Neuromodulation ותחבורה מיטוכונדריאלי: הדמיה חיה נוירונים בהיפוקמפוס פני משכי זמן ארוכים

המטרה הכללית של הליך זה היא להדמות את הובלת המיטוכונדריה בנוירונים בתרבית לאורך פרקי זמן ממושכים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של תאים חיים. דבר זה מושג תחילה על ידי סימון המיטוכונדריה בנוירונים בתרבית באמצעות חלבון פלואורסצנטי המכוון לאברון. השלב השני של ההליך הוא רכישת תמונות של הובלת המיטוכונדריה תחת תנאי בקרה.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא רכישת סדרות תמונות במשרה של זמן (time-lapse) של הובלה מיטוכונדריאלית לאחר מתן אקוטי של נוירומודולטורים כגון סרוטונין. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ביצוע ניתוח של סדרות תמונות ה-time-lapse שנרכשו. לבסוף, ניתן להשיג תוצאות המראות כי מוליכים עצביים מווסתים את ההובלה המיטוכונדריאלית.

תוצאות כאלה מושגות רק על ידי הדמיה של מיטוכונדריה המסומנות פלורוצנטית בנוירונים לאורך פרקי זמן ממושכים. היתרון המרכזי של שיטה זו על פני טכניקות קיימות, כגון סימון בצבע חי (vital dye) או טרנספקציה זמנית של GFP, הוא ששיטה זו מאפשרת ביצוע של תצפיות ארוכות טווח על הובלה מיטוכונדריאלית בנוירונים בריאים בתרבית. את ההליך זה תדגים Chen, עמיתה מחוקרת מהמעבדה שלי, על מנת לספק סביבה מחוממת ומלחחת באופן יציב.

האינקובטור המותקן מעל הבמה מחובר לאינקובטור סטנדרטי לתרביות רקמה באמצעות מעגל סגור; מכסה ממברנת A-P-F-T-E עבור צלחות תרבית מזכוכית בעלת תחתית בקוטר 35 מילימטר מאפשר חילוף גזים בין תרבית הנוירונים לבין הסביבה בתוך האינקובטור. יחד, תכונות אלו ואחרות מאפשרות תצפית ארוכת טווח בנוירונים בתרבית תחת תנאים ניסיוניים שונים. העבר את צלחת התרבית המכילה נוירונים מההיפוקמפוס, המבטאים את חלבון ה-mito turbo red, למנדף לתרביות רקמה.

החליפו את המכסה הפלסטי במכסה ממברנת PFTE והעבירו את צלחת התרבית למיקרוסקופ. הצמידו את בסיס האינקובטור למסבך המיקרוסקופ, ולאחר מכן מקמו בזהירות את צלחת התרבית המכוסה בממברנה. בפתח השקוע, יישרו את תא האינקובטור עם מוטות הפלדה בבסיס האינקובטור והורידו את התא אל הבסיס.

הדקו את הברגי הלשונית עד להשגת איטום טוב בין המארז לבסיס. הפעילו את בקר גלגל המסננים של המיקרוסקופ, את מקור האור ואת מצלמת ה-CCD לפני פתיחת תוכנת הדימות. בפרוטוקול זה, שקופית מספר חמש משמשת לרכישת תמונות.

עברו לעדשה עם הגדלה של 63x בשמן (oil immersion) והורידו את התושבת של העדשות. מרחו בזהירות שמן טבילה על פני השטח של העדשה. לחצו על סמל חלון הפוקוס בסרגל הכלים והדליקו את מנורת השדה הבהיר (brightfield) על ידי הזזת התקיד של המנורה.

כדי לכוון את עוצמת התאורה, השג פוקוס על שדה של תאים באמצעות העדשות העוקביות ואתר תא רלוונטי. בחר את המסנן XI three תחת לשונית המיקרוסקופ, אתר את מישור הפוקוס עבור המיטוכונדריה בתאים שסומנו עם חלבון mito turbo red, ולאחר מכן עבור למצלמת ה-CCD. לחץ על סמל לכידת התמונה בסרגל הכלים, החל מזמן חשיפה ראשוני של 100 milliseconds.

מצאו את החשיפה האופטימלית באמצעות כפתורי ה-test ו-find best בחלון הלכידה (capture window). בתיבת סוג הלכידה (capture type), סמנו את אפשרות ה-time-lapse ובחרו את מרווח ההדמיה הרצוי ואת משך סשן ההדמיה תחת אפשרויות הלכידה של ה-time-lapse.

התחילו ברכישת תמונות בשיטת time-lapse על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה (start) בפינה הימנית התחתונה של חלון הלכידה. לאחר לכידת סשן דימוי ביקורתי, הגשה של מוליכים עצביים או ריאגנטים אחרים דרך פתחי ההזרקה בחלקו העליון של האינקובטור שעל המבמה. עם הוספת האגוניסט לקולטן סרוטונין 8-OH-DPAT, מיטוכונדריה שעד כה הייתה סטטית (מסומנת בחץ) נעה לאורך האקסון של נוירון מההיפוקמפוס.

המהירות הממוצעת והכיווניות של מיטוכונדריה בודדות מסוכמות לפני הוספת סרוטונין. מרבית המיטוכונדריה הן סטטיות, עם זאת, לאחר הוספת סרוטונין, 42% מהמיטוכונדריה מראות כעת תנועה כיוונית ועוברות מרחקים גדולים יותר מאלו המראות תנועה כיוונית בהיעדר סרוטונין. לעומת זאת, עם הוספת דופמין, 92% מהמיטוכונדריה הן סטטיות ב-15 הדקות האחרונות של סשן הדמיה בעקבות הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות לניטור של יותר מאות של סיגנל אחד כדי לענות על שאלות נוספות. לדוגמה, כיצד קיימת קשר בין פעילות סידן לבין הובלה מיטוכונדריאלית בנוירונים.