Name: זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: למד שיטת הדמיה חיה של תאי קדם עצביים בפיתוח המוח הקדמי של דג הזברה באמצעות אלקטרופורציה ומיקרוסקופיית קונפוקל. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי התפתחות תאים בודדים ברמת שיבוטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי theNIH grantNS042626. אנו מודים קוץ קורט קליפורניה בסן פרנסיסקו ניקון הדמיה מרכז סיוע הדמיה.

1. הכנה של עוברים דג הזברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לפני electroporation, להקים כלובי דגים ההזדווגות של סוג בר באמצעות מחיצות כדי להפריד בין זכרים לנקבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני electroporation, למשוך את חוצצים ב ההזדווגות כלובים מן היום הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עוברים דגירה 50 עוברי מופרית בתווך העוברי המכיל 30 מ"ל phenylthiourea 0.003% (PTU) על 28.5 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום electroporation, dechorionate את העוברים באופן ידני עם מלקחיים קנס (Inox 5, דומון אלקטרונית, שוויץ), כאשר העוברים מגיעים לשלב ההתפתחותי של 22hpf. ואז להעביר את העוברים עד 3 10ml electroporation של הצלצול (180 mM NaCl, KCl 5 מ"מ, 1.8 מ"מ CaCl2, 5 pH Hepes mM 7.2) המכיל 0.003% PTU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 420 μl tricaine מניות (4mg/ml) כדי electroporation 10ml הצלצול של להרדים את העוברים. </li></ol> 2. הכנה electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחטים זכוכית זריקה נשלפו מן הנימים (1.2 מ"מ OD, 0.9 מזהה מ"מ, עם נימה) על Flaming-P897 חולץ בראון (סאטר מכשירים, Novato, קליפורניה, ארה"ב). קצה המחט נותק עם מלקחיים כדי לקבל סוף חדה כפי שמוצג 1D דמות. קוטר קצה צריך להיות סביב 10 מיקרומטר וזווית להתחדד צריך להיות סביב 30 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.8% ו -1% נקודת התכה נמוכה agarose (Shelton מדעיים, Inc קטלוג # IB70050) בתמיסה electroporation של הצלצול. Aliquot agarose פתרון 2 צינורות microcentrifuge מ"ל. שמור את aliquots בתוך גוש חום ~ 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המערכת Gal4/UAS משמש כונן ביטוי גנים ובתאים עצביים העוברים electroporated. שני פלסמידים משמשים: פלסמיד EF1α-GFF-PT2KXIG, שבו Gal4FF הוא מונע על ידי EF1α מקדם בכל מקום, ואת הפלסמיד כטב"מ-E1B-EGFP-PT2KXIG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן EF1α-GFF ו-PT2KXIG כטב"מ-E1B-EGFP PT2KXIG-DNA פלסמיד באמצעות GenEluteTM HP פלסמיד Midiprep Kit (Sigma). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמידים מרוכזים מכן על ידי משקעים נתרן אצטט / אתנול בריכוז הסופי של 1-2 מיקרוגרם / μl ב 10 mM טריס · Cl (PH 8.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את שני פלסמידים לדלל עם nuclease ללא H2O לריכוז סופי של 500 ng / μl עבור כל פלסמיד. תוספת של פנול אדום (בדילול מלא 1 / 10 הנפח הכולל) לפתרון היא המועדפת עבור להדמיה של הלידה. שמור את פתרון ה-DNA על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממש לפני, electroporation backload מחט הזריקה עם פתרון ה-DNA 2 μl לכוונן את עוצמת הזריקה עד 2 nl. </li></ol> 3. Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ לנתיחה stero (STEMI Zeiss 2000 עם הגדלה מקסימלית של 50x), מזרק בלחץ אוויר (Narishige IM microinjector 300), שני micromanipulators (WPI M3301R, מכשירים Precision העולם, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב), וכן גירוי חשמלי (SD9 רבוע ממריץ הדופק, דשא Tlefactor, מערב וורוויק, רוד איילנד, ארה"ב) מוגדרים כפי שמוצג באיור 1 א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להר עוברים, לטבול 2 עוברים 1% נקודת התכה נמוכה agarose. מיד לאחר מכן להסיר את העוברים מן agarose עם פיפטה זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים על מכסה פלסטיק צלחת פטרי הפוכה בטיפות בודדות של agarose. להתמצא עוברים בעדינות עם בדיקה סיבים למצב הגבי-up לפני agarose מבצרת כך forebrain נגיש הן אלקטרודות מחט microinjection (איור 1B). עוברים חייב להיות מותקן בתוך agarose טיפות בודדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפעל את האלקטרודות עם micromanipulator שמאל. הכנס את האלקטרודות לתוך agarose כפי שמוצג באיור 1 ב. אישית אירידיום ופלטינה מקביל אלקטרודות דו קוטבית 125 מיקרומטר בקוטר 500 מיקרומטר ברווח מזה משמשים electroporation (fhc, קטלוג # PBSA0575). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט microinjection לתוך החדר forebrain ו להזריק תערובת DNA 4nl, כמו זורם נוזל אדום את הנפיחות של החדר ניתן להבחין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד, אחת 28.5 V הדופק לאורך 1 אלפית השנייה יושמה באופן ידני. ואז להפוך את הקוטביות וליישם עוד 28.5 V הדופק לאורך 1 אלפית השנייה. זה יגרום תיוג פסיפס הבילטרליים של תאים עצביים forebrain אבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר electroporation של 10 עוברים, מוסיפים 5 מ"ל בינוני עובריים כדי לכסות את העוברים ואת הקליפה agarose עם סכין microsurgical לשחרר את העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים electroporated לצלחת טרי בינוני 30 מ"ל עובריים המכיל 0.003% PTU ו לדגור על 28.5 ° C. </li></ol> 4. הרכבה ו - זמן לשגות הדמיה חיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבות 4 שעות לאחר electroporation, האות EGFP הוא הנצפה אם מתחת למיקרוסקופ לנתח epifluorescent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמש שעות לאחר electroporation, בחר את העוברים עם פסיפס מאוד אך ביטוי EGFP חזק באזור המוח הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים שנבחרו בינוני עובריים המכיל 10 מ"ל PTU 0.003%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 420 μl tricaine מניות (4mg/ml) ועד עוברי 10ml בינוני to להרדים את העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להר עוברים, לטבול 1 העובר ב 0.8% נקודת התכה נמוכה agarose. ואז להסיר לאלתר את העובר מן agarose עם טפטפת זכוכית במקום העובר על במרכזה של צלחת זכוכית 35mm התחתונה תרבות (MatTek תאגיד, חלק # P35GC-1.5-10-C, <a href="http://www.glass-bottom-dishes.com/">www.glass-bottom-dishes.com</a> ) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמצא עוברים בעדינות עם בדיקה סיבים למצב הגבי-up לפני agarose מתמצק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת כראוי על הבמה טמפרטורה מבוקרת של המיקרוסקופ confocal כפי שמוצג באיור 1C (אנו משתמשים במיקרוסקופ C1 Nikon confocal ספקטרלי עם עד הימנית יעדים). כוונו את הטמפרטורה ל 28.5 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3ml 28.5 ° C בינוני עובריים שחומם מראש המכיל 0.003% PTU כדי לכסות את העובר. העובר מוכן כעת הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו זמן לשגות הדמיה לחיות עם מרווח קבוע באמצעות טבילה במים אובייקטיבי. </li></ol> 5. נציג תוצאות שמוצג באיור 2 נבחרות מסגרות של הדמיה זמן לשגות חי confocal של העובר electroporated של EF1α-GFF + כטב"מ-E1B-EGFP ב hpf 22. <img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. Apparatus הגדרת. (א) הרכבה של ציוד electroporation: גראס SD9 מרובע ממריץ הדופק (i), micromanipulator שמאל (ii), האלקטרודות (iii), Zeiss הניתוחים מיקרוסקופ (iv), המחט להזרקת (v), את הזכות micromanipulator (vi) ו-IM Narishige microinjector 300 (ז). (ב) המיקום היחסי של אלקטרודות (i), את החדר forebrain (ii) את מחט הזריקה (iii). הערה הפתרון אדום בצבע DNA כבר מוזרק לתוך החדר forebrain. (ג) הרכבה של הדמיה לחיות מיקרוסקופ C1 Nikon confocal: בקר טמפרטורה (i), טבילה במים אובייקטיבי len (ii) את העובר electroporated מוטבע נקודת התכה נמוכה agarose בתוך צלחת תחתית תרבות זכוכית (ג) (ד ' ) תמונה של מחט משך וחותכים עבור microinjection של ה-DNA. <img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. תמונות נבחרות של הדמיה זמן לשגות 18 שעות לחיות confocal של העובר electroporated עם EF1α-GFF + כטב"מים-E1B-EGFP hpf ב 22. משטח החדר נמצא בצד התחתון של כל מסגרת התמונה. בר סולם מייצג 10 מיקרומטר.

<ol><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414, 112-117 (2001).</li>
<li>G#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 777-788 (2005).</li>
<li>Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+DNA%2C+RNA%2C+and+morpholinos+into+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos.</a> Methods. 39, 207-211 (2006).</li>
<li>Hendricks, M., Jesuthasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+methods+for+in+vivo%2C+whole+mount+and+primary+culture+analysis+of+zebrafish+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development.</a> Neural. Dev. 2, 6-6 (2007).</li>
<li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol. Biol. 546, 145-151 (2009).</li>
<li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish%3A+a+new+tool+to+study+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את שיטת הדמיה זמן לשגות חיים של ובתאים עצביים ברמה המשובטים בקידמתו דג הזברה מתפתח. בדקנו ולשנות את הפרוטוקולים הקיימים electroporation 4-6 כדי גנטית fluorescently בודדים תווית תאים עצביים אבי. עץ היוחסין מורכב clonally התאים הצאצאים הקשורים ניתן לקבוע כי רק מספר תאים תויגו בדלילות עם מתח נמוך יחסית של electroporation. בנוסף EGFP, התאים ובתאים עצביים יכול להיות מתויג subcellularly פשוט על ידי החלפת EGFP עם סמנים ניאון אחרים עם חלבוני ניאון שוני...

זמן לשגות הדמיה חיה של related clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

דפוסים מדויקים של הגירה החלוקה, ואת הבידול של ובתאים עצביים חיוניים להתפתחות המוח תקין 1,2 לתפקד. כדי להבין את ההתנהגות של ובתאים עצביים במתחם בסביבה vivo, זמן לשגות הדמיה חיה של ובתאים עצביים במוח שלם נדרש אנושות. בסרטון זה, אנו מנצלים את התכונות הייחודיות של עוברי דג הזברה כדי לחזות את התפתחותם של תאים עצביים forebrain אבי in vivo. אנו משתמשים כדי electroporation גנטית בדלילות הפרט תווית תאים עצביים אבי. בקצרה, בונה DNA המקודד סמנים ניאון הוזרקו החדר forebrain של 22 שעות שלאחר ההפריה (hpf) עוברי דג הזברה פולסים חשמליים נמסרו מיד. שש שעות מאוחר יותר, עוברי דג הזברה electroporated היו רכוב עם נקודת התכה נמוכה agarose בתרבות צלחות זכוכית התחתונה. שכותרתו fluorescently ובתאים עצביים הם צילמו אז עבור 36hours עם במרווחי זמן קבועים תחת מיקרוסקופ confocal באמצעות טבילה במים העדשה אובייקטיבי. השיטה הנוכחית מספק דרך להשיג תובנות בפיתוח vivo של תאים ובתאים forebrain עצביים יכול להיות מיושם על חלקים אחרים של מערכת העצבים המרכזית של העובר דג הזברה.

הסרטון הנוכחי מדגים שיטה אשר מנצל שילוב של electroporation ו מיקרוסקופיה confocal לבצע הדמיה לחיות על הפרט ובתאים עצבית forebrain דג הזברה מתפתח.<em&gt; ב-vivo</em&gt; ניתוח של התפתחות של תאים עצביים forebrain אבי ברמה המשובטים יכולה להיות מושגת בדרך זו.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

דפוסים מדויקים של חלוקה, נדידה ודיפרנציאציה של תאי אב עצביים הם קריטיים להתפתחות ותפקוד תקינים של המוח1,2. כדי...

מטרת הניסוי הבא היא לתבחון את ההתפתחות in vivo של תאי אב עצביים בודדים במוח הקדמי, באמצעות דימות חי בשיטת time-lapse של עוברים של דגי זברה. דבר זה מושג על ידי אלקטרופורציה של מבני DNA המקודדים לסמנים פלואורסצנטיים, המסמנים תאי אב עצביים במוח הקדמי הממוקמים במרווחים דלילים. העוברים שעברו אלקטרופורציה הרדמו, קובעו באגרגרוז בעל נקודת התכה נמוכה ודוממו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בשיטת time-lapse.התוצאות מראות את ההתפתחות in vivo של תא מקור עצבי מסוים במוח הקדמי. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ההתפתחות InVivo של תאי מקור עצביים במוח הקדמי. ניתן ליישמה גם באזורים אחרים של מערכת העצבים המרכזית, כגון קליפת המוח, הגומול והחוט השדרתי.היתרון העיקרי של שיטה זו על פני שיטות קיימות, כגון הזרקת DNA או RNA בשלב התא הבודד, הוא שהיא פונה בדיוק לאתר העניין הרלוונטי בכל נקודת זמן התפתחותית נתונה. פרוטוקול זה מתחיל ביום שלפני האלקטרופורציה המתוכננת. בבוקר, אספו 50 עוברים מופרית מדגי zebrafish שהזדווגו, טבלו את העוברים בתווך עוברים המכיל phenyl thiourea או PTU, והדגירו את העוברים הטבולים למשך 22 שעות בטמפרטורה של 28.5 °C למחרת.בשעה ה-22 לאחר ההפריה, העוברים מוכנים לאלקטרופורציה. התחילו בציפוי ידני של העוברים באמצעות פינצטה עדינה. העבירו את העוברים המצופים ל-10 milliliters של תמיסת רינגר לאלקטרופורציה המכילה PTU, כדי להרדימם.הוסיפו 420 µL של תמיסת מלאי Trica בריכוז של 4 mg/mL לתמיסה. העוברים מוכנים כעת לאלקטרופורציה; הכינו את מחטי ההזרקה הדרושות לאלקטרופורציה. משכו קפילרות זכוכית ושברו את קצותיהן בעזרת פינצטה כדי ליצור קצה חד ב-0.2 בנקודת התכה נמוכה.יש צורך גם בתמיסות Agro, הכוללות תמיסה בריכוז 1% המומסת ב-electroporation ringers, ותמיסה בריכוז 0.8% במדיום עוברי (embryonic medium) לצורך קיבוע. יש לחלק את שתי תמיסות ה-agro השונות למבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח של שני מיליליטר ולהחזיקן מוכנות בבלוק חימום בטמפרטורה של כ-37 °C. פרוטוקול זה משתמש במערכת GAL4 UAS להנעת ביטוי גנים בתאי אב עצביים.נעשה שימוש בשני פלסמידים, כאשר אחד מבטא באופן גלובלי את GAL4 וזה השני מבטא GFP בתגובה ל-GAL4. שני הפלסמידים הוכנו באמצעות ערכות מוכנות ורוכזו לריכוז של בין 1 µg ל-2 µg ל-µL באמצעות שיטת שיקוע של נתרן אצטט ואתנול בתמיסה של 10 mM Tris-HCl. לאחר קביעת ריכוז הפלסמידים, יש לדלל את שני הפלסמידים לתמיסה אחת באמצעות מים נקיים מנוקלאז לריכוז של 500 ng ל-µL.בריכוז זה, הם ידורגו יחד כדי להמחיש את הולכת התמיסה, וצבע אותה בפנול אדום בריכוז 10% מנפח התמיסה הכולל. התמיסה מוכנה כעת לאלקטרופורציה ויש להניחה על קרח. מערך האלקטרופורציה מורכב ממיקרוסקופ סטריאואופטי לדיסקציה עם הגדלה מקסימלית של 50 x.המתקן מצויד במזרק בלחץ אוויר, שני מיקרו-מניפולטורים וסטימולטור חשמלי. האלקטרודה במיקרו-מניפולטור השמאלי כוללת אלקטרודות ביפולריות מקבילות מפלטינום-אירידיום בהתאמה אישית; מיד לפני האלקטרופורציה, טענו את מחט ההזרקה מהצד האחורי עם 2 µL של תמיסת DNA וכווננו את נפח ההזרקה ל-4 nL. מהשלב הזה ואילך, הפרוטוקול דורש תרגול כדי להגיע לשלימות; לצורך ההרכבה, טבלו והוציאו מיד שני עוברים מתמיסת agarose ב-1% עם נקודת התכה נמוכה.בעזרת פיפטית זכוכית, העבירו כל אחד מהם לטיפת agros נפרדת על הפלטפורמה או בתוך צלחת עם טיפה. השתמשו בסיב גשש כדי להכווין בעדינות את העוברים למנח שבו הצד הגבי פונה כלפי מעלה לפני שה-agro מתמצק. פעולה זו תהפוך את המוח הקדמי לנגיש הן עבור האלקטרודות והן עבור מחט המיקרו-הזרקה.חזור על תהליך זה עד שכל 10 הטיפות יכילו את כל העוברים שהוכנו. הכנס את האלקטרודות לתוך ה-aeros והכנס את מחט המיקרו-הזרקה לתוך פרוזנצפליקול (חדר המוח הקדמי). כעת, הזרק 4 nanoliters של תערובת ה-DNA.שימו לב לזרימה ועקבו אחר נפיחות החדר. ברגע שנצפה נפיחות, גרמו לשני פולסים של 0.5 volt למשך מילישנייה אחת כל אחד. ארבעה פולסים אלו צריכים להינתן בקוטביות הפוכה.התוצאה היא סימון פסיפסי ביליטרלי של ארבעת התאי הגזע העצביים במוח. כעת הוצא את מחט ההזרקה מהמוח הקדמי והזז את הבמה לעובר הבא. חזור על תהליך ההזרקה והאלקטרופורציה בכל אחד מהעוברים הנותרים.לאחר ביצוע אלקטרופורציה לכל 10 העוברים, שפכו חמישה מיליליטר של מצע גידול עוברי מעל העוברים כדי להעבירם. קלפו את ה-aros באמצעות סכין מיקרו-כירורגית והעבירו אותם לצלחת נקייה המכילה 30 מיליליטר של מצע גידול עוברי. לפני הדמיה, דגרו את העוברים בטמפרטורה של 28.5 °C למשך כארבע שעות, ארבע שעות לאחר האלקטרופורציה.ניתן להבחין באות ה-EGFP. אם התצפית תתבצע תחת מיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי (epi fluorescent) שעה אחת או חמש שעות לאחר האלקטרופורציה, יש לבחור עוברים עם ביטוי EGFP חזק אך פסיפסי מאוד באזור ה-brainin. העבר את העוברים שנבחרו ל-10 milliliters של מצע והרדם אותם על ידי הוספה של 420 microliters של תמיסת stockp של trica בריכוז של four milligrams per milliliter.הדימות יבוצע על במה עם בקרת טמפרטורה של מיקרוסקופ קונפוקאלי, המצויד בעדשות אובייקטיב אנכיות. הכינו את המיקרוסקופ על ידי קביעת טמפרטורת הבמה ל-28.5 °C. כמו כן, חממו מראש מצע גידול עוברי ל-28.5 °C.כדי להרכיב עובר, השתמשו בפיפטת זכוכית כדי לטבול אותו לזמן קצר ב-aros והניחו אותו במרכזו של כלי תרבית עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מילימטר. באמצעות גשש סיב, כוונו בעדינות את העוברים למצב שבו הגב פונה כלפי מעלה לפני שה-agro מתמצק, וכסו אותם בשלושה מיליליטר של מדיום שחומם מראש. העובר מוכן כעת לדימות חי בשיטת time-lapse במרווחי זמן קבועים באמצעות עדשת טבילה במים; כאן מוצגות תמונות קונפוקאליות ב-time-lapse של תא אב עצבי אחד.באמצעות שיטה זו, אנו יכולים לצפות בתא זה נודד ומתחלק פעמיים בין 28.5 ל-41.5 שעות לאחר ההפריה. על ידי מזעור הספק הלייזר והחלפת מצע הגדילה של העובר, ניתן להמשיך לצלם תמונות למשך עד 60 שעות לאחר ההפריה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן ביצוע אלקטרופורציה לתאי פרוגניטורים עצביים המסומנים גנטית ולצילומם בווידאו, וכן באופן הטיפול בעוברים שעברו אלקטרופורציה.עבור דימות TimeLapse במיקרוסקופ קונפוקאלי, לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע אלקטרופורציה זו בפחות משעה אם היא מבוצעת כראוי.

time-lapse-live-imaging-clonally-related-neural-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

מפתח להבנת תהליכים המוךפו"גנטי שהולך המעצבים את העובר המוקדם הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. אנו מתארים כאן טכניקה תיוג תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים עוברי דג הזברה שלם עם חלבון הממברנה ממוקד, פלורסנט ירוק.

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

בסרטון הזה, טכניקות הדמיה ססגוניות זמן לשגות confocal ו אבלציה תא ממוקד מסופקים. זמן לשגות הדמיה משמש כדי לפקח על התנהגותם של תאים מסוגים שונים של...

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

מקור: Williams, A. L., et al. הדמיית זמן-lapse מרובת פוטונים כדי להמחיש התפתחות בזמן אמת: הדמיה של תאי פסגה עצבית נודדים בעוברי דג זברה. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מציג פרוטוקול הדמיה מרובה פוטונים כדי לדמיין את הנדידה של תאי פסגה עצבית בעובר דג זברה בזמן אמת ברזולוציה גבוהה.

הדמיה של נדידת תאי פסגה עצבית בעובר דג זברה באמצעות הדמיית זמן-lapse מרובת פוטונים

confocal הדמיה זמן לשגות היא טכניקה רבת עוצמה שימושית לאפיון התפתחות עוברית. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ולאפיין המורפוגנזה craniofacial בסוג פראי, כמו גם PDGFRA, smad5, וSMO עוברים שעברו מוטציה.

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

שילוב של טכניקות אופטי מתקדם של סריקת מיקרוסקופ עם זמן עירור קרינה פלואורסצנטית פוטון מרובה אורך גל לייזר בוצע כדי ללכוד דימות ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של הרכס העצבי הגירה ב Tg (sox10:EGFP) ו- Tg (foxd3:GFP) דג זברה עוברי.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

ב vivo הדמיה היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי לחקור את המנגנונים הסלולריים בבסיס פיתוח מערכת העצבים. כאן אנו מתארים טכניקה לשימוש מיקרוסקופיה מיקוד הזמן כדי להמחיש מספר גדול של המוח ססגוניות באמצעות התווית בזמן אמת בתוך מערכת העצבים דג זברה המתפתח.

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

כאן אנו מציגים שיטה לדימוי המוח העוברי של דג הזברה בשלבים של זחלים ונוער. הליך מיקרו-פולשני זה, המותאם מגישות אלקטרופיזיולוגיות, מספק גישה לפרטים תאיים ותת-תאיים של נוירון בוגר וניתן לשלבו עם אופטוגנטיקה ומחקרים נוירופרמקולוגיים לאפיון תפקוד המוח והתערבות תרופתית.

In vivo הדמיה של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלי דגי זברה ערים וצעירים על ידי הסרת גולגולת ועור

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע הדמיית סידן של שני פוטונים במוח הקדמי הגבי של דגי זברה בוגרים.

הדמיית סידן דו-פוטון של פעילות המוח הקדמי בדגי זברה בוגרים

אנו מדגימים שיטה המנצלת סריקה מהירה של מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לבצע הדמיה חיה של תאי מיקרוגליה בטקטום האופטי המתפתח של דגי זברה, המאפשר ניתוח של הדינמיקה של תאים אלה in vivo.

הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה

למד שיטת הדמיה חיה של תאי קדם עצביים בפיתוח המוח הקדמי של דג הזברה באמצעות אלקטרופורציה ומיקרוסקופיית קונפוקל. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי התפתחות תאים בודדים ברמת שיבוטית.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

גלה סרטונים נוספים