגם ולמדוד כל מדגם לא ידוע. </li></ol>

<ol><li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li>
<li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoolstra%2C+C+%22Implen+Applications+Note%22">Implen Applications Note</a>. , Munich, Germany. (2006).</li>
<li>Jr, I. ngle, D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJr%2C+Ingle+%22Spectrochemical+analysis%22">Spectrochemical analysis</a>. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. XV-590 (1988).</li>
<li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Lett%22%5BJournal%5D)">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li>
</ol>

פיליפ Desjardins ו דברה קונקלין מועסקים על ידי Thermo Scientific NanoDrop מוצרים, Inc המייצרת את המכשירים המשמשים במאמר זה.

פרוטוקולים quantitation המוצגים כאן מבוססים על רוב מקובל microvolume מערכות. מערכות אלו מספקות אלטרנטיבות מעשיות מסורתיות מתודולוגיה חומצות גרעין quantitation, אשר מסתמכים על כרכים מדגם גדול יותר ושימוש מנגנון הבלימה. NanoDrop microvolume טכנולוגיה מעסיקה השמירה מדגם מערכת שמסתמכת על המתח מאפייני פני השטח של המדגם הנמדדים כדי ליצור עמודה נוזלי. זה חיוני כי המדגם יוצר מגע עם משטחים העליון והתחתון מדידה אופטיות עבור בטור המתאים. אם בכל נקודה על תוצאות המדידה נראה לשחזור מדויק או לא, היא ככל הנראה תוצאה של הטרוגניות מדגם או שבירה טור נוזלי. דטרגנטים ואלכוהול איזופרופיל אינם מומלצים חומרי ניקוי, כיוון שהם עלולים uncondition המדידה משטחים הדום. הדום מותנית מתרחשת כאשר מאפייני פני השטח של הידרופובי הכן נפרץ, וכתוצאה מכך השטחת אגל המדגם. כנים מותנית יכולה להוביל שבירה של הטור נוזל בזמן המדידה. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. משטח מותנה מאופיין השטחת אגל מים. משטחים הדום Uncondtioned יכול להיות משופץ באמצעות מתחם Pedestal NanoDrop שפוץ (PR-1, Thermo Scientific מוצרים NanoDrop). שכבה דקה של המתחם שפוץ מוחל על משטחי רגל העליון והתחתון, להתייבש במשך ~ 30 שניות, ולאחר מכן שפשף את השימוש נקייה ונטולת מוך יבש, מעבדה לנגב. המדינה מחודשים בהצלחה מאופיין אגל מים ואגלי כאשר מוחל על פני השטח הדום התחתונה. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. משטח משופץ מאופיין ואגלי את אגל מים. מערכות Microvolume quantitation לצמצם במידה ניכרת את צריכת מדגם להגדיל באופן משמעותי את טווח הריכוז בהשוואה למערכות כימות מסורתיים יותר. למרות quantitation microvolume יש לעתים קרובות להפוך טכנולוגיה המאפשרת בנסיבות מעורבים מסת תאים מוגבל כגון ביופסיות מחט לייזר ללכוד microdissection, את היעילות ואת קלות השימוש של מתודולוגיה זו הפכה אותה מקובל אלטרנטיבה המסורתי גרעין quantitation שיטות חומצה אפילו כאשר המדגם הוא בשפע.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

nanodrop microvolume quantitation של חומצות גרעין

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

מבחני Biomolecular הרף מפותח כי השימוש בהדרגה כמויות קטנות של החומר, לעיתים קרובות מניעת השימוש קובט מבוססות מכשירים קונבנציונלי עבור quantitation חומצות גרעין עבור אלה שיכולים לבצע quantitation microvolume. החזקת NanoDrop microvolume מערכת מדגם (Thermo Scientific מוצרים NanoDrop) פונקציות על ידי שילוב הטכנולוגיה סיב אופטי טבעי מתח מאפייני פני השטח כדי ללכוד ולשמר כמויות זעירות של מדגם עצמאי של מנגנון הבלימה מסורתיים כגון cuvettes או נימים. יתר על כן, המערכת מעסיקה אורכי נתיב קצר יותר, אשר התוצאה מגוון רחב של מדידות ריכוז חומצת גרעין, למעשה מבטל את הצורך לבצע דילולים. הקטנת נפח של המדגם הנדרש עבור ניתוח ספקטרוסקופיות גם מקלה על הכללת צעדים שליטה נוספת באיכות ברחבי workflows מולקולרית רבים, הגברת היעילות, ובסופו של דבר מוביל בביטחון רב יותר בתוצאות במורד הזרם. הצורך בניתוח רגישות גבוהה הניאון של מסה מוגבל התפתחה גם עם התקדמות הניסוי האחרונות. שימוש באותה טכנולוגיה שימור microvolume מדגם, מדידות פלורסנט ניתן לבצע עם μL 2 של החומר, דבר המאפשר פלורסנט מבחני דרישות נפח להצטמצם באופן משמעותי. Microreactions כזה של μL 10 פחות או יותר כעת אפשרי באמצעות fluorospectrometer ייעודי microvolume. שני microvolume גרעין quantitation פרוטוקולים חומצה יהיה הפגינו המשתמשים משולב מדגם שימור מערכות כמו חלופות מעשיות קובט פרוטוקולים מבוססי המסורתית. ראשית, שיטה ישירה A260 ספיגת באמצעות ספקטרופוטומטר microvolume מתואר. זה ואחריו הפגנה של השיטה הקרינה מבוססי המאפשרת לצמצם נפח תגובות פלואורסצנציה עם fluorospectrometer microvolume. אלו טכניקות הרומן לאפשר הערכה של ריכוזי חומצות גרעין החל 1 pg / μL עד 15,000 ng / μL עם צריכה מינימלית של המדגם.

השימוש במערכות NanoDrop microvolume כחלופות מעשי ויעיל המסורתית מתודולוגיה חומצות גרעין quantitation מתוארת באמצעות הדגמה של שני פרוטוקולים microvolume quantitation חומצת גרעין.

NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

בדיקות ביו-מולקולריות המשתמשות בכמויות הולכות וקטנות של חומר מפותחות ללא הרף, דבר שמונע לעיתים קרובות את השימוש ב... רגבונליים...

מערכת שימור הדגימות של NanoDrop היא טכנולוגיה חדשנית המשתמשת במתיחות הפנים הטבעית של נוזלים כדי להחזיק ולמדוד דגימות בנפח מיקרו בין שני מעמדים אופטיים, ללא שימוש ב-QTS או בנימים. כמות קטנה של מיקרוליטר אחד של דגימה מועברת בפיפט ישירות אל חלקו העליון של המשטח האופטי התחתון. עם סגירת זרוע הספקטרומטר, נוצרת עמודת נוזל בין המעמדים האופטיים העליון והתחתון.באמצעות מתח פנים היוצר נתיב אופטי אנכי, אורך הנתיב האנכי יכול להשתנות באופן אוטומטי ובזמן אמת במהלך המדידה. קיצור אורך הנתיב מאפשר מדידה של ריכוזים גבוהים יותר, ובכך מסיר ביעילות את הצורך בביצוע דילול עבור רוב דגימות החומצות הגרעיניות. יתרה מכך, מערכת שימור הדגימה מאיצה את התהליך הניסויי באמצעות ניקוי מהיר, המורכב פשוט מניגוב של המשטחים האופטיים בעזרת מטלית מעבדה.היום נדגים שני נהלים לקביעת ריכוז חומצות גרעיניות באמצעות מכשור מיקרו-נפח של Thermo Scientific. הפרוטוקול הראשון הוא מדידה ישירה של חומצות גרעיניות באמצעות הספקטרופוטומטר NanoDrop 2000 C. הפרוטוקול השני הוא מדידה עקיפה של חומצות גרעיניות באמצעות פלואורסצנציה בעזרת הספקטרומטר NanoDrop 3000 fluoro.כדי להתחיל, נקה את המשטחים האופטיים העליונים והתחתונים של מערכת החזקת הדגימות בספקטרופוטומטר למיקרו-נפח על ידי העברת 2-3 µL של מים דה-יוניים נקיים למשטח האופטי התחתון. סגור את זרוע המנוף וודא שהבסיס העליון בא במגע עם המים הדה-יוניים. הרם את זרוע המנוף ונגב את שני המשטחים האופטיים בעזרת מטלית מעבדה נקייה, יבשה וללא סיבים.לאחר מכן, פתחו את תוכנת ה-NanoDrop ובחרו באפליקציה לחומצות גרעיניות. השתמשו בפיפט מכויל לנפחים קטנים כדי לבצע מדידת Blank (ביקורת) על ידי טפטוף של 1 µL מהבופר על המשטח האופטי התחתון. הורידו את זרוע המנוף ובחרו ב-blank באפליקציה לחומצות גרעיניות.לאחר השלמת מדידת הבלנק, נקה את שני המשטחים האופטיים בעזרת נייר ניגוב למעבדה. כפי שנעשה קודם לכן, בחר את הקבוע המתאים לדגימה שברצונך למדוד. לאחר מכן, טפטף 1 µL מדגימת החומצה הגרעינית על המעמד האופטי התחתון וסגור את זרוע המנוף.מכיוון שהמדידה אינה תלויה בנפח, הדגימה רק צריכה לגשר על המרווח שבין שני המשטחים האופטיים. כדי לבצע מדידה, יש לבחור באפשרות measure בתוכנת היישום; התוכנה תחשב באופן אוטומטי את ריכוז החומצות הגרעיניות ואת יחסי הניקיון. לאחר מדידת הדגימה, יש לבחון את הפלט הספקטרלי. לדגימה טיפוסית של חומצה גרעינית יהיה פרופיל אופייני מאוד.אינדיקטורים ספקטרליים לדגימה באיכות נמוכה כוללים שקעים באורך הגל באגן ובשיא של 260 nanometer. מקורות נפוצים של מזהמים הקשורים לטכניקות ספציפיות של בידוד חומצות גרעיניות כוללים phenol, triol ומיצוי בעמודה. במקרה של מיצוי phenol triol, זיהום משאריות של ריאגנט עשוי להצטייר כספקטרה חריגה בין 220 ל-240 nanometer, וכן כהסטות באזור של 260 עד 280 nanometer.לעומת זאת, שאריות של guanidine ממיצוי העמודה עשויות לתרום לפיסגה סביב 230 ננומטר ולהסטה של השפל מ-230 ננומטר לכ-240 ננומטר. כדי להעריך במדויק את טהרת הדגימה, יש לנתח את היחסים 2 62 80 ו-2 62 30 בשילוב עם האיכות הספקטרלית הכללית. חומצות גרעין טהורות מניבות בדרך כלל יחס 2 62 80 של כ-1.8 עבור DNA וכ-2.0 עבור RNA.יחס זה תלוי ב-pH ובחוזק היוני של התמיסה הבאפר המשמשת לביצוע מדידות הבלנק והדגימה. מכשיר ה-Banana drop 3, 300 fluoro spectrometer משתמש באותה מערכת פטנטה לשמירת דגימה בנפח מיקרו כפי שקיימת בספקטרופוטומטר NanoDrop 2000 C. מכיוון שמדידות פלואורסצנציה מבוצעות עם כמות דגימה של מיקרוליטר אחד בלבד, המשתמש בוחר אחת משלוש נורות LED כמקור העירור, היורה על הדגימה באופן אופקי.לאחר מכן, הפלואורסצנציה של הדגימה נאספת בזווית של 90 מעלות באופן אנכי לתוך ספקטרומטר פנימי. כדי להדגים כימות של חומצות גרעין בנפחים זעירים ברגישות גבוהה באמצעות ה-NanoDrop 3, 300, נעשה שימוש בערכה של PicoGreen fluorescence. ראשית, יש להביא את סטנדרטי הערכה ואת כל דגימות החומצה הגרעינית לטמפרטורת החדר. דגימות פלואורסצנטיות הן רגישות לאור ויש לשמור אותן במבחנות ענבר או במבחנות עטופות באלומיניום.הכינו כמות מספקת של באפר 1XTE עבור כל התמיסות הסטנדרטיות והדגימות שיימדדו, וכן עבור תמיסת העבודה של pico green שתידרש. הכינו באפר 1XTE על ידי דילול של באפר 20XTE המסופק עם מים נקיים מנוקלאז (nucleus free water) בהתאם לפרוטוקול היצרן. נפחי התגובה יכולים לנוע בין 200 microliters ועד ל-10 microliters.בדוגמה זו, נכין נפחי תגובה של 10 µL. לאחר מכן, הכינו סדרת דלילות של סטנדרטים של DNA דו-גדילי ומבחנות או שפופרות נקיות מנוקלאז. אלו יכסו את טווח הריכוזים הצפוי של דגימות ה-DNA הבלתי ידועות.העבירו חמישה µL מכל אחד מתמיסות הסטנדרט של ה-DNA דו-גדילי המדולל למבחנה בענבר או למבחנה מכוסה ברדיד אלומיניום המסומנת באופן אינדיבידואלי ונטולת נוקלאז. לאחר מכן, העבירו מנה של חמישה µL מכל דגימת DNA דו-גדילי רלוונטית למבחנה המתאימה המוגנת מאור. לאחר הכנת תמיסת העבודה של Pico Green לפי פרוטוקול היצרן, העבירו נפח שווה של התמיסה לכל מבחנה המכילה סטנדרט של DNA דו-גדילי או דגימה של DNA דו-גדילי, ובמקרה זה חמישה µL.ערבבו נפחים שווים של באפר XTE ותמיסת עבודה של Pico Green. להכנת הביקורת השלילית, המשמשת כתמיסת ייחוס, ערבבו את תכולת כל מבחנה ביסודיות באמצעות פיפוט עדין והמתינו לדגירה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.יש להביא את כל התמיסות הסטנדרטיות והדגימות לטמפרטורה שווה לפני המדידה, שכן הטמפרטורה משפיעה על האות הפלואורסצנטי. להכנת המכשיר ולביצוע המדידות, נקה תחילה את המשטחים העליונים והתחתונים של מערכת עיגון הדגימות, וטפטף שתיים עד שלוש µL של מים דאיוניים על המשטח האופטי התחתון הסגור. לאחר מכן, פתח את זרוע המנוף ונגב את התושבות העליונה והתחתונה בעזרת נייר ניגוב מעבדה נקי וללא סיבים.יש לוודא כי המשטחים נקיים מסיבים לפני ההמשך, שכן סיבים עלולים להפגין פלואורסצנציה בנוכחות מקור עירור ולהפריע למדידה. פתח את תוכנת המכשיר.בחר באפליקציית חומצות גרעיניות ובחר באפשרות pico green DNA דו-גדילי; טפטף 2 µL של 1 XTE למשטח התחתון. סגור את זרוע המנוף ובחר blank בשדה תוכנת המכשיר. לאחר השלמת ה-blank, ספוג את תמיסת ה-blank משני משטחי מערכת שימור הדגימה.בשלב הבא, ערבבו את תמיסת הייחוס באמצעות פיפוט עדין תוך שימוש בטיפים בעלי ספיחה נמוכה. העבירו באמצעות פיפטה 2 µL מתמיסת הייחוס אל המעמד התחתון וסגרו את זרוע המנוף. בחרו ב-reference תחת לשונית ה-standards ובחרו את היחידות הרצויות.לחצו על measure כדי להתחיל את מחזור המדידה. כאשר מחזור המדידה מסתיים, פתחו את זרוע המנוף ונגבו ביסודיות את משטחי מערכת שימור הדגימה. מדדו עד חמש חזרות של רהיט הר reference, תוך שימוש ב-Eloqua חדש עבור כל חזרה.חזור על התהליך עבור התמיסות הסטנדרטיות הנוספות כדי לבנות עקומת כיול. ניתן להשתמש בעד שבע תמיסות סטנדרטיות. התוכנה תוכננה לאחסן עד חמש חזרות עבור כל תמיסה סטנדרטית.מבצעים ממוצע של החזרות עבור התקנים כדי ליצור עקומת כיול, שבאמצעותה נקבעים באופן אוטומטי ריכוזי הדגימות. לאחר השלמת עקומת הכיול, יש לבחור בלשונית הדגימות (samples), להזין את פרטי זיהוי הדגימה הרלוונטיים ולמדוד כל דגימה לא ידועה. עקומה תקפה מעידה על כך שהושג מספר התקנים המינימלי הנדרש.ריכוז ה-DNA נקבע באופן אוטומטי על בסיס עקומת הסטנדרט. מכשיר NanoDrop למיקרו-נפחים יכול לקבוע את ריכוז החומצות הגרעיניות באמצעות מדידות A260 ישירות או בשיטות פלואורומטריות עקיפות. ניתן להשתמש בספקטרופוטומטרי NanoDrop גם לכימות חלבונים באמצעות בליעה ישירה ב-A280 או באמצעות בדיקות קולורימטריות לחלבונים.

nanodrop-microvolume-quantitation-of-nucleic-acids

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים את פרוטוקול ה-DNA immunoprecipitation מפוגל (MeDIP). MeDIP היא הליך יומיים כי סלקטיבי תמציות שברי DNA מפוגל ממדגם הדנ"א הגנומי באמצעות נוגדנים עם ספציפיות עבור 5-methylcytosine (אנטי 5 MC).

ה-DNA מפוגל immunoprecipitation

דגימות Microvolume הם לכמת ידי מערכת ספקטרופוטומטר המשתמשת מתח הפנים הטבעי לשמור דגימות ללא שימוש cuvettes או נימים. טווח דינמי של ריכוזי חלבון מהירות שבה הם יכולים להימדד הם גדל מאוד בשיטה זו.

ריכוז חלבון Microvolume קביעת באמצעות 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר

תקשורת זה מובאים נתונים על דיוק ועל שחזור של ספקטרופוטומטר UV-VIS BioSpec ננו עבור dsDNA ו quantitation חלבון. אפילו עם כמויות קטנות במיוחד (1 עד 2 ליטר), שחזור מצוין, בעוד פונקציה מנגב אוטומטי משפר את התפוקה ואת התוצאות שריד מינימלי תוצאות מדויקות יותר.

קביעת ריכוז חומצות גרעין וחלבונים שימוש Micro בנפח Bio-spec ספקטרופוטומטר Nano

סרטון זה מדגים את התועלת של PCR דיגיטלי בפורמט שבב בצינור לזיהוי וריאציות נוקלאוטידים בודדים בדגימות DNA. תגובת PCR יחידה מחולקת לחדרים הפועלים כתגובות PCR עצמאיות, וזיהוי אותות פלואורסצנטיים מהמטרות המוגברות בתאים משמש לחישוב תדירות האלל המשתנה בדגימה.

PCR דיגיטלי מבוסס שבב בצינור לכימות גרסאות נוקלאוטידים בודדים

MicroRNAs (miRNAs) הם סוג של מולקולות רגולטוריות שנשמרו באופן נרחב. כאן אנו מתארים שיטת שיבוט miRNA המסתמכת על שני שלבי קשירה חזקים ואחריהם ריצוף תפוקה גבוהה. השיטה שלנו מאפשרת כימות מדויק בכל הגנום של miRNAs.

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

אנו מתארים בדיקה דיגיטלית של נקודת קצה לכימות חומצות גרעין עם קריאה פשוטה (אנלוגית). אנו מודדים פלואורסצנטיות בתפזורת של בדיקות דיגיטליות מבוססות טיפות באמצעות מכונת qPCR סטנדרטית במקום מכשור מיוחד ומאשרים את התוצאות שלנו במיקרוסקופיה.

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

מתוארת שיטה רגישה ומדויקת לכימות מיקרו-רנ"א נטול תאים באמצעות כימיה מבוססת צבע וטכנולוגיית PCR דיגיטלית טיפות.

במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל

פולימרים semiflexible להציג תכונות מכניות ייחודי המוחלות בהרחבה על ידי מערכות החיים. עם זאת, מחקרים שיטתיים על biopolymers מוגבלות מאז מאפיינים כגון הפולימר קשיחות אינם נגישים. כתב יד זה מתאר איך מגבלה זו הוא מצויין לתכנות צינוריות דנ א, הפעלת ניסיוני מחקרים על ההשפעה של פילמנט קשיחות.

ה-DNA צינוריות כמו כלי רב-תכליתי ללמוד פולימרים Semiflexible

כאן אנו מציגים פרוטוקול למדידת מספר עותק דנ"א מיטוכונדריאלי מוחלט (mt)DNA ורמות הטרופלזמה של מחיקת mtDNA בתאים בודדים.

מדידת מספר עותק דנ"א מיטוכונדריאלי חד-תאי והטרופלזמה באמצעות תגובת שרשרת דיגיטלית של טיפות פולימראז

ננו-מכונות מבוססות DNAzyme יכולות לשמש לזיהוי סלקטיבי ורגיש ביותר של חומצות גרעין. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לתכנון ננו-מכונות מבוססות DNAzyme עם ליבה של 10-23 המשתמשות בתוכנה חופשית ויישומן בזיהוי מקטע וירוס אפשטיין-בר כדוגמה.

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

פרוטוקול זה מפרט את ההפרדה של אפיתל עדשת העין של העכבר ומסת התפזורת של תאי הסיבים, ואחריו בידוד RNA וניתוח qPCR. שיטה זו מאפשרת הפרדת תאי עדשה לניתוח מפורט יותר של הטרנסקריפטום והתהליכים הביולוגיים בתאי אפיתל לעומת תאי סיבים מובחנים.

בידוד RNA מאפיתל עדשת עין של עכבר ומסות בתפזורת של תאי סיבים

למד כיצד לכמת חומצות גרעין במיקרו-נפח באמצעות מערכות NanoDrop 2000 C ו-3,300. השיטה מאפשרת מדידות ישירות ופלואורומטריות עם נפח מדגם מינימלי של מיקרוליטר אחד בלבד.

NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

גלה סרטונים נוספים