Name: Assay Clonogenic: תאים חסיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: למדו את שיטת המבחן הקלונוגני להערכת היכולת הרבייתית של תאים לאחר טיפולים בקרינה או בחומרים כימיים. שיטה זו חיונית בביולוגיית הקרינה לבחינת רגישות תאים ופיתוח תרכובות מגינות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

התמיכה של המכון האוסטרלי גרעיני מדע והנדסה הוא הודה. TCK היה זכה בפרסים AINSE. המעבדה לרפואה epigenomic נתמכת הבריאות הלאומי המועצה למחקר רפואי של אוסטרליה (566,559). HR נתמך על ידי אוסטרלי לתארים ופרסים BakerIDI ניצוץ בהיר. עבודה זו ממומנת על ידי ה-CRC עבור ביו הדמיה ופיתוח בע&quot;מ (CRC-BID), שהוקם ונתמך תחת שיתופית התוכנית של ממשלת אוסטרליה מחקר מרכזי. CO הוא חתן פרס האוסטרלי לתארים מתקדמים וכן מלגה CRC-BID משלים.

1. Cell התרבות ניסויית הקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרטינוציטים האדם מתוחזקים כמו monolayers ב 75 2 ס&quot;מ רקמות צלוחיות תרבות המכיל 15 מ&quot;ל של keratinocyte-SFM (K-SFM) בינוני (GIBCO, סרום ללא בינוני) בתוספת L-גלוטמין (2 מ&quot;מ), גורם הגדילה באפידרמיס (5 ng / mL), תמצית בלוטת יותרת המוח שור (40 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו - 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​גנטמיצין. התאים גדלים בסביבה CO humidified 5% 2 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הם זורעים לתוך 12 x 25 ס&quot;מ 2 רקמות צלוחיות תרבות המכיל 5 מ&quot;ל של מדיום K-SFM. </li></ol> המתלים תא יחיד מוכנים ידי trypsinization. תאים נשטפים עם פוספט שנאגרו מליחים מודגרות עם פתרון טריפסין / EDTA 0.05% למשך 5-10 דקות. כאשר התאים מתחילים להיות מעוגלות ~ 30% מנותקים, 3 כרכים של מדיום שונה נשר של Dulbecco המכיל 10% בסרום שור העובר הוא הוסיף לנטרל את טריפסין. התאים מנותקים ידי pipetting למעלה ולמטה (20 פעמים). תאים נספרים באמצעות hemocytometer. המספרים המתאימים תא זרע לפי זמן ההכפלה של הקו הסלולרי (כ 20 שעות אדם FEP-1811 קרטינוציטים). המטרה היא להשיג confluency ~ 90% (~ 10 6 תאים לכל בקבוק) ביום הניסוי. הניסוי המורכב 12 צלוחיות הוא אופטימלי עבור assay clonogenic יחיד (שישה לשלוט unirradiated שש צלוחיות מוקרן) אשר יכול להסתיים כארבע שעות. 2. טיפול הקרנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את התאים לזמן מתאים עם תרכובת קרינה שינוי רלוונטי לחשוף את התאים לקרינה מייננת או γ-קרינה או קרני רנטגן. </li></ol> בדרך כלל six צלוחיות לשמש יעילות ציפוי (מטופל) בקרות סמים בלבד. אחרים שש צלוחיות הם מוקרן. בדוגמה זו קרטינוציטים אדם מטופלים עם ריכוז שונים של Cinnulin PF (ע.מ.; בריאותיים Integrity הבינלאומי, ספרינג היל, טנסי, ארה&quot;ב, נציג נתונים עבור 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​מוצג להלן), נוגד חמצון מסיס במים ניסוח טבעי, במשך שעה 1 בשעה 37 ° C. תאים הם מוקרן עם 4 Gy באמצעות מקור 137 Cs (Gammacell 1000 irradiator עלית; Nordion הבינלאומי, על, קנדה; 1.6 Gy / min). 3. ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הטיפול, השעיות תא בודד מתקבלים כמתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר תאים מדגם זה נספרות בקפידה באמצעות hemocytometer ומדולל כך מספרים תא המתאימים seeded לתוך בצלחות פטרי (חמישה משכפל של כל 15 מנות מ&quot;מ). יעילות ציפוי ו / או לשרוד צריך להיות חלק הצפוי כאשר מחליטים את מספר התאים זרע לכל צלחת. המטרה היא להשיג מגוון רחב של בין 20-150 מושבות. </li> צלחות פטרי מסודרים תיבת שיבוט humidified פלסטיק מודגרות בסביבת 5% CO 2 ב 37 ° C להקמת המושבה. </ol> זמן הדגירה של היווצרות במושבה משתנה בין 1-3 שבועות של שורות תאים שונות, מקובל כי הזמן חייב להיות שווה לפחות שש חלוקות. בדוגמה זו, את הכלים לשלוט על קרטינוציטים אדם דורשים שמונה ימים כדי ליצור שיבוטים מספיק גדול בהיקף של 50 תאים או יותר. 4. תיקון ו מכתים המושבות השלם את השלבים הבאים ברדס קטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בעדינות את התקשורת מכל אחד הלוחות על ידי שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל צלחת עם 5 מ&quot;ל סליין 0.9%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן המושבות עם 5 מ&quot;ל פתרון נייטרלי 10% פורמלין שנאגרו במשך 15-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם סגול עם 5 מ&quot;ל גביש 0.01% (w / v) ב DH 2 O עבור 30-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף סגול קריסטל עודף עם DH 2 O ולאפשר מנות לייבוש. </li></ol> 5. במושבה ספירת Stereomicroscope <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבות המכילים יותר מ 50 תאים בודדים נספרים באמצעות stereomicroscope. </li></ol> הדמיה דיגיטלית ועוד היד נטויה באמצעות תוכנת הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות דיגיטליות של המושבות מתקבלים באמצעות מצלמה או מכשיר סריקה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבות נספרים באמצעות ניתוח הדמיה חבילות תוכנה כמתואר להלן. </li></ol> תא ספירה באמצעות ImageJ (פיג&#39;י גרסה 1.44a) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ התמונה בפיג&#39;י, ללכת קובץ -&gt; פתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך להמיר את התמונה לפורמט 8-bit, עבור Image -&gt; התאם את סף ...-&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם סף כדי להפחית את רמות הרקע הלא ספציפית כך שרק מושבות מזוהים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת מושבות באמצעות הפעולות הבאות: ללכת תהליך - בינארי&gt; -&gt; מצא את מקסימום. </li></ol> עבור פורמט התמונה, סובלנות רעש יכול להיות מוגדר 0. ודא כי האפשרות רקע האור מסומנת לצפות בתצוגה מקדימה של מקסימום זוהה כדי לבדוק שכל מושבות תאים נרשמו כהלכה.

<ol><li>Puck, T. T., Marcus, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+x-rays+on+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Action of x-rays on mammalian cells.</a> J Exp Med. 103, 653-666 (1956).</li>
<li>Hurlin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בדוגמה זו האדם FEP-1811 קרטינוציטים טופלו בריכוזים שונים של עד 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ע.מ., הנתונים הראו על 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ע.מ. שעה 1 ב 37 ° C. תאים בעקבות הטיפול היו מוקרן עם 4 Gy באמצעות מקור 137 Cs (Gammacell 1000 irradiator עלית; Nordion הבינלאומי, על, קנדה; 1.6 Gy / min). בשביל לשלוט על טיפולים רק מטופל סמים 100 תאים היו מצופה בכל צלחת פטרי ו 1000 תאים לכל תבשיל היו מצופה עבור דגימות מוקרן. כפי שניתן לראות בטבלה לעיל, מושבות נספרו באמצעות stereomicroscope או תמו...

<table><tbody><tr><td>מצע לתרבית קרטינוציטים ללא סרום (Keratinocyte-serum free medium)</td><td>מצע גידול</td><td>Invitrogen</td><td>17005042</td><td>מועשר ב-2mM L-glutamine, 20&amp;#x03BC;g/ml gentamicin, epidermal growth factor, ותמצית בלוטת פיתומוס בקר (bovine pituitary extract).</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>0.05% trypsin / EDTA לניתוק תאים נצמדים; תמיסת אם בריכוז 10x מדוללת ב-PBS ללא Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified essential medium</td><td>מצע גידול</td><td>Invitrogen</td><td>11885-084</td><td>מועשר ב-10% FBS ו-20&amp;#x03BC;g/ml gentamicin; משמש לנטרול של trypsin/EDTA.</td></tr><tr><td>סליין 0.09%</td><td>תמיסה</td><td></td><td></td><td>משמש לשטיפת מושבות.</td></tr><tr><td>תמיסת פורמלין 10% במאזן ניטרלי (Neutral buffered formalin solution)</td><td>תמיסה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>~4% formaldehyde; משמש לקיבוע מושבות.</td></tr><tr><td>קריסטל ויולט (Crystal violet)</td><td>אבקה</td><td>SPI Supplies</td><td>02577-MB</td><td>תמיסת crystal violet בריכוז 0.01%, המוכנה ב-dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, משמש לצביעת מושבות.</td></tr><tr><td>מקרין Gammacell 1000 elite</td><td></td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחיות פטרי</td><td>60 x 15 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td></td><td>Hawksley; Medical and Laboratory Equipment</td><td>AC1000</td><td></td></tr><tr><td>קופסת שיבוט</td><td></td><td></td><td></td><td>קופסת פלסטיק עם חורים מחוררים בצדדים מנוגדים של המכסה; לאחסון צלחיות פטרי במהלך אינקובציה ממושכת להיווצרות מושבות.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>דגם 102</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>משמש לספירת מושבות המורכבות מ-&amp;gt;50 תאים.</td></tr></tbody></table>

assay clonogenic: תאים חסיד

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Assay (או מושבה להרכיב) clonogenic הוקם במשך יותר מ 50 שנים; את הנייר המקורי המתאר את השיטה פורסמה בשנת 1956 1. מלבד המתעדים את השיטה, את המחקר ציון דרך הראשוני שנוצר כבר בסיבוב הראשון קרינה במינון התגובה רנטגן מוקרן (הלה) בתאי יונקים בתרבות 1. ביסודו של דבר, assay clonogenic מאפשר הערכה של ההבדלים הכדאיות הרבייה (יכולת של התאים לייצר צאצאים, כלומר תא בודד להקים מושבה של 50 תאים או יותר) בין לתאי קבוצת הביקורת תאים שעברו טיפולים שונים כגון חשיפה כדי מייננת קרינה, תרכובות כימיות שונות (סוכני ציטוטוקסיות למשל) או במקרים אחרים מניפולציה גנטית. Assay הפך את הטכניקה המקובלת בביולוגיה קרינה כבר בשימוש נרחב להערכת רגישות לקרינה של שורות תאים שונות. יתר על כן, assay clonogenic נפוץ לניטור יעילות של תרכובות קרינה שינוי ו לקביעת ההשפעות של סוכני ציטוטוקסיות אחרות נגד סרטן ותרופות על היכולת להרכיב המושבה, שורות תאים שונות. ניסוי טיפוסי הישרדות clonogenic חסיד באמצעות קווי תאים כוללת שלושה מרכיבים נפרדים, 1) טיפול monolayer התא צלוחיות בתרבית רקמה, 2) הכנת תרחיפים תא יחיד ציפוי המספר המתאים של תאים בצלחות פטרי ו -3) תיקון ו מכתים המושבות לאחר תקופת דגירה רלוונטי, אשר יכול לנוע בין 1-3 שבועות, בהתאם לקו הסלולרי. כאן אנו מדגימים את הנוהל הכללי לביצוע assay clonogenic עם שורות תאים חסיד עם השימוש של קו תאים אנושיים הנציח keratinocyte (FEP-1811) 2. כמו כן, המטרות שלנו הן כדי לתאר תכונות משותפות של מבחני clonogenic כולל חישוב יעילות ציפוי שברים ההישרדות לאחר חשיפה לקרינה של תאים, וכדי להדגים שינוי בתגובה קרינה עם השימוש ניסוח נוגדי חמצון טבעיים.

תחולתה של assay clonogenic להערכת הכדאיות הרבייה הוקם עבור יותר מ -50 שנה. כאן אנו מדגימים את הנוהל הכללי לביצוע assay clonogenic עם תאים חסיד.

Assay Clonogenic: תאים חסיד

בדיקת היכולת להיווצרות מושבות (clonogenic assay) הוקמה לפני יותר מ-50 שנה; המאמר המקורי המתאר את הטכניקה פורסם בשנת 19561. ...

שלום, שמי לום ואני כעת בשלב הדוקטורט שלי במכון BE IDI Heart and Diabetes, תחת השגחתו של ד"ר Tom Carianne, ראש מעבדת הרפואה האפיגנומית. בסרטון זה, אדגים את ההליך המכונה Clonogenic Survival Assay. זוהי טכניקה בת 50 שנה, המאפשרת להעריך את ההשפעה של טיפולים שונים, כגון חשיפה לקרינה או לחומרים כימיים, על החיוניות הרפרודוקטיבית של תאים.בדיקת הישרדות קונגנית (Congenic survival assay) היא טכניקה מרכזית בביולוגיה של קרינה להערכת הרגישות לקרינה של שורות תאים שונות, ולבדיקת היעילות של תרכובות שונות להגנה מפני קרינה (radioprotective) או לרגישות לקרינה (radiosensitizing). כאשר משתמשים בשורת תאים הדבקים (adherent cell line), בדיקת ההישרדות הקריוגנית מורכבת משלושה שלבים. ראשית, טיפול בשכבה אחת (monolayer) של תאים הדבקים.שנית, הכנת תרחיף תאים בודדים וזריעת מספר ידוע של תאים בצלחות צביעה, ושלישית, צביעה, ספירה ובדיקת המושבות שנוצרו לאחר תקופת דגירה. בסרטון זה, אשתמש בתאי cino site אנושיים מומסים כדי להדגים כיצד ניתן להשתמש בבדיקת polygenic Bible כדי לקבוע את תכונות ההגנה מפני קרינה של נוגד חמצון טבעי. מראש זורעים תאים ב-25 מיליליטר בקבוקי T-flask ב-5 מיליליטר מצע גידול, כך שביום הניסוי יהיה מיליון תאים לכל בקבוק.מוסיפים 50 µL מהתרופה בריכוזים שונים לחמישה מ"ל של מצע בכל בקבוק מסומן בהתאם כדי להשיג

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זה פרוטוקול וידאו מדגים כיצד להפלות ו למנות בתום תאים בתום גזע עצביים באוכלוסייה מעורבת של תאים עצביים מבשר באמצעות assay עצביים המושבה יוצרי התא.

עצבית, המושבה יצירת Assay נייד: Assay להפלות בונה תאים בתום גזע עצביים מן ובתאים עצבית

פרוטוקול זה הוא פשוט assay הידבקות חיידקים המורכב לספור את המספרים של המושבה חיידקי הקמת יחידות כי הם דבקו על תאים בתרבית. Assay היא חזקה, עצמאית של adhesin למד, וכן וריאציות רבות משמשים ברוב המעבדות עובדים על הפתוגנזה חיידקי.

ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

סרטון זה מתאר את בדיקת היווצרות המושבה, המסייעת לקבוע את יכולתם של תאי סרטן הריאה להתרבות ללא הגבלת זמן וליצור מושבות בודדות. אנו יכולים לנתח את ההשפעה של סוכן אנטי-סרטני על התאים יוצרי המושבה על ידי ניתוח השינויים במספר ו / או בגודל של המושבות המתקבלות.

בדיקת היווצרות מושבה: הערכת היעילות של חומרים אנטי-סרטניים על תאי סרטן ריאה יוצרי מושבה

בסרטון זה אנו מבצעים בדיקה קלונוגנית של קרטינוציטים שנקצרו מעכברים בוגרים כדי לקבוע את יכולתם של תאים בודדים להתרבות וליצור מושבות. טכניקת קצירת קרטינוציטים זו שימושית לחקר היבטים אחרים במורד הזרם של קרצינוגנזה כימית עורית וקידום גידולים.

בדיקת היווצרות מושבות קרטינוציטים: בדיקת מבחנה להערכת יכולתם של קרטינוציטים לגדול למושבות

פיתחנו מודל מבחנה של תרדמה במח העצם עבור תאי סרטן שד רגישים לאסטרוגן. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את השימוש במודל לחקר הביולוגיה המולקולרית והתאית של תרדמה וליצירת השערות לבדיקה עוקבת in vivo.

<em&gt; במבחנה</em&gt; תרדמת דגם של סרטן השד רגיש לאסטרוגן במוח העצם: כלי ללימודי מנגנון מולקולרי והשערת דור

תאי גזע עצביים (NSCs) להתייחס לתאים אשר יכול עצמית לחדש ולבדל לשלוש השושלות עצביות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לקבוע תדירות המל"ל באוכלוסיית תא נתונה באמצעות neurosphere היווצרות והבחנה בתנאים משובטים.

ספירת בתאי גזע עצביים באמצעות מבחני המשובטים

אנו מתארים שיטת תיוג יציב של xenografts נגזרות החולות (PDXs) עם חלקיקי lentiviral להביע כתבי חלבון בלוציפראז ירוקים-ניאון. שיטה זו מאפשרת מעקב צמיחת PDXs המצוי באתר הראשי, כמו גם באיתור גרורות ספונטניות ניסיון באמצעות במערכות הדמית vivo.

תיוג של xenografts הנגזר חולה סרטן השד עם כתבים לעקיבים עבור צמיחת גידולים וגרורים מחקרים

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד keratinocytes עוריות מן העור העורבי של עכברים מבוגרים עבור מגוון של יישומים במורד הזרם כגון ביולוגיה מולקולרית, ביוכימיה, מיון תא מופעל פלואורסצנטית, ו העיקרי בשימוש בלתי מתורבת (למשל, clonogenic keratinocytes).

בידוד של העכבר Keratinocytes באפידרמיס ושלהם בתרבות הclonogenic של מבחנה

המיקוד הפרמקולוגי של תעלות יונים הוא גישה מבטיחה לטיפול בגידולים מוצקים. פרוטוקולים מפורטים ניתנים לאפיון תפקוד תעלות היונים בתאים סרטניים ולהערכת ההשפעות של אפנון תעלות יונים על כדאיות הסרטן.

בדיקת תעלות יונים בתאים סרטניים

ייצור ואימות של פלטפורמת התוספת על המציע שליטה משופרת על חמצון במרחב ובזמן בצלחת 6 באר. המכשיר להתאמה מספר מערכות התרבות יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של חמצן על ריפוי הפצע.

ייצור והפעלת הוספת חמצן עבור תרבויות נייד חסיד

למדו את שיטת המבחן הקלונוגני להערכת היכולת הרבייתית של תאים לאחר טיפולים בקרינה או בחומרים כימיים. שיטה זו חיונית בביולוגיית הקרינה לבחינת רגישות תאים ופיתוח תרכובות מגינות.

Assay Clonogenic: תאים חסיד

גלה סרטונים נוספים