שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) של החלבונים המתויגים הקרינה הקוצים הדנדריטים של נוירונים בהיפוקמפוס Cultured
April 16th, 2011
FRAP נעשה שימוש כדי לכמת את הניידות של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), מתויג חלבונים בתאים בתרבית. בדקנו את השברים הנייד / נייח של ה-GFP על ידי ניתוח שחזור אחוז הקרינה לאחר photobleaching. במחקר זה, FRAP בוצעה על עמוד השדרה של נוירונים בהיפוקמפוס.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את הניידות של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר על ידי מדידת ה-frap של החלבון באזור עניין. זה מושג על ידי טרנסקציה ראשונה, וקטור ה-EGFP בנוירונים בהיפוקמפוס של חולדות מתורבתות. הקלטת Fre הבאה מבוצעת בעמוד שדרה מעניין באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי Zeiss seven 10.
לאחר מכן ניתן לחשב את קצב ההלבנה באמצעות תוכנת Image J ו-GraphPad Prism. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את הניידות של EGFP בעמוד השדרה מנוירון היפוקמפוס מתורבת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. פרוטוקול זה פותח על ידי צ'אזן בשיתוף פעולה עם אני, רונלד פט, כמו גם יה, וואנג בהאר קישה, והמחבר הבכיר של המאמר המקורי, רוברט אול, שנפטר באוקטובר 2009.
אנו מקדישים את הסרטון הזה לזכרו. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הדינמיקה של חלבונים, כגון שיעור תחלופה של חלבון מעניין באזור מעניין. התחל הליך זה על ידי תרבית נוירונים היפוקמפיים של חולדות ביום 18 עוברי על צלחות תחתונות זכוכית מטק מצופות פולי דה ליזין 35 מילימטר ב-16 עד 18 ימים באמצעות ערכת טרנספקציה של יונקים Cal Foss לפני תחילת הטרנספקציה.
שמור את מדיום התרבות המקורי בצינור סטרילי של 15 מיליליטר לשימוש מאוחר יותר. מלאו כל צלחת של 35 מילימטר ב-1.5 מיליליטר של מדיום הנשר השונה של DOL eco 30 דקות לפני הטרנספקציה. לאחר מכן, שלב 10 מיקרוגרם של P-E-G-F-P-N DNA פלזמה אחד עם 12.4 מיקרוליטר של תמיסת סידן מולרית והבא את הנפח הכולל עד 100 מיקרוליטר עם מים סטריליים.
הוסף את תערובת ה-DNA DROPWISE ל-100 מיקרוליטר של שתי ערימות של מי מלח חוצצים. מערבולת המאגר לאחר הוספת כל טיפה. לאחר שנתנו לתערובת הסופית לשבת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, הוסיפו את תמיסת הדנ"א של המאגר לתאי העצב המודגרים ב-DMEM.
דגרו על הנוירונים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעה וחצי. לאחר הדגירה, הסר את המדיום המכיל סידן פוספט מכלי התרבות ושטוף את התאים ב-DMEM. חזרה על שטיפת ה-DMEM בסך הכל שלוש פעמים.
החלף את מדיום ה-DMEM במדיום התרבות המקורי לפני החזרתם לחממה. נוירונים משמשים לניסוי הפראק יומיים עד ארבעה ימים לאחר הטרנספקציה. כדי להתחיל, החלף מיד את מדיום התרבות בכלי התחתון מזכוכית 35 מילימטר בתמיסת Prewarm Tyro.
מיקרוסקופ קונפוקלי של Zeiss LSM 7 10 משמש לניסוי הפרק. מערכת מודול הטמפ' של Zeiss שומרת על הטמפרטורה, הלחות ואחוז הפחמן הדו חמצני של מערכת העבודה. ודא שמיכל הפחמן הדו חמצני מחובר ושבקבוק המים, המשמש לאיזון הלחות, מלא במים.
לאחר הגדרת המיקרוסקופ, מצא דנדריט בוגר שעבר טרנספטציה עם המטרה של 100x. אם התאים המועברים בצלחת דלילים, חפש תא רצוי עם המטרה 40x . לאחר מכן עבור למטרה של 100 x.
כדי לצלם תמונות, השתמש בזום אופטי פי חמישה וברזולוציה של 2 56 על 2 56 פיקסלים. לדמיין פיסת דנדריט קצרה עם מספר קוצים. כדי לצלם תמונות, השתמש במהירות נומינלית תשע, שלוקחת 0.5 שניות.
כדי לסיים סריקה, הגדר את חור הסיכה לשני מיקרומטר כדי לקבל פלואורסצנטיות חזקה. בעת צילום תמונות, נסה להשתמש בהעברת לייזר נמוכה, למשל, אחד עד 5%כדי למנוע הלבנת פוטו של התמונה כולה. לאחר מכן, בחר את עמוד השדרה המעניין עבור ניסוי זה.
קוצי פטריות בקוטר ראש עמוד השדרה של כמיקרומטר אחד נבחרים לביצוע ניסוי עטיפה. צלם חמש תמונות בקרה לפני ההלבנה, ולאחר מכן הלבין את עמוד השדרה המעניין 10 פעמים בשידור לייזר נומינלי של 100%צלם סדרה של תמונות מיד לאחר ההלבנה. יש להתאים את מרווח הזמן בהתאם לחלבוני מטרה שונים ועיצובי ניסוי שונים.
בניסוי זה, התמונות נלכדות כל שנייה למשך 15 שניות לאחר ההלבנה. לאחר מכן, שמור את התמונות כדי לנתח את הנתונים. פתיחת תמונות באמצעות תוכנת Image J יישר את ערימת התמונות באמצעות הכלי המיושר כך שעמוד השדרה המעניין לא יצוף ויישאר באותו מיקום.
בתמונה מדוד את עוצמת הקרינה היחסית של עמוד השדרה המבוקש, שהוא אזור שעבר טרנספטציה אך לא מולבן. מדוד את אזור הרקע בתמונות זמן-lapse עם כלי ניטור העוצמה לעומת הזמן של התמונה J.השתמש באזור שאינו פלואורסצנטי מכיוון שעקומת אזור הרקע מתאימה לעוצמת הפלואורסצנט עם משוואה מעריכית חד פאזית בתוכנת GraphPad Prism או תוכנה דומה אחרת. לבסוף, חשב את אחוז החלק הנייד והלא נייד של הקרינה. המוצג.
להלן מדידות השבר של פלואורסצנטיות EGFP בעמוד שדרה מנוירון היפוקמפוס מתורבת. אזור בקרת עמוד השדרה והרקע מסומנים, וראש החץ האדום מציין את זמן הלבנת התמונה. תמונות של אותו אזור צולמו לפני וב-0 1, 5, 10 ו-15 שניות לאחר הלבנת התמונה.
עקומות FRA של פלואורסצנטיות EGFP מוצגות לאורך תקופה של 15 שניות כאשר הנקודות על העקומות מייצגות את ה-FRA בכל שנייה. העקומות הותאמו על ידי משוואות מעריכיות חד-פאזיות. הקרינה הממוצעת לפני הפוטו-הלבנה נספרה כ-100%בניסוי זה, השבר הנייד הוא 87% והשבר הלא נייד הוא 13%A.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד את הניידות של חלבון מתויג GFP באמצעות טכניקת FRAPPE.
סקירה כללית
המחקר הנוכחי משתמש בהתאוששות פלואורוסצנטית לאחר פיזור צבע (FRAP) כדי להעריך את הניידות של חלבון פלואורוסצנטי ירוק משופר (EGFP) בנוירונים היפוקמפיים. על ידי ניתוח אחוז התאוששות הפלואורוסצנטיה, מוכמתים השברים הניידים והבלתי ניידים של EGFP, ומספקים תובנות לגבי דינמיקת החלבון בתוך קוצי נוירונים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירומדע
- ביולוגיה תאית
- מיקרוסקופיה פלואורוסצנטית
רקע
- FRAP היא טכניקה המשמשת לחקר דינמיקת החלבונים בתאים חיים.
- EGFP הוא סמן פלואורוסצנטי בשימוש נרחב למעקב אחר תנועת חלבון.
- המחקר מתמקד בנוירונים היפוקמפיים, אשר קריטיים ללמידה וזיכרון.
- הבנת ניידות החלבונים יכולה להאיר על תפקוד סינפטי ופלסטיות.
מטרת המחקר
- למדוד את הניידות של חלבונים מתויגי EGFP בקוצי נוירונים.
- לקבוע את השברים הניידים והבלתי ניידים של החלבון.
- לתרום להבנת דינמיקת החלבונים בסביבות נוירוניות.
שיטות ששימשו
- גידול נוירונים היפוקמפיים מעובריים של חולדות.
- טרנספקציה של נוירונים עם EGFP בשיטת סידן פוספט.
- ביצוע FRAP באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי Zeiss LSM 710.
- ניתוח נתונים שנערך עם תוכנות Image J ו-GraphPad Prism.
תוצאות עיקריות
- השבר הנייד של EGFP בקוץ היה 87%.
- השבר הבלתי נייד נקבע ל-13%.
- עקומות התאוששות הפלואורוסצנטיה הותאמו באמצעות משוואות אקספוננציאליות של שלב אחד.
- התוצאות מספקות תובנות לגבי דינמיקת מחזור החלבונים בקוצי נוירונים.
מסקנות
- FRAP היא שיטה יעילה לחקר ניידות החלבונים בנוירונים חיים.
- הממצאים משפרים את הבנתנו לגבי דינמיקת החלבונים בתפקוד סינפטי.
- מחקר זה יכול להוות בסיס למחקרים עתידיים על אינטראקציות חלבונים ופלסטיות סינפטית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of protein mobility in neuronal subcompartments is critical for de-risking early CNS target validation and understanding synaptic protein turnover. FRAP-based measurement of EGFP-tagged protein dynamics in dendritic spines provides predictive confidence for mechanistic studies and informs translational continuity in neurobiology-focused pipelines. This capability supports portfolio decisions by clarifying protein trafficking and turnover in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct quantification of protein mobility and turnover in live neuronal systems.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing mobile and immobile protein fractions in synaptic compartments.
- Provides functional readouts for target engagement and pathway interrogation in CNS models.
Screening & Assay Development
- Establishes validated imaging and analysis workflows for reproducible quantification of protein dynamics.
- Facilitates assay standardization through defined imaging parameters and quantitative recovery metrics.
- Enables downstream screening of modulators affecting protein trafficking or stability in neurons.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant neuronal models for translational biomarker development.
- Supports continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of synaptic targets.
- Provides quantitative endpoints for risk-adjusted advancement of CNS-targeted assets.
Pipeline & Workflow Integration
FRAP-based protein mobility analysis integrates into the discovery-to-preclinical continuum for CNS drug development, supporting both hypothesis testing and quantitative assay development.
- Discovery Biology: Quantifies protein turnover and trafficking, informing target validation and pathway mapping.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Provides mobile/immobile fraction data and recovery kinetics for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings in cultured neurons to preclinical models of synaptic dysfunction.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable workflow for protein mobility studies across CNS research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by quantifying protein dynamics in live neurons.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis protocols for reproducible, scalable data generation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying mechanistic underpinnings of synaptic protein turnover.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets based on quantitative mobility metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuronal culture, confocal microscopy, and quantitative image analysis.
- Demands access to high-resolution confocal imaging platforms and robust analytical software (e.g., ImageJ, GraphPad).
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data analysis workflows.
- Adaptation to other neuronal or non-neuronal systems may require protocol optimization.
- Photobleaching and imaging conditions must be carefully controlled to ensure data reliability.
