Name: הקלטה נייד שלמים מן ההכנה פורסים Organotypic של הניאוקורטקס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: למדו הכנה ותחזוקה של פרוסות ניאוקורטקס בתרבית אורגנוטיפית להקלטות חשמליות מנוירונים פירמידליים בעכברושים. השיטה מאפשרת מניפולציות גנטיות וניתוח תכונות תפקודיות של תעלות יונים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות Mayumi Sakuraba ורבקה Foehring לקבלת סיוע טכני יוצא מן הכלל. בנוסף, אנו רוצים להודות בני הזוג. רודריגו אנדרדה לסיוע ביישום תרבות פרוסה organotypic ופרוטוקולים transfection biolistic וד&quot;ר ג&#39;ין Nerbonne לספק לנו בונה cDNA עבור transfection. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק: NS044163 מ NINDS (עד RCF).

<ol><li>Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).</li>
<li>Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+neural+responses+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Timing of neural responses in cortical organotypic slices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).</li>
<li>Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).</li>
<li>Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+Kv2.1+channels+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Neurosci+Abstr%22%5BJournal%5D)">Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons.</a> Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+of+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures of neural tissue.</a> Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Maintenance+of+Organotypic+Slice+Cultures+of+CNS+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+biophysical+properties+of+Kv1+channels+in+supragranular+neocortical+pyramidal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones.</a> J Physiol. 571, 371-389 (2006).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+Kv1+containing+channels+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons.</a> J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).</li>
<li>Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv2+subunits+underlie+slowly+inactivating+potassium+current+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons.</a> J Physiol. 581, 941-960 (2007).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+chronic+stimulation+of+cortical+organotypic+cultures+using+implanted+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes.</a> Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+spontaneous+activity+and+Up+states+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices.</a> J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).</li>
<li>Malin, S. A., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+rectifier+K%2B+currents%2C+IK%2C+are+encoded+by+Kv2+alpha-subunits+and+regulate+tonic+firing+in+mammalian+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons.</a> J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).</li>
<li>O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun%3A+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+channels+mediate+the+medium+but+not+the+slow+calcium-activated+afterhyperpolarization+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons.</a> J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).</li>
<li>Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+preprotachykinin+promoter+activity+in+single+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons.</a> J Neurochem. 75, 882-885 (2000).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neuronal+cultures+using+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Proc%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun.</a> Nat Proc. 1, 977-981 (2006).</li>
<li>Joshi, P., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun+transfection+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gene gun transfection of hippocampal neurons.</a> J Vis Exp. , (2006).</li>
<li>Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנחנו כבר לומדים את הביטוי הפונקציונלי התפקידים של מתח מגודרת ערוצי אשלגן עצב פירמידליים מן החולדה הניאוקורטקס (4, 11/09). בגלל חוסר של סוכנים תרופתי ספציפי עבור הערוצים הללו, אנו משתמשים בגישה מניפולציה גנטית לביטוי ערוץ (1,14,15,17-19). אנו מנצלים להכנת תרבות organotypic (2,3, 5-8; 12,13,15-22). שונה מהגישה של Stoppini et al (16), על מנת לשמור על מורפולוגיה של תאים דפוס למינרית של קליפת המוח. אנו לבודד פרוסות neocortical חריפה על 6-17 ימים לאחר הלידה ולשמור את ...

ניתוח / transfection / תרבות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח כלי פריסה: Campden Vibroslice # MA572 Precision Instruments העולם, סרסוטה, פלורידה, ארה&quot;ב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת Gene Gun: Bio-Rad הליוס # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 אלפרד נובל דרייב, הרקולס, CA 94547) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כולל: אקדח ג&#39;ין, הרכבה צינור עם הליום, הרגולטור צינורות הכנה התחנה (# 165-2418), מזרק ערכת, צינורות Tefzel, חותך צינורות, ערכת אופטימיזציה (# 165-2424), חותך צינורות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Bio-Rad הליום הרגולטור (# 165-2413) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד חד פעמי עבור הליוס מ Bio-Rad: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.6 מיקרומטר Microcarriers זהב: # 165-2264 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tubing Tefzel: # 165-2441 </li></ul></li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החממה: פורמה מודל מדעי # 3110 (Thermo-מדעי: (866) 984-3766). </li></ol> מדיה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוס סרום: Hyclone התורם סוסים SH # 30074. (HyClone, 925 מערב דרום 1800, לוגן, UT 84321) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HMEM (Media Essential מינימלי בתוספת HBSS ו HEPES, ללא גלוטמין: Lonza BioWhittaker קטלוג # 12-137F): GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, אפשרות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS (GIBCO הנקס שנאגרו מלוחים, # 24020-117): GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, אפשרות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממ (בינוני GIBCO חיוני מינימלי, # 12360-038), GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, אפשרות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מ&quot;ל Millipore 0.2 מיקרומטר מסנן: # SC6PU02RE </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת pipettes פלסטיק: פישר # 13-711-20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 מ&quot;ל Millipore steriflip 0.22 מיקרומטר מסנן (# SCGP00525) </li></ol> פריטים 6-8 שהתקבלו: פישר סיינטיפיק, 1241 שגריר שדרות, ת.ד. 14989, סנט לואיס, מיזורי 63132. הקלטה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכוכית Pipet: הרווארד GC150TF-10: הרווארד Apparatus, 84 אוקטובר Hill Road, Holliston, מסצ&#39;וסטס 01746 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סאטר P-87 חולץ אלקטרודה אופקית: כלי סאטר החברה, כונן אחד דיגיטלי, Novato, CA 94949 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקסון מכשירים Multiclamp מגבר 700B: התקנים מולקולריים, Inc 1311 אורלינס Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PClamp 10 נתונים רכישת תוכנה: התקנים מולקולריים, Inc, 1311 אורלינס Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמדת lectrode נשלטת עם סאטר ROE-200 ו-PC המניפולטורים-200 בקר: כלי סאטר החברה, כונן אחד דיגיטלי, Novato, CA 94949. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ: Olympus BX-50WI מיקרוסקופ זקוף עם IR-DIC אופטיקה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IR-רגיש מצלמה Oly-150 (אולימפוס) או DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 צפון Roeske שדרת מישיגן העיר, 46,360). </li></ol>

הקלטה נייד שלמים מן ההכנה פורסים organotypic של הניאוקורטקס

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

אנחנו כבר לומדים את הביטוי הפונקציונלי התפקידים של מתח מגודרת ערוצי אשלגן עצב פירמידליים מ הניאוקורטקס חולדה. בגלל חוסר של סוכנים תרופתי ספציפי עבור הערוצים הללו, נקטנו בגישה מניפולציה גנטית לביטוי הערוץ. אנו משתמשים להכנת תרבות organotypic (16) על מנת לשמור על מורפולוגיה של תאים דפוס למינרית של קליפת המוח. אנחנו בדרך כלל לבודד פרוסות neocortical חריפה על 8-10 ימים לאחר הלידה ולשמור את פרוסות בתרבות עבור 3-7 ימים. זה מאפשר לנו ללמוד נוירונים בגיל דומים לאלה של העבודה שלנו עם פרוסות חריפה ממזער את התפתחות הקשרים מעוררים התוסס של הפרוסה. אנו להקליט עצב פירמידליים חזותית מזוהה שכבות II / III או V באמצעות תאורה אינפרא אדום (IR-) הפרעות ההפרש מיקרוסקופיה לעומת זאת (DIC) עם מהדק תיקון כל תא מהדק מתח הנוכחי או. אנו משתמשים transfection biolistic (אקדח ג&#39;ין) של סוג בר או דנ&quot;א מוטנטי ערוץ אשלגן לתפעל הביטוי של ערוצי ללמוד את תפקידם. התאים transfected מזוהים בקלות אחרי transfection בשיתוף עם cDNA עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) על ידי מיקרוסקופ epifluorescence. אנו משווים הקלטות של תאים transfected אל, נוירונים סמוכים untransfected באותה השכבה של פרוסה אחת.

זהו פרוטוקול להכין ולתחזק הכנה פרוסה neocortical בתרבות organotypic לצורך ביצוע הקלטות חשמל עצב פירמידליים.

הקלטה נייד שלמים מן ההכנה פורסים Organotypic של הניאוקורטקס

חקרנו את הביטוי ואת התפקידים הפונקציונליים של תעלות אשלגן תלויות-מתח בנוירונים פירמידליים מניאוקורטקס של חולדה. בשל ה...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשיג רישומים חשמליים מנוירונים פארא-מטליים (parametal neurons) בתוך פרוסות אורגנוטיפיות של הניאוקורטקס. זאת על ידי חיתוך ראשוני של פרוסות אקוטיות מעכברים בגילאים פוסט-נטאלים P8 עד P10. השלב השני של הפרוצדורה הוא ביצוע טרנספקציה של CD NA באמצעות Bic. השלב השלישי של הפרוצדורה הוא גידול של הפרוסות בתרבית למשך שלושה עד שבעה ימים.השלב האחרון של הפרוצדורה הוא השגת רישומים חשמליים מתאים שעברו טרנספקציה באמצעות clamp של זרם או מתח. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות כי לתאי parametal בחתכים אורגנוטיפיים יש תכונות דומות לאלו של חתכים אקוטיים מאותו גיל. טרנספקציה של GFP אינה משנה תכונות אלו, ובכך מאפשרת את חקר הנוירונים לאחר מניפולציות גנטיות של תעלות יונים באמצעות רישומי clamp של זרם או מתח של התא כולו.היתרון המרכזי של טכניקה זו, בניגוד למשל לפרוסות אקוטיות, הוא שניתן לתחזק תאים בסביבה נורמלית למשך זמן ארוך מספיק כדי לאפשר מניפולציה גנטית של תעלות יונים. השיטה יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום תעלות היונים, כגון התפקידים הפונקציונליים של סוגי תעלות יונים ספציפיים. הכינו את מabilis הזרימה הלמינרית, מabilis הזרימה בוואקום, הציוד הכירורגי והתמיסות כפי שפורט בכתב היד המצורף. הרכיבו כפפות לכל השלבים הבאים לאחר סינון של מנה של 250 milliliters של תמיסת חיתוך שהוכנה, ומזגו 40 milliliters ממנה לכלי כימי של 50 milliliters.הניחו את תא החיתוך, את המכסה של 40 מיליליטר ואת 210 המיליליטרים הנותרים של תמיסת החיתוך במקפיא בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס תחת מ চিদাভ זרימה למינרית. העבירו 1.1 מיליליטר של מצע גידול לשלושה בארות אלכסוניות בלוח בעל שש בארות. חזרו על פעולה זו פעם שנייה.פלטה בעלת שישה בארות. הכניסו את הפלטות בעלות ששת הבארות לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת לפחות. לאחר מכן, השתמשו במספריים סטריליים כדי לקצר ארבעה פיפטים להעברה שישמשו להעברת הפרוסות.שלוש פיפטות נוספות נשמרות שלמות כאשר התמיסות הופכות לתערובות צמיגיות. הוצא את המנה של 40 מיליליטר של תמיסת החיתוך מהמקפיא והנח אותה תחת מכסה השאיבה. הזרם לתוכה בועות של 95%oxygen, 5%carbon dioxide.לאחר מכן, הוציאו את 210 milliliters של תמיסת החיתוך מהמקפיא והניחו אותה תחת מנדף זרימה למינרית להבעיה. היא מועשרת ב-95% oxygen ו-5% carbon dioxide. לאחר מכן, הוציאו את מדיום השטיפה מהמקרר והבעילו אותו ב-100% oxygen תחת מנדף הזרימה הלמינרית.העבירו שני מיליליטר של מצע גידול לצחלורית פטרי. הניחו את יתרת מצע הגידול במקרר לצורך החלפת המצע במהלך השבוע, כהכנה לחיתוך המוח. שפכו כ-10 מיליליטר של תמיסת חיתוך קרה מכלי הביקר בנפח 50 מיליליטר לכלי ביקר בנפח 25 מיליליטר תחת מכסכת הוואקום.לאחר הרדמה ועריפת ראש, הוצא את המוח של חולדה בני 8 עד 10 ימים לאחר הלידה. שטוף את המוח בכלי זכוכית המכיל 30 milliliters של תמיסת חיתוך קרה למשך כ-30 שניות. לאחר מכן, העבר בזהירות את המוח לכלי זכוכית של 25 milliliters.החליפו כפפות והרטיבו אותן באתנול. לאחר מכן, העבירו את המוח בתוך תמיסת החיתוך הקרה למכסה המזרמה הלמינרית. השלב הבא הוא קיבוע והכוון של המוח על ידי הסרת המוח הקטן (cerebellum) והקטב הפרונטלי, וביצוע חיתוך סגיטלי חלקי במרכז; הדביקו את המוח המקובע על הבמה כאשר קליפת המוח הפרונטלית פונה כלפי מעלה.בצע חיתוכים נוספים עם סכין ניש तर כדי להגביל את גודל הפרוסות. לאחר מכן, מקם את תומך הדגימה עם המוח בתוך תא החיתוך הממתכתי הסטרילי. חבר את התא למכשיר החיתוך הרוטט של הרקמות.מלאו את האמבטיה בתמיסת חיתוך קרה מאוד המבעבעה. שפכו 30 מיליליטר מהשאר של תמיסת החיתוך לכוס כימית בנפח 50 מיליליטר והבעבירו באמצעות 95% oxygen ו-5% carbon dioxide. כוס כימית זו תשמש לאיסוף הפרוסות.בצע חיתוך של פרוסות קורונליות בעובי 250 מיקרון של קליפת המוח הפרונטלית-פריאטלית. העבר לפחות שש פרוסות לכלי קיבול של 50 מיליליטר המכיל תמיסת חיתוך. לאחר מכן, מצע כ-2 מיליליטר של מדיום שטיפה בצלחת פטרי של 35 מילימטר.בעזרת פפטה חתוכה, העבירו את הפרוסות מתמיסת החיתוך אל פטריה המכילה מדיום שטיפה. שטפו את הפרוסות שלוש פעמים, תוך שימוש בפפטות חדשות להוספת המדיום ושאיבת תמיסאות השטיפה; לאחר השטיפה, העבירו את הפרוסות לפטריה של 35 מילימטר המכילה מדיום תרבית. לאחר מכן, הסירו את המכסים מאריזת התבת הרשת, אך השאירו את התבתים בתוך האריזות.לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להוציא רכיב רשת אחד מאריזתו באמצעות פפית העברה חתוכה. העבירו פרוסה אחת מתוך מצע התרבית אל הרשת. הכניסו ומקמו את הפרוסה במרכז הממברנה באמצעות פפית העברה שלמה.הסיר כל עודף של מצע גידול. כעת, מקם את תבנית הרשת עם הפרוסה בתוך אחת הבארות המלאות בנוזל בלוח שש-בארים. הקפד למנוע היווצרות של בועות אוויר תחת הרשת לאחר הנחת פרוסה אחת בכל אחת מהבארות המלאות בנוזל.החזירו את שתי הפלטות בעלות שש הלולאות למדגרה והדגרימו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך כשעה. בינתיים, נקו את אזור העבודה תחת מ 그런 מזרם למינרי (laminar flow hood) כהכנה לטרנספקציה. השלב הבא הוא טעינת ה-BioRad Helios gene gun, תוך השארת המיקום הראשון פנוי.טען מחסנית המכילה כדורים מצופים ב-CD NA בכל פ position שני במחזיק המחסניות של תותח הגנים. לאחר מכן, מקם את מחזיק המחסניות בתוך תותח הגנים. ראשית, נקה את התותח על ידי ירי קנה ללא כדורים.לאחר מכן, העבירו את הנשק למחסנית המכילה CDNA.Bullets. הוציאו את פלטות ה-six well מהאינקובטור והניחו אותן תחת מapay flow hood; החזיקו את הנשק במצב אנכי, בדיוק מעל חלקו העליון של ה-six well plate, וירהו פלח בלחץ של 100 PSI. לאחר מכן, העבירו את הנשק ונקו אותו שוב על ידי ירי של תאי ריק. ירו את שאר הפלחים בירייה אחת לכל פלח.לאחר הצילום, החזירו את פלטות שש-הבארים (six well plates) לאינקובטור והדגרימו את הפרוסות בטמפרטורה של 37 °C למשך יומיים עד שבעה ימים, עם 5% carbon dioxide במהלך תקופת ההדגירה. החליפו את המדיום מדי יומיים באופן הבא: בעבודה תחת מ╅ה של זרימה למינרית, הוסיפו מדיום חדש לשלוש הבארים הריקות. לאחר מכן, החזירו את פלטת שש-הבארים לאינקובטור למשך שעה אחת לפחות. לאחר שעה, החזירו את פלטת שש-הבארים למ╅ה הלמינרית והשתמשו בפינצטה קמורה שנוקתה באתנול כדי להעביר כל תסבך רשת (mesh insert) ואת הפרוסה שבו לבאר חדשה; שאבו את המדיום הישן והחזירו את הפלטה לאינקובטור.לאחר מספר ימי דגירה, הפרוסות מוכנות כעת להקלטות של תאים שלמים. הוצאו פלטה בעלת שישה בארות מהמדגרה תחת מ Cofset למינרי. השתמשו בפינצטה קמורה שעברה ניקוי באתנול כדי להוציא רשת אחת ואת הפרוסה שבה.לאחר מכן, החזירו את הפלטה בעלת ששת הבארים למדגרה. בשלב הבא, העבירו את פטריית השקיפה עם התוך הרשתי והפרוסה לאזור ההקלטה, תוך הפעלת מתיחה באמצעות פינצטה או פיסת מתכת גמישה. השתמשו בסקאלפל מספר 11 כדי להסיר את הרשת מסביב לפרוסה במידת הצורך, והשלימו את החיתוכים הסופיים באמצעות המספריים.לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להעביר את הפרוסה ואת הרשת המחוברת אליה לתא ההקלטה. על הבמה של מיקרוסקופ אנכי, השקעו את הפרוסה בנוזל ח㔯 עמודשתי מלאכותי המועשר בקרבוגן תחת אופטיקת IR DIC. הדמינו את הנוירונים הפרא-מטליים (parametal neurons) בשכבות שתיים, שלוש או חמש תחת פלואורסצנציה אפי-פואלית ובסנן fitz.אתר את התאים העוברים טרנספקציה המסומנים בירוק תחת מיקרוסקופיית IR DIC. חפש את ה-CDNA bullets, המופיעים כנקודות שחורות קטנות בתוך התאים. בחר תא שעבר טרנספקציה לצורך ביצוע הקלטה של תא שלם (whole cell recording).בשלב הבא, קרבו מיקרו-אלקטרודה אל התא הנבחר והשתמשו ביניקה עדינה כדי להשיג חסימה של גיגה-אוהם (giga ohm seal). לאחר מכן, החילו יניקה נוספת כדי לפרוץ אל התא לצורך הקלטה של התא השלם (whole cell recording). התא מוכן כעת להקלטות בשיטת קיבוע זרם (current clamp) או קיבוע מתח (voltage clamp).איור זה מציג תמונה פלורסצנטית של תאים שעברו טרנספקציה של CDNA עבור GFP. ההקלטות הבאות נלקחו מתאים שעברו טרנספקציה של CDNA עבור GFP. כאן מוצג פוטנציאל פעולה בתא parametal בשכבה 3 בתגובה להזרקת זרם של 10 מילישניות מעל הסף.איור זה מציג פריקה חוזרת של נוירון פארא-תמי (parametal neuron) משכבה חמישית בתגובה להזרקת זרם של 400 pico amp למשך שתי שניות. איור זה מציג רישום של סגירת מתח (voltage clamp) מנוירון פארא-תמי משכבה חמישית. נעשה שימוש בטטרודוטוקסין (Tetrodotoxin) כדי לחסום את זרם הנתרן תלוי המתח.העקבות מייצגות זרמי אשלגן יוצאים שעוררו סדרת מדרגות מתח של 500 מילישניות מפוטנציאל החזקה של מינוס 70 מיליבולט. ברגע ששולטים בטכניקה, ההכנה והטרנספקציה הקלות יכולות להתבצע בערך כשעתיים, כולל זמן ההכנה. בעת ניסיון לבצע פרוצדורה זו.חשוב לשמור על תנאים סטריליים ולהגביל את העובי וממדי הפרוסה כדי למנוע התייבשות. תודה לצפייה. בהצלחה בניסוי שלכם.תודה לך.

whole-cell-recording-from-an-organotypic-slice-preparation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מתאר assay פרוסה organotypic אופטימיזציה עבור המוח לאחר הלידה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות הדמיה של הגירה neuroblast בזרם נודדות מקורי.

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

סרטון זה מדגים מיקום פיפטה מחודדת דקה ליד פרוסות מוח, ויוצר חותם עם תא עצבי. היניקה שוברת את קרום התא, ובכך יוצרת מהדק טלאי של התא כולו המאפשר מדידות נוכחיות לניסויים אלקטרופיזיולוגיים.

קביעת תצורת מהדק-מתח של תא שלם לרישומים אלקטרופיזיולוגיים בפרוסות מוח

סרטון זה מתאר שיטה לדימות ורישום בו זמנית של פעילות חשמלית מפרוסות מוח טרנסגניות המכילות חלבונים פלואורסצנטיים ספציפיים לנוירונים. ההליך כולל שמירה על פרוסת המוח בתא זילוח עם נוזל מוחי מלאכותי משודר, שימוש במקור אור כדי לעורר תאים המסומנים בפלואורסצנט, ורישום האותות החשמליים באמצעות בדיקה רב-ערוצית ומהדק טלאי.

ניטור אופטי ואלקטרופיזיולוגי סימולטני של תאי עצב בפרוסות מוח

הקלטות זוגות הן הקלטות סימולטניות של מהדק טלאי תא שלם משני נוירונים המחוברים סינפטית, מה שמאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ופרמקולוגי מדויק של הסינפסות בין נוירונים בודדים. כאן אנו מתארים את המתודולוגיה והדרישות המפורטות לביסוס טכניקה זו בתרביות פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות בכל מעבדה המצוידת באלקטרופיזיולוגיה.

הקלטות תא כל לזווג בפרוסות בהיפוקמפוס Organotypic

פרוטוקולי לולאה סגורה הופכים נפוצים יותר ויותר באלקטרופיזיולוגיה המודרנית. אנו מציגים דרך פשוטה, רב-תכליתית וזולה לביצוע פרוטוקולים אלקטרופיזיולוגיים מורכבים בנוירונים פירמידליים בקליפת המוח במבחנה, באמצעות מחשב שולחני ולוח רכישה דיגיטלי.

אלקטרופיזיולוגיה בזמן אמת: שימוש בפרוטוקולי לולאה סגורה לDynamics עצבי בדיקה ומעבר

כאן, מוצג הליך להפעלה סלקטיבית של חלבון עצבי עם פולס קצר של אור על ידי קידוד גנטי של חומצת אמינו לא טבעית תגובתית-אור לחלבון עצבי מטרה המתבטא בתאי עצב בתרבית או in vivo.

שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים

פרוטוקול זה מדגים יישום אופטימיזציה N-מתיל-D-glucamine (NMDG) שיטת שחזור מגן המוח פרוסה ההכנה. ניסוח מדיה בודד משמש להשיג באופן אמין פרוסות המוח בריא של בעלי חיים בכל גיל, וגם עבור יישומים שונים ומגוונים ניסיוני.

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

בנייר זה, נדון שלושה תכשירים המוח משמש עבור כל תיקון קלאמפ הקלטה ללמוד את המעגל retinotectal של ראשנים של צפרדע רפואית זריזה . כל הכנה, עם יתרונות ספציפיים משלה, תורמת ללקוחות שלנו ניסיוני של הראשן צפרדע רפואית כמודל ללמוד תפקוד מעגלים עצביים.

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

כאן, אנו מתארים את השלבים החיוניים להקלטות תאים כל תיקון-קלאמפ זני הסובסטנציה gelatinosa (SG) נוירונים בתוך הפרוסה חוט שדרה במבחנה . שיטה זו מאפשרת את מאפייני קרום פנימי, הסינאפסית ואפיון מורפולוגי של ס ג נוירונים שילמדו.

הכנה של חוט השדרה חריפה פרוסות תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה בנוירונים הסובסטנציה Gelatinosa

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים להכנת פרוסות מוח חריפה המכילים את הגרעין הגנוקה לרוחב ואת החקירה אלקטרופיסיולוגית של הפונקציה retinogeniculate ותפקוד הסינפסות. פרוטוקול זה מספק דרך יעילה לחקר הסינפסות עם שחרור גבוה והסתברות נמוכה של שחרור באותן פרוסות מוח חדות.

החקירות האלקטאליות של הפונקציה Retinogeniculate ו Corticogeniculate סינפסה

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר התמרה ויראלית של אזורי מוח בדידים עם מבנים אופטוגנטיים כדי לאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ספציפי לסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים חריפים.

אקס ויוו חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ועד קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית

למדו הכנה ותחזוקה של פרוסות ניאוקורטקס בתרבית אורגנוטיפית להקלטות חשמליות מנוירונים פירמידליים בעכברושים. השיטה מאפשרת מניפולציות גנטיות וניתוח תכונות תפקודיות של תעלות יונים בזמן אמת.

הקלטה נייד שלמים מן ההכנה פורסים Organotypic של הניאוקורטקס

גלה סרטונים נוספים