Assay Clonogenic: תאים חסיד

היי, שמי לום ואני עושה כעת את הדוקטורט שלי במכון הלב והסוכרת של BE IDI בהנחייתו של ד"ר טום קאריאן, ראש המעבדה לרפואה אפיגנומית. בסרטון זה, אדגים את ההליך המכונה Clon Genic Survival Assay. זוהי טכניקה בת 50 שנה, המאפשרת להעריך את ההשפעה של טיפולים שונים כגון חשיפה לקרינה או חומרים כימיים על כדאיות הרבייה התאית.

בדיקת הישרדות קונגנית היא טכניקה מרכזית בביולוגיה של קרינה להערכת הרגישות לקרינה של קווי תאים שונים ובדיקת היעילות של תרכובות שונות להגנה על רדיו או רגישות לרדיו. בעת שימוש בקו תאים דבק A, בדיקת ההישרדות הקריוגנית מורכבת משלושה שלבים. ראשית, טיפול בשכבה מונו של תאים דבקים.

שנית, הכנת תרחיף וציפוי של תא בודד של מספר ידוע של תאים וכלים צבועים, ושלישית, צביעה, ספירה ומושבות שנוצרו לאחר תקופת דגירה. בסרטון זה, אשתמש בתאי אתר צ'ינו אנושיים אימורטליים כדי להדגים כיצד ניתן להשתמש במבחן תנ"ך פוליגני כדי לקבוע את תכונות ההגנה מפני הרדיו של נוגד החמצון הטבעי. 1225 M flas נזרעים של תאים בחמישה מיל מדיה לפני כן, כך שביום הניסוי יש מיליון תאים לכל בקבוק.

50 מיקרוליטר של התרופה מתווספים בריכוזים שונים לחמישה מילים של מדיה בכל בקבוק המסומן כראוי כדי להשיג את הריכוז הנדרש, נעשה שימוש בחמישה ריכוזים וכן בקרה אחת לרכב במקרה זה, PBS. לאחר הוספת התרופה, התאים מודגרים למשך שעה בתנאים המתאימים לקו התאים המשמש לאחר הדגירה. השטף, למעט קבוצת הביקורת, מוקרן במינון הנבחר, שבמקרה זה הוא ארבעה אפורים המיוצרים על ידי מקור צזיום הפולט קרני גמא.

לאחר ההקרנה, המדיה נשפכה וכל בקבוק נשטף בשני מיל PBS למשך חמש דקות. לאחר שפיכת ה-PBS מוסיפים שני מילים של 0.05% טריפסין לכל בקבוק כדי לנתק את התאים הדבקים A מהבקבוק. חמשת המיליליטר התחתונים של DMEM המכילים סרום בקר עוברי 10% מתווספים לכל בקבוק כדי לנטרל את הטריפסין.

התוכן המלא של ה-fasc מועבר לאחר מכן לצינורות בז מסומנים של 10 מיליליטר. לאחר השלמתם, צינורות אלה הם צנטריפוגה למשך חמש דקות, ולאחר מכן משליכים את הסופינטור בזהירות מבלי להפריע לחיך, ומוסיפים חמישה מיל של מדיה קרסי לכל צינור. ריכוז התאים עבור כל דגימה מחושב ENC כמו גם הנפח הדרוש של כל דגימה כדי להשיג ריכוז סופי של תאים שיצופו לחמש צלחות פטרי לדגימה עם חמישה מיליליטר מדיה כל אחת.

לדוגמה, עבור קבוצת הביקורת, 100 תאים מצופים לכל מנה, כך שהנפח הדרוש להשגת 500 תאים לכל 25 מיליליטר מחושב עבור דגימות מרוכזות יותר, לבצע דילול פי 10 או דילול סדרתי פי 100 כדי למזער את השגיאה הכרוכה בשימוש בנפחים של פחות מ-100 מיקרוליטר. כעת הנפח שחושב בעבר מוכן לתוך שפופרת פלקון המכילה 25 מיליליטר מדיה לכל דגימה. כעת ניתן להעביר את הדגימות לכלים שסומנו בעבר, ולהוסיף חמישה מיליליטר לכל מנה לטיפול והובלה קלים יותר.

אחסן את הכלים בכלי גדול, סטרילי או מחוטא. לאחר מכן מניחים את הכלים בחממה לחה בתנאים המתאימים ומודגרים במשך שמונה ימים. אם משתמשים בקרטינוציטים לאחר שמונה ימים, הוציאו בזהירות את הכלים מהחממה והניחו את כולם בזה אחר זה בתוך מכסה אדים.

הקפידו לטפל במקום בעדינות כדי שכל המושבות שנוצרו לא יופרעו. הסר את המכסים והוסף חמישה מ"ל של 0.9% מלח לכל כלי כדי לשטוף אותם. כוונו את קצה ההכנה לפינת המנה והימנעו מלגעת בתחתית המנה כדי שלא יגרדו בטעות מושבות.

לאחר חמש דקות, שאפו בזהירות את מי המלח. כעת, המושבות מקובעות בשלושה מיליליטר של פורמולה של 4%, ויש להחליף את המוליכים כדי למנוע אידוי. לאחר 15 דקות עד חצי שעה, הפורמולה נשאבת החוצה ונפטרת כראוי.

המושבות מוכנות כעת להכתמה ב 0.1% סגול קריסטל, חמישה מיליליטר מוסיפים לכל מנה והמכסים מוחלפים לאחר חצי שעה עד שעה. לאחר מכן שוטפים את הצבע במים מזוקקים והכלים הופכים ומניחים להם להתייבש למשך הלילה. המושבות מוכנות כעת לספירה.

ניתן לספור מושבות באופן ידני באמצעות מיקרוסקופ מנתח. כל אשכול תאים המכיל 50 תאים או יותר נחשב למושבה. ובזה מסתיימת ההדגמה שלנו של מבחן ההישרדות הקונגנית.

היתרון העיקרי של בדיקה זו על פני טכניקות אחרות הוא שהיא רגישה להפליא ויכולה לזהות הישרדות בטווח גדול גם לאחר שישה יומנים של הריגת תאים. זה, רגישות זו מושגת על ידי ציפוי מספרי תאים גדולים יותר. ניתן להשתמש במאמר זה בקלות למטרות אחרות, כגון בדיקה, כגון בדיקת ציטוטוקסיות.

תודה שצפית.