Name: אצבע מקל דגימה דם מתודולוגיה לקביעת אפופטוזיס-תרגיל המושרה הלימפוציטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-24T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: למד שיטה מהירה ומינימלית פולשנית לניתוח אפופטוזיס לימפוציטים המושרה בתרגיל. השיטה משתמשת בדגימת דם מאצבע מקל וציטומטריית זרימה כדי לשפר את הדיוק במדידת תאי חיסון לאחר פעילות גופנית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי מענק הפקולטה חדש מהמועצה הפקולטה מלגות בבית המערבי אוניברסיטת קנטאקי.

1. Finger-Stick דם דגימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם נלקחת בדרך כלל כל למדידת קו בסיס (בדרך כלל לאחר 10-15 דקות מנוחה בישיבה), במהלך או מיד לאחר התקף התעמלות, לאורך כל התקופה שלאחר האימון במנוחה (בדרך כלל בין 1-3 שעות לאחר הפסקה של תרגיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אמצעי זהירות יוניברסל, קודם לחטא את האצבע עם אלכוהול איזופרופילי 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקב הבא, האתר באמצעות אזמל אוטומטיות או מכשיר דומה. למרות שאנו משתמשים 30-Lancet מד לספק לנוחות הנושא, מחט מד גדול יכול להיות מנוצל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנגב את טיפת הדם הראשונה, ולאחר מכן לאסוף דם לתוך צינורות או microvettes נימי שטופלו הפרין ליתיום כדי למנוע קרישה. </li></ol> 2. תא Phenotyping והכתים אפופטוזיס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μL דם כל heparinized ללוח נוגדן titred במאגר 250 מחייב μL (ראה טבלה 1 סכמטית). השתמשנו גורם לדילול 1:20 עם הצלחה, אבל כל מעבדה צריכה titre ריאגנטים שלהם כדי לקבוע את הפתרון הטוב ביותר לעבוד. 1. טבלת נוגדן פאנל להגדרה של אפופטוזיס התעמלות-Induced תת ליקוציט. אפופטוזיס מוקדם הוגדרה על ידי ביטוי של Annexin V, בעוד אפופטוזיס מאוחר הוגדרה על ידי תיוג חיובי כפול עם Annexin V ו-7-AAD. תאים נקרוטי היו Annexin V-7 ו-AAD + תאים בלבד. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Tube 1 </td><td> Tube 2 </td><td> Tube 3 </td><td> Tube 4 </td></tr><tr><td> תאים רק צינור </td><td> Annexin V - FITC </td><td> Annexin V - FITC </td><td> Annexin V - FITC </td></tr><tr><td></td><td> CD4 האדם האנטי - PE </td><td> נגד אדם CD8 - PE </td><td> נגד אדם CD19 - PE </td></tr><tr><td></td><td> 7-AAD </td><td> 7-AAD </td><td> 7-AAD </td></tr><tr><td></td><td> נגד אדם CD45RA - APC </td><td> נגד אדם CD45RA - APC </td><td></td></tr></tbody></table> 7-AAD = 7-אמינו actinomycin-D, APC = Allophycocyanin, CD4 = Helper לימפוציטים מסוג T, CD8 מדכא = / ציטוטוקסיות לימפוציטים מסוג T, CD19 = B לימפוציטים, CD45RA = תת תא נאיבי, FITC = isothiocyanate והעמסת, PE = Phycoerythrin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 1075 למשך 5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג, להוסיף 300 תא דם אדום μL הצפת תמוגה, וביסודיות מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 PBS μL להפסיק התגובה RBC תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 1075 למשך 5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג, מתלה, ולהוסיף 50 חיץ מחייב μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח על ידי cytometry הזרימה. </li></ol> מומלץ כי לכל הפחות, את הפקדים הבאים להיות מנוצל: תאים רק צינור לשמש מלאה שלילי באיתור autofluorescence רקע, וצינורות המכיל בנפרד fluorochrome לקבוע פיצוי במהלך הראשוני של cytometer להגדיר את הזרימה. בנוסף, השתמשנו תקן חרוזים פיצויים בהצלחה להגדיר ניסויים שלנו.

<ol><li>Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+does+not+contribute+to+the+blood+lymphocytopenia+observed+after+intensive+and+downhill+treadmill+running+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Res.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans.</a> Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).</li>
<li>Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exercise%2C+lymphocyte+apoptosis+and+F2-isoprostanes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).</li>
<li>Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+apoptosis+after+exhaustive+and+moderate+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise.</a> J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).</li>
<li>Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exercise+does+not+cause+lymphocyte+DNA+damage+or+increased+apoptosis+in+well-trained+endurance+athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).</li>
<li>Wang, J. -S., Huang, Y. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+exercise+intensity+on+lymphocyte+apoptosis+induced+by+oxidative+stress+in+men%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).</li>
<li>Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+apoptosis+of+lymphocytes+depends+on+training+status%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status.</a> Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).</li>
<li>Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+treatment+influences+the+yield+of+apoptotic+lymphocytes+after+maximal+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise.</a> Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אוסף פולשנית מדגם הליך ניתוח שלאחר מכן באה לידי ביטוי לניתוח שלבי בשלבים מוקדמים ומאוחרים של אפופטוזיס האימון המושרה לימפוציטים. ניתן גם בבירור לכלול תאים אלה, המהווים נמקי, ולא אפופטוטיים. הליך זה מתגבר על החסרונות ואי נוחות הקשורה venipuncture פולשנית מאזור antecubital בנקודות זמן רבות לפני, במהלך, מיד לאחר האימון, או הבטחת קטטר למשך התקף התרגיל. מבחינת החוקרים, נהלים כאלה בדרך כלל דורשים הכשרה מיוחדת phlebotomy, שלא כל אדם צריך. בנוסף, נושא גיוס ושימור צפויה להיות משופרת באמצעו...

<table><tbody><tr><td>בופר קישור לציטומטריית זרימה</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>בופר להמסת תאי דם אדומים (RBC Lysis Buffer)</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר דקירה</td><td>Accu Check Soft Touch</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות קפילריים</td><td>צינורות קפילריים עם הפרינה</td><td>Chase Scientific Glass, Inc.</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>GmC Lab</td><td>Gilson, Inc.</td><td>PMS-880</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC מצומד</td><td></td><td>Biovision Inc.</td><td>K201-400-1</td><td></td></tr><tr><td>CD4-PE מצומד</td><td>Anti-human, clone RPA-T4</td><td>eBioscience</td><td>12-0049-42</td><td></td></tr><tr><td>CD8-PE מצומד</td><td>Anti-human, clone OKT8</td><td>eBioscience</td><td>12-0086-73</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PE מצומד</td><td>Anti-human, clone HIB19</td><td>eBioscience</td><td>12-0199-42</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת צביעת חיוניות 7-AAD</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-6993-50</td><td></td></tr><tr><td>CD45RA-APC מצומד</td><td>Anti-human, clone HI100</td><td>eBioscience</td><td>17-0458-42</td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה</td><td>C6</td><td>Accuri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

אצבע מקל דגימה דם מתודולוגיה לקביעת אפופטוזיס-תרגיל המושרה הלימפוציטים

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

פעילות גופנית היא גירוי פיזיולוגי מסוגל גרימת מות תאים מתוכנת בתאי המערכת החיסונית. עד כה, מגבלות שונות זוהו עם המדידה של תופעה זו, במיוחד בנוגע למשך הזמן הנדרש כדי לבודד ולטפל דגימת דם לפני ההערכה של מוות של תאים. בגלל זה, קשה לקבוע האם עליות דיווח אפופטוזיס תא החיסון ניתן תרמו ההשפעה בפועל של פעילות גופנית על המערכת, או השתקפות של זמן עיבוד צורך בסופו של דבר להשיג את המדידה. במאמר זה אנו מדגימים הליך מהיר פולשנית לניתוח אפופטוזיס האימון המושרה לימפוציטים. שלא כמו טכניקות אחרות, דם כל מתווסף פאנל נוגדן מיד עם קבלת המדגם. לאחר תקופת הדגירה, כדוריות דם אדומות lysed דגימות מוכנים להיות מנותח. השימוש בנוהל אצבע מקל דגימה מקטין את נפח הדם הנדרש, מקטינה את אי נוחות לנבדקים.

תרגיל מסוגל גרימת מות תאים מתוכנת בתאי המערכת החיסונית. ישנן מגבלות מדידה שונים, בעיקר בנוגע לכמות הזמן הדרוש כדי לבודד ולטפל דגימת דם לפני האבחון. הפגינו הוא הליך מהיר פולשנית לניתוח אפופטוזיס האימון המושרה לימפוציטים.

פעילות גופנית היא גירוי פיזיולוגי המסוגל להשרות אפופטוזיס בתאי מערכת החיסון. עד כה, זוהו מגבלות שונות במדידת...

שלום, אני ג'יימס וולטה מתוכנית מדע הפעילות הגופנית במחלקה לקינסיולוגיה, פנאי וספורט באוניברסיטת Western Kentucky. מה שנעשה הוא להדגים לכם את הפרוטוקול שפיתחנו ואת הפרוטוקול שבו אנו משתמשים כדי למדוד אפופטוזיס של לימפוציטים המושרה על ידי פעילות גופנית. בואו נראה זאת.דגימת דם נלקחת באמצעות דקירה באצבע תוך נקיטת אמצעי זהירות אוניברסליים. קצה האצבע עובר סטריליזציה ולאחר מכן נדקר. טיפת הדם הראשונה נמחקת, ולאחר מכן הדם נשאב לתוך צינורות נימיים או מיקרו-בדים (micro beds).10 µL של דם מלא פופטטו לתוך פאנל נוגדנים המכיל פלואורוכרומים מתאימים לציטומטריה של זרימה, כולל Annexin V ו-7-AAD, CD4, CD8 או CD19 ו-CD45RA. בנוסף לשפופרת של תאים בלבד, השתמשנו בחרוזי קומפנסציה כביקורת כדי לסייע בהגדרת הניסויים שלנו. הדגימה מעורבבת היטב בוורטקס ולאחר מכן מודגרת בטמפרטורת החדר, בחושך, למשך 30 דקות. לאחר ההדגרה, הדגימות עוברות סנטריפוגציה למשך 10 דקות, ולאחר מכן הנוזל נשפך בתנועה אחת חלקה.מוסיפים 300 µL של בופר לליזת תאי דם אדומים ומערבבים את הדגימות היטב באמצעות וורטקס. חשוב מאוד שהדגימה ובופר הליזה יערבבו ביסודיות. כדי להקל על הסרה מקסימלית של תאי דם אדומים, תבחינו שהדגימה שלכם מתחילה להיות עכורה.אך לאחר דגירה של 15 דקות לפחות בטמפרטורת החדר, התמיס יתבהר ככל שתהיה ליזיס של תאי דם אדומים, ומוסיפים 300 microliters של phosphate buffered saline המשמש כתמיסת עצירה לסיום תגובת הליזיס. ולאחר מכן סובבים את הדגימות שוב בצנטריפוגה למשך 10 דקות. שימו לב שלאחר הליך הצנטריפוגציה, תתקבל משק של תאים בתחתית המבחנה; שפכו את הנוזל בתנועה חלקה אחת, וערבבו היטב ב-vortex כדי לערבב מחדש את התאים והתמיס.כעת הדגימה שלכם מוכנה לאניליזה באמצעות ציטומטריית זרימה. כאן אנו מציגים תרשימי פיזור מייצגים של פיזור קדימה (forward scatter) ופיזור צדי (side scatter) עם סינון (gating) לתתי-פרקציות של לימפוציטים, וזיהוי של תאים חיוביים ל-Annexin V בתוך תת-האוכלוסייה. כך תיארנו את המתודולוגיה שבה אנו משתמשים כדי לקבוע אפופטוזיס של לימפוציטים המושרה על ידי פעילות גופנית, ואנו סבורים כי קיימים יישומים רבים נוספים שניתן להוציא לפועל באמצעות מתודולוגיה זו.ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון כל סוג של תאי דם לבנים מלבד לימפוציטים ותת-תתי-סוגים של לימפוציטים. כמו כן, ניתן להשתמש בה למדידת כל סמן הנמצא על פני התא. לכן, אנו סבורים כי יש לשיטה זו יישומים רחבים יותר.

finger-stick-blood-sampling-methodology-for-determination-exercise

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Cell בתיווך (CML) מבחני lymphocytotoxicity ניתן להשתמש כדי לבדוק את התגובות autoreactive מנגנוני המחקר של מוות של תאים במבחנה. עם זאת, שימוש לחיות תאים confocal טכניקות הדמיה מיקרוסקופית עם צבעי ניאון, סוג קינטיקה של מוות של תאים, כמו גם את המסלולים מנוצל ניתן ללמוד ביתר פירוט.

שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות

סרטון זה מדגים את השימוש בבדיקת ELISpot כדי להעריך את תפקודם של תאי B מפרישי נוגדנים, ASC. הנוגדנים המופרשים על ידי ASCs אינטראקציה עם מקטעי נוגדנים רב-שבטיים הקשורים לקרום, אשר מזוהים על ידי נוגדני IgG או IgM מצומדים אנזים. הכתם הצבעוני שנוצר בכל באר מעיד על נוכחות איזוטיפ של הנוגדן הספציפי, אשר נמצא בקורלציה עם פעילות ההפרשה של תאי B.

הערכה תפקודית של תאי B מפרישי נוגדנים באמצעות בדיקת ELISpot

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה לגירוי לימפוציטים באמצעות המופילוס אינפלואנזה (NTHi) שאינו ניתן להקלדה ולהערכת התגובה החיסונית. דגירה של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים מבודדים (PBMCs) עם NTHi גורמת לתאי החיידק לעורר לימפוציטים מסוג T, מה שמוביל לייצור ציטוקינים. עם עיכוב הפרשת הציטוקינים, מבוצעת צביעה אימונופלואורסצנטית כדי לזהות את הציטוקינים התוך-תאיים שהצטברו בלימפוציטים T מגורים.

טכניקת מבחנה לגירוי לימפוציטים באמצעות חיידקים פתוגניים

מטרת הסרטון הזה היא להציג את טכניקת הביופסיה של שרירי השלד של ברגסטרום על נבדקים אנושיים.

נהלי ביופסיה של שריר שלד אנושי באמצעות טכניקת Bergstrom השתנה

מטרת כתב היד הזה היא להציג שיטה למדידת פגוציטוזיס מונוציטים וגרנולוציטים ופעילות פרץ חמצוני בדגימות דם אנושיות.

מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי

דם היקפי אנושי משמש בדרך כלל להערכת התגובה החיסונית ההומורלית. כאן, מתוארות השיטות לבידוד תאי B אנושיים מדם היקפי, התמיינות תאי B אנושיים לתאי B מפרישי נוגדנים (AB) (ASCs) בתרבית, וספירת סך ה-IgM וה-IgG-ASCs באמצעות בדיקת ELISpot.

הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים B מדם: ELISPOT בתור Readout פונקציונלי של חסינות הלחות

עבודה זו מתארת זרימת עבודה מתקדמת לקביעה מדויקת ומהירה של ספירת תאי NK (רוצח טבעי) וציטוטוקסיות של תאי NK בדגימות דם אנושיות.

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

חקר חילוף החומרים הופך רלוונטי יותר ויותר למחקר אימונולוגי. כאן, אנו מציגים שיטה אופטימלית למדידת גליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלית בטחול עכברים, ולימפוציטים T ו-B.

פרוטוקול אופטימיזציה כדי לנתח הגליקוליזה מיטוכונדריאלי הנשימה לימפוציטים

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל מספר דגימות דם הווריד antecubital במהלך אימון בעצימות גבוהה מרווח. פרוטוקול זה עשוי להיות שימושי עבור המידה של מטבוליטים דם, סמנים endocrinal במהלך פעילות גופנית.

הערכה של לקטט בדם, פלזמה אינסולין במהלך פעילות גופנית בעצימות גבוהה על ידי צנתור וריד Antecubital

כדי להעריך את ההשפעה של עצימות על התגובות הפיזיולוגיות, ביולוגיים, נוצלו שני פרוטוקולים בדיקה גופנית שונה. שיטות חלוקה לרמות תרגיל בבדיקות ergometer מחזור כמו מבחני צריכת חמצן מירבית מצטבר סיבולת, מתוארים מבחן הטעימה submaximal מצב יציב.

ביצוע תרגיל סיבולת מקסימלית וללא Submaximal בדיקה למדידת תגובות פיזיולוגיים וביולוגיים תרגיל חריפה אצל בני אדם

למד שיטה מהירה ומינימלית פולשנית לניתוח אפופטוזיס לימפוציטים המושרה בתרגיל. השיטה משתמשת בדגימת דם מאצבע מקל וציטומטריית זרימה כדי לשפר את הדיוק במדידת תאי חיסון לאחר פעילות גופנית.

אצבע מקל דגימה דם מתודולוגיה לקביעת אפופטוזיס-תרגיל המושרה הלימפוציטים

גלה סרטונים נוספים