דפוסים על תאים שקוף אופטית טין אלקטרודות תחמוצת אינדיום

שלום, אני אישה. אני סטודנטית לתואר שני בשנה השנייה במעבדה של ד"ר Zen. אנחנו נמצאים כאן במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת קליפורניה דייוויס.

היום אדגים לכם את הבקרת יונים על אלקטרודות של אינדיום-בדיל- 산 산 oxide (Indium tin oxide) שקופות אופטית ומיוצרות במיקרו-פבריקציה. במאמצים של הנדסת רקמות ושיקום, נעשו ניסיונות לחקות את המיקרו-סביבה של האיבר. כדי ליצור מיקרו-סביבה זו במעבדה (in vitro), חיוני לבודד תאים באופן מרחבי וזמני על גבי תשתית. אנו מעוניינים לתכנן משטחים שבהם נוכל לשלוט במיקום של סוגים שונים של תאי כבד.

בניסוי של היום, נשתמש בשינוי פני שטח, במיקרו-פבריקציה (microfabrication) ובאלקטרוכימיה כדי ליצור משטח שניתן להפוך ממצב שאינו מאפשר הידבקות תאים למצב המאפשר הידבקות תאים. השלב הראשון הוא פוטוליתוגרפיה. להלן תרשים זרימה של אופן ביצוע התהליך.

הכחול הוא זכוכית המנורה, והירוק הוא אינדיום 10 תחמוצת המצופה על גבי זכוכית המנורה. ראשית, נבצע ציפוי סיבוב (spin coat) של פוטו-רזיסט אדום, כפי שמוצג כאן, על גבי זכוכית המנורה המצופה באינדיום 10 תחמוצת. לאחר מכן, נעביר זאת דרך מסכת צילום (photo mask) לחשיפה לאור אולטרה-סגול, והאזורים שנחשפו יפותחו בתוך תמיסת פיתוח.

אזורי ה-ITO שאינם מוגנים על ידי פוטורזיסט יוסרו בתהליך חריטה (etching). ולבסוף, כל שאריות הפוטורזיסט יוסרו באצטון כדי ליצור את אלקטרודות ה-ITO שלנו. להלן תרשים הזרימה של שלושת השלבים הנותרים.

ראשית, נשנה את כל פני השטח באמצעות peg cylin. פעולה זו תהפוך את פני השטח לבעלי תכונות non-fouling, כך שתאים או חלבונים לא ייקשרו אליהם. לאחר מכן, נשתמש באלקטרוכימיה כדי לספוג באופן ספציפי peg cylin משתי האלקטרודות שהכנו קודם לכן.

ולסיום, נדגור פיברובלסטים על פני השטח והם נקשרו באופן סלקטיבי רק לאזורי הפסים. כעת אנו מוכנים להתחיל בניסוי. השלב הראשון כולל פוטוליתוגרפיה, שתתבצע בחדר נקי.

כעת נכנס אל החדר הנקי. אנחנו נמצאים כעת בחדר הנקי שלנו. לפני שנתחיל בניסוי, נחמם את הדגימות המצופות באינדיום טיניום אוקסיד (indium tin oxide) או ITO בתנור בטמפרטורה של 200 °C.

בדרך זו נוכל לייבש את כל השטחים שלנו. לאחר אפייה ב-200 C, נניח את התבנית על מכשיר ה-spin tech ונחיל את הפוטורזיסט (photo resist). לאחר ייבוש מצע ה-ITO, ניקח אותו ונניח אותו על הצ'אק (chuck) של ה-spin tech.

סנדן זה גדול בדיוק מספיק כדי להחזיק רבע מנורת זכוכית. לאחר מכן, נפעיל ואקום. אחרי כן, נחיל פוטורזיסט בעל טון חיובי על התשתית.

לאחר מריחת הפוטו-רזיסט (photo resist), אנו ממשיכים לביצוע הפעולה. תהליך זה כולל שני שלבים: השלב הראשון הוא הפריסה, והשני הוא ציפוי סחרור (spin coating) בשלב הפריסה.

הצ'אק מסתובב במהירות של 800 RPM, ובכך הוא מפזר את הפוטורזיסט באופן אחיד על פני כל השטח. עם זאת, השלב הבא הוא שלב הסבב, המתבצע במהירות של 4,000 RPM, ובמהירות זו נוצרת שכבה דקה מאוד. ב"דקה" אני מתכוון לכ-one microns.

אם נפרק את המילים photo (פוטו) ו-resist (רזיסט), נקבל "פוטו" ו"רזיסט". החומר מופעל על ידי אור. לכן, אנו עובדים בחדר נקי ומשתמשים בתאורה מסוננת, כדי שה-photoresist שלנו לא יופעל על ידי האור. החומר עמיד בפני חומצות, תכונה שבה נשתמש מאוחר יותר בתהליך התסריג (etching).

כעת, לאחר שסיימנו את ציפוי הספין (spin coating) והפוטורזיסט נמצא על פני השטח, אנו נוציא את הדגימה ונמשיך לשלב הבא. לאחר אפיית הדגימה למשך דקה אחת ו-45 שניות, נסיר אותה מהלוח החם ונניח אותה במקשר המסכות (mask aligner) של Cannon. בשלב זה ניקח את המסכה הדרושה ונמקם אותה מעל התשתית, כדי ליצור הדפסה במגע (contact printing) בין התשתית עם הפוטורזיסט לבין המסכה; נניח מעליה פרוסת זכוכית (wafer) בקוטר 4 אינץ' כדי להוסיף משקל.

לאחר שסיימנו בכך, נחזיר את התריס למקומו ולאחר מכן נחשיף את הדגימה לאור UV. עם סיום החשיפה, נסיר את המכסה בסדר הפוך. נוציא את פרוסת הזכוכית, נוציא את המסכה, ולאחר מכן נסיר את התשתית ונעביר אותה לשלב הפיתוח.

לאחר חשיפת הדגימה, אנו מניחים אותה בתמיסת פיתוח. כאשר הדגימה נחשפה לאור UV, נוצרו יוני מימן, אשר נוטרלו על ידי הבסיס ובתמיסת הפיתוח והוסרו בפועל מהפני השטח. לכן, בעת עיבוד הדגימה, יש לוודא שהמצע נערנער ללא הרף.

כאשר תעשו זאת, תוכלו לראות בערך בדקה הראשונה או בדקה וחצי הראשונה, שהאזורים החשופים אכן התפתחו והוסרו מהפני השטח. אך כדי שתתרחש פיתוח מלא, נניח לדגם להישאר בתמיסת הפיתוח למשך כחמש דקות. לאחר השלמת הפיתוח, נוציא את הדגם, נשטוף אותו ב-di water ולאחר מכן נייבש אותו באמצעות אקדח חנקן.

לאחר ייבוש הדגימה, נעבירה אותה לצפייה תחת המיקרוסקופ. כאן אנו בוחנים את הדגימה תחת מיקרוסקופ, מיד לאחר הוצאתה מהפיתוח שנמשך חמש דקות.

ניתן לראות כאן שני אזורים, אזור כהה יותר המכוסה ברזיסט פוטו (photo resist) ואזור בהיר יותר שבו הרזיסט פוטו הוסר. ביחס למסכה שבה השתמשנו קודם לכן, האזורים הכהים על המסכה הם האזורים הכהים שאנו רואים כעת תחת המיקרוסקופ, בעוד שהאזורים השקופים שאנו רואים כאן היו שקופים על המסכה. אחד העיצובים המוצגים כאן הוא פשוט מערכים בגדלים שונים הנעים מ-500 ועד 50 µm, בעוד שהעיצוב השני מורכב מעיגולים של 1000 µm המחוברים ביניהם.

כאן אנו רואים עיצוב שונה שיוצר באמצעות אותו הליך. כאן יש לנו אלקטרודות שניתן להפעילן באופן פרטני. כוונתי היא שאזורים שונים של ITO מקושרים ביניהם וניתן להפעילם באופן שונה.

לדוגמה כאן, האזורים המעגליים המרכזיים מחוברים למסרה חשמלית אחת, בעוד שהאזורים המלבניים החיצוניים ביותר מחוברים למסרה חשמלית אחרת. באופן זה אנו יכולים להפעיל גירוי לשני השטחים השונים הללו בנקודות זמן שונות. לאחר בחינת הדגימות שלנו, השלב הבא שאליו אנו עוברים הוא תגיית הדגימה.

כל האזורים שאינם מוגנים על ידי התמונות יסורו בתהליך תעיית ITO. לפני כן, עלינו לוודא שאנו לובשים ביגוד מתאים, מכיוון שתעיית ITO כוללת חומצות. כעת, לאחר שלבשתי את חלוק ההגנה מחומצות והצבתי את מגן הפנים, אשפוך מעט תמיסת תעיית ITO לתוך כלי זכוכית.

תמיסת התסבוב של ה-ITO מורכבת מ-20% hydrogen chloride, 5% nitric acid, והשאר הוא DI water. לאחר מכן, העבירו את הדגימה והניחו אותה בתוך תמיסת התסבוב. קודם לכן, במיקרוסקופ, ראינו כי היו אזורים שלא היו מוגנים על ידי photoresists.

החומצות בתהליך התקיצה של ה-ITO תקפו את האזורים הללו וגרמו להסרת ה-ITO מהם. ככל שה-ITO מתכלה לאט מהפני המשטח, צבעו משתנה. כאן ניתן לראות כי הצבע השתנה מהגוון הכחלחל שהיה לו במקור לגוון סגלגל, וכעת הוא עובר לגוון צהוב.

שינוי הצבע מעיד על כך ששכבת ה-ITO נחרטת. כעת הגענו ל-15 דקות. כל ה-ITO נחרט לחלוטין.

מה שאתם רואים כעת בתמונות הם אזורי ITO מוגנים. לאחר השלמת התהליך של התעייה (etching), נותרות חומצות על פני השטח. כדי להסיר חומצות אלו, נניח את הדגימה בתמיסת נתרן פחמתי (sodium carbonate), שתנטרל את כל החומצה.

לאחר נטרול החומצות, נוציא את הדגימה, ננקה אותה עם DI water ולאחר מכן נייבש אותה בעזרת חנקן. בכך סיימנו את תהליך התעתוק בחומצה. אין יותר חומצה, ואני יכול להסיר את חלון המגן.

נוציא את הדגימה, נעביר אותה ונבצע ויזואליזציה תחת המיקרוסקופ. כעת אנו צופים בדגימה תחת המיקרוסקופ. זהו המצב לאחר ביצוע תהליך ה-ITO etching.

במקרה זה, האזורים הכהים הם אזורי זכוכית שבהם ה-ITO הוסר בתהליך תעייה (etching). והאזורים הבהירים הם ה-ITO שמוגן על ידי פוטו-רזיסט במקרה זה. שוב, אלו הם המערכים מ-500 עד 50 מיקרון, ובמקרה השני יש לנו עיגולים מחוברים שגודלם אלף מיקרון כל אחד.

כעת, לאחר שהשקפנו במיקרוסקופ וראינו כי קיימים אזורי זכוכית ואזורי ITO, כאשר אזורי ה-ITO מוגנים על ידי פוטורזיסט (photoresist), עלינו להסיר את הפוטורזיסט. לשם כך, ניקח את התשת, נטবিল אותה באצטון, ולאחר מכן נניח אותה במכשיר הסוניקציה ונבצע סוניקציה למשך 10 דקות.

פעולה זו מבטיחה את הסרת כל הפוטו-רזיסט; ניתן להשתמש בטכניקות של פיתוח לבדו, אך שימוש במקלול אולטרסוני, המשתמש בגלי קול להפגעה, מבטיח כי הפוטו-רזיסט יוסר באופן תקין. לאחר ההוצאה מהמקלול האולטרסוני, הדגימה נשטפת ב-DI water, מיובשת שוב בחנקן, וכעת ניתן לראות את התבניות בבירור על מצע הזכוכית. אלו היו התבניות שהוגנו בתחילה על ידי הפוטו-רזיסט.

כעת, לאחר שבחנו את הדגימות שלנו ומצאנו או יצרנו את תבניות ה-ITO, נתחיל בשלב השני של הניסוי. שלב זה כולל שינוי של פני השטח באמצעות שכבה מולקולרית בודדת המרכיבה את עצמה (self-assembled monolayer) של PEG cycline. אך לפני כן, עלינו לוודא שפני השטח הם רב-תגובתיים.

כדי לעשות זאת, נניח את הדגימה במכשיר לניקוי בפלזמה. פעולה זו מחדירה קבוצות הידרוקסיל לפני השטח וכך הופכת אותם למגיבים. לשם כך, פשוט נניח את הדגימה במכשיר לניקוי בפלזמה ולאחר מכן נפעיל את משאבת הוואקום.

אנו מפעילים את החמסן, ומפעילים את אספקת הכוח הראשית. כוח זה משמש להמרת גז החמסן לפלסמה, אשר מוזנת למערכת ובכך יוצרת את חריצי ההידרוקסיל. לאחר הפעלת הכוח, נלחץ על כפתור ההפעלה (start).

כעת, לאחר השלמת התהליך, אנו מוציאים את התשתית, מאחסנים אותה בתוך צלח, יוצאים מהחדר הנקי, מסירים את לבוש המגן ועוברים לשלב הבא. כעת, לאחר שיצאנו מהחדר הנקי והשלמנו את דפוסי האידיאל, אנו נבצע שינוי למשטח שדפסנו באמצעות פוליאתילן גליקול סילין, הידוע כ-PEG Cylin. חשוב לדעת ש-PEG Cylin מגיב ללחות.

לכן, כל פרי עץ שבו אנו משתמשים חייב להיות נטול לחות. כלי הזכוכית שבהם השתמשנו כאן, פטריות הפטרי, הוכשרו בתנור בטמפרטורה של 100 °C למשך לילה שלם. גם התולואן שבו נשתמש כממס הוא אנहाइडרי.

הוא אינו מכיל לחות. לכן, כעת אני שופכת טולואן אנहाइडרמני (anhydrous toluene) לשני כלי הזכוכית הללו, שאחד מהם מכיל את הדגימה שלנו. כעת עלינו להשתמש בשתי צלחיות פטרי, כיוון שבאחת מהן נבצע את המודיפיקציה.

ואת השני נשתמש בו מאוחר יותר, לאחר סיום המודיפיקציה, כדי לשטוף את התשתית שלנו. לאחר ההנחה בתוך צלחות הזכוכית, אני פשוט אקח אותן ואעביר אותן לתא השער (airlock) כאן בתוך תא הכפפות. לאחר סגירת תא השער, נכניס חנקן לתוך התא.

כעת, התא הראשי כבר מלא בחנקן. לכן, איננו רוצים לפתוח את התא הזה אלא אם כן הוא מלא בחנקן. ברגע ששני התאים מלאים בחנקן, נעביר את כל הדגימות שלנו באמצעות פפטה.

יהיו ברשותנו פיפטה ומלקחיים שבהם נשתמש בהמשך להעברת הדגימות. נלבש את הכפפות, נפתח את התא ונשלוף לאט ובזהירות את כל הציוד שנמצא במנעול האוויר ונניח אותו בתא הראשי. זוהי צלחת פטרי עם התשתית שלנו וצלחת פטרי המכילה toluene בלבד, שבה נשתמש לשטיפה.

ה-pxi שנמצא כאן נארז תחת חנקן, ואין לפתוח את הבקבוק אלא אם כן אתם נמצאים בסביבת חנקן. לכן, ברגע שתרצו להוציא את הדגימה, החזירו אותה לשקית. הוציאו את הצילינדר; הריכוז שבו נשתמש הוא 2% ב-toluene.

כעת מוציאים אותו, מכניסים אותו לתוך ה-Toin ומערבבים. נערבב גם בתוך התא ונוודא שהתערובת הומוגנית, ולאחר מכן נשאיר את הדגימה להדגרה ב-Toin למשך שעתיים. כעת, לאחר שעברו שעתיים והדגימה הייתה ב-Pxi, נוציא את הדגימה ונעבירה לתוך תמיסת Toin טרייה לצורך שטיפה קצרה, נניע אותה קלות, ואז נעבירה לתא ה-airlock.

ברגע שהדגימה נמצאת בתא מנעול האוויר שלנו, נפתח פשוט את התא, נוציא את המשטח שעבר שינוי ונדחף אותו באמצעות אקדח חנקן. נניח אותו שוב בצלחת פטרי נקייה ויבשה, ולאחר מכן נכניס אותו לתנור בטמפרטורה של 100 °C למשך שעתיים נוספות. כעת, לאחר שהדגימות נאפו בתנור ב-100 °C למשך שעתיים, ניקח ונחבר את החוטים לאלקטרודות שהכנו.

אנו עושים זאת על ידי הכנת תערובת ביחס של אחד ለአחד של אפוקסי כסף וסוכן הקשיה. זהו אפוקסי הכסף, וכעת נוסיף לתוכו כמות שווה של סוכן הקשיה. עלינו לערבב זאת היטב, ולאחר מכן נשתמש בתערובת כדי לחבר את החוטים שלנו.

אנו מניחים את התיל על האלקטרודות שבהן ברצוננו להשתמש ולאחר מכן מקבעים אותו. הלחמה אינה עובדת על ITO, ולכן עלינו להשתמש באפוקסי כסף ובחומר מעבדה (curing agent). לאחר מכן אנו מבצעים אפייה כדי להסיר את כל חומר המעבדה ששימש אותנו קודם לכן, כך שהחיבור יתקשה ונוכל להשתמש בו כאלקטרודה.

כעת, לאחר שסיימנו שני שלבים, נתחיל בשלב השלישי של הניסוי, שהוא ביצוע החלק האלקטרוכימי. לשם כך, ניקח דגימה ונניח אותה בתא האלקטרוכימי שלנו. לאחר הנחתה בתא האלקטרוכימי, נניח טבעת איטום (O-ring) מעליה.

פעולה זו תבודד את האזור שבו תתרחש האלקטרוכימיה, ולאחר מכן פשוט נאטום את התא. כעת הנחתי את הדגימה שלי עם החוט המחובר בתא האלקטרוכימי. אני מוכן להשתמש ב-potentiostat כדי להפעיל את המתח.

כעת, את החוט הלבן אני אחבר כאן לאלקטרודת הייחוס, את האדום לאלקטרודת העזר, ולבסוף את הירוק אני אחבר לאלקטרודת העבודה שלנו. לאחר שכל האלקטרודות הללו מחוברות, אני פשוט אוסיף תמיסה אחת של phosphate buffer saline או PBS לתא האלקטרוכימי. כעת, כדי להבהיר זאת, הדרך שבה זה יעבוד היא שכל השטח, נכון לעכשיו, מושבח באמצעות pxi.

כך שכל האלקטרודות, כולל אזורי הזכוכית שמסביבן, מmodified עם pxi. ברגע שאני מחיל את המתח בכל מקום שבו קיים ITO, שהם תכנוני האלקטרודות שיצרנו, אי ה-peg יסור רק מאותם שטחים, ושום דבר לא יושפע באזורים שמסביב. לפיכך, אנו מסירים באופן סלקטיבי את אי ה-peg מהמצע שלנו.

כעת אלחץ על כפתור ההפעלה, ובכך אחיל מתח של 1.4- וולט על אלקטרודת העבודה שלנו. עם הגעת המתח, ניתן להבחין בשינוי צבע על האלקטרודות. הצבע משתנה מהגוון הכחול-ירקרק השקוף שהיה לנו לחום.

אנו חושדים כי ייתכן שמתרחשת תגובת חמצון באלקטרודות הגורמת להן להפוך לחומות. זהו גם אחד האינדיקטורים לכך שה-pxi אכן הוסר מהפני השטח. ושוב, בכל מקום שבו נראה צבע חום, זהו המקום שבו ה-peg island הוסר.

ובאזורי הזכוכית מסביב עדיין מורכב PXI. לכן, אנו מחילים מתח של 1.4- וואט למשך 60 שניות. פעולה זו מספקת זמן מספיק להסרת כל ה-pxi שהיו נוכחים על האלקטרודות.

ניתן להשתמש בשיטה זו גם להסרה סלקטיבית של אלקטרודות הממוענויות באופן פרטני. במקרה זה, היו שלוש שורות של עיגולים המיועדות להסרה. אנו יכולים לבחור אילו מהם ברצוננו להסיר באמצעות שלוש האלקטרודות השונות.

כעת השלמנו בהצלחה את החלק השלישי של האלקטרוכימיה, שבו הסרנו באופן סלקטיבי את ה-PG siling מהאלקטרודות של ה-ITO. שטחתי אותן קצרה ב-PBS וב-DI water, הסרתי את התיל והנחתי את הדגימות בפלטות רגילות בעלות שש בארות. כעת נמשיך לגידול תאים על אלקטרודות אלו.

כעת אנו נמצאים בחדר תרביות הרקמה. לשלב הסופי של הניסוי, נשתמש היום בפיברובלסטים, תאי 3T3. הריכוז שבו נשתמש לזריעת התאים הוא בין 0.5 ל-1.5 מיליון תאים למיל.

לאחר זריעת התאים, נמתין כ-20 דקות כדי לאפשר לתאים להיקשר למדגם. זמן זה יאפשר להם להיקשר כראוי לאזורים שחולפו. לכן, נניח את המדגם באינקובטור.

כעת חלפו 20 דקות ואנו מוכנים לבחון את התאים שהתבססו על האזורים שבהם הוסר ה-ITO, האזורים החומים שראינו קודם לכן; התאים יקשרו באופן ספציפי רק לאותם אזורים ולא ייצמדו לשום מקום מחוץ להם. כאן ניתן לראות שהאזורים החומים היו אזורי ITO שמהם הוסר ה-pxi. באמצעות אלקטרוכימיה, התאים נצמדו רק לאותם אזורים חומים ולא לאזורי הזכוכית שסביבם.

בפריים אחר זה, שוב, אנו רואים תאים נצמדים לאזורים ששופשפו. אלו הם האזורים החומים, אך מעל האזורים החומים הללו ניתן בקושי לראות ש-PEG לא שופשף מה-ITO design הזה, ולכן לא נצמדו אליו תאים. אוקיי, זהו זה.

סיימנו את הפרוטוקול, והתאים יוצרים תבנית על אלקטרודות ה-ITO, וזה בדיוק מה שרצינו. הדגמתי בפניכם את הבקרת ההיצמדות של תאים על אלקטרודות שקופות אופטית של indium 10 oxide שיוצרו במיקרו-פבריקציה. היום הראיתי לכם כיצד ליצור תבנית של שלושה פיברובלסטים על אלקטרודות אלו.

השתמשנו באותו הליך גם כדי ליצור תבניות של תאי Hep G two, תאי לוויין ותאי רט ראשוניים. טכניקות תבניות תאים נוכחיות מאפשרות הרכבה של שני סוגי תאים בלבד על פני השטח. הגמישות של טכניקה זו תאפשר בעתיד הרכבה של סוגי תאים מרובים על פני השטח, המבודדים זה מזה מרחבית.

אנו מתכננים להשתמש בטכניקה זו כדי לבודד מרחבית שלושה סוגים שונים של תאי כבד על מצע ה-ITO, במטרה לדמות את המיקרו-סביבה in vivo. בדרך זו, נוכל לבודד מרחבית תאים לא בשלים או תאי גזע לצד תאים בשלים ותאי תמיכה. הדבר ייצור סביבה מכוונת שתאפשר לתאים הלא בשלים לגדול ולהתבדל.