הקלטה נייד שלמים מן ההכנה פורסים Organotypic של הניאוקורטקס

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג הקלטות חשמליות מנוירונים פרמטאליים בפרוסות אורגנוטיפיות של ניאו-קורטקס. זה מושג על ידי חיתוך פרוסות חריפות מחולדות בגילאי P 8 עד P 10 לאחר הלידה. השלב השני של ההליך הוא להשפיע על טרנספקציה של Bic של CD NA. השלב השלישי בהליך הוא תרבית הפרוסות למשך שלושה עד שבעה ימים.

השלב האחרון של ההליך הוא השגת הקלטות חשמליות מתאים שעברו טרנספטציה באמצעות מהדק זרם או מתח. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות כי לתאי פרמטאל בפרוסות אורגנוטיפיות יש תכונות דומות לאלו של פרוסות חריפות באותו גיל. טרנספקציה של GFP אינה משנה את התכונות הללו, ומאפשרת חקר נוירונים לאחר מניפולציות גנטיות של תעלות יונים באמצעות זרם תא שלם או הקלטות מהדק מתח.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא, בניגוד לפרוסות חדות, הוא שניתן לשמור על תאים בסביבה נורמלית מספיק זמן כדי להיות מסוגלים לתפעל גנטית תעלות יונים. השיטה יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תעלות היונים, כגון התפקידים הפונקציונליים של סוגי תעלות יונים ספציפיים, הכנת מכסה הזרימה הלמינרית, מכסה המנוע לזרימת ואקום, אספקה כירורגית ותמיסות כמפורט בכתב היד המצורף. יש ללבוש כפפות לכל השלבים הבאים לאחר סינון תמיסת החיתוך המוכנה של 250 מיליליטר, כלומר 40 מיליליטר ממנה לכוס של 50 מיליליטר.

הניחו את תא החיתוך, 40 מיליליטר אליקוט, ואת 210 המיליליטר הנותרים של תמיסת החיתוך במקפיא במינוס 20 מעלות צלזיוס מתחת למכסה הזרימה הלמינרית. מניחים 1.1 מיליליטר של אמצעי תרבות בשלוש בארות אלכסוניות של צלחת שש בארות. חזור על זה לשנייה.

צלחת שש בארות. מניחים את שש צלחות הבאר באינקובטור בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות. לאחר מכן, השתמש במספריים סטריליים כדי לקצר ארבע פיפטות העברה שישמשו להעברת פרוסות.

שלוש פיפטות נוספות נשמרות שלמות כאשר התמיסות הפכו לתערובות רפש. הסר את תמיסת החיתוך של 40 מיליליטר מהמקפיא והניח אותה מתחת למכסה המנוע. מבעבעים אותו ב-95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני.

לאחר מכן הוציאו את 210 מיליליטר תמיסת החיתוך מהמקפיא והכניסו אותה מתחת לבועת מכסה המנוע הלמינרית. זה גם עם 95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, הוציאו את אמצעי הכביסה מהמקרר והכניסו אותה ל-100% חמצן מתחת למכסה המנוע הלמינר.

מניחים שני מיליליטר של מצע תרבות בצלחת פטרי. הניחו את אמצעי התרבות הנותרים במקרר להחלפת מדיה במהלך השבוע כדי להתכונן לחיתוך המוח. שופכים כ -10 מיליליטר תמיסת חיתוך קר מכוס 50 מיליליטר לכוס של 25 מיליליטר מתחת למכסה המנוע.

לאחר הרדמה ועריפת ראש, הסר את המוח של יום לאחר הלידה, שמונה עד 10 חולדות. שוטפים את המוח בכוס המכילה 30 מיליליטר תמיסת חיתוך קר למשך כ -30 שניות. לאחר מכן העבירו בזהירות את המוח לכוס של 25 מיליליטר.

החלף כפפות והרווי את הכפפות באתנול. לאחר מכן נשא את המוח בתמיסת החיתוך הקר אל מכסה הזרם הלמינר. השלב הבא הוא לכוון ולחסום את המוח על ידי הסרת המוח הקטן והקוטב הקדמי וביצוע חתך חלקי באמצע הסגיטלי להדביק את המוח החסום על הבמה עם קליפת המוח הקדמית כלפי מעלה.

בצע חיתוכי אזמל נוספים לפי הצורך כדי להגביל את גודל הפרוסות. לאחר מכן הנח את הבמה עם המוח לתוך תא חיתוך המתכת המעוקר. חבר לפורס הרקמות הרוטט.

מלאו את האמבטיה בתמיסת חיתוך מבעבעת קרה כקרח. שופכים 30 מיליליטר מתמיסת החיתוך שנותרה לכוס של 50 מיליליטר ומבעבעים עם 95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני. זו תשמש לאיסוף הפרוסות.

חותכים פרוסות עטרה של 250 מיקרון של קליפת המוח הקודקודית הקדמית. מניחים לפחות שש פרוסות לתוך הפסגה של 50 מיליליטר המכילה תמיסת חיתוך. לאחר מכן מניחים כשני מיליליטר של חומרי כביסה בצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר.

בעזרת פיפטה חתוכה, העבירו את הפרוסות מתמיסת החיתוך לצלחת פטרי המכילה אמצעי כביסה. שוטפים את הפרוסות שלוש פעמים בעזרת פיפטות טריות להוספת מדיה ולשאיבת תמיסות הפסולת לאחר הכביסה, מעבירים את הפרוסות לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר המכילה מצע תרבית. לאחר מכן, הסר את החלקים העליונים מהאריזה עבור תוספות הרשת, אך השאר את התוספות באריזות.

לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי להרים תוספת רשת אחת מהאריזה שלה באמצעות פיפטת העברה חתוכה. העבירו פרוסה אחת מאמצעי התרבות לרשת. הכנס ומקם את הפרוסה באמצע הממברנה באמצעות פיפטת העברה שלמה.

הסר את כל אמצעי התרבות העודפים. כעת. מניחים את תוספת הרשת עם הפרוסה שלה באחת הבארות המלאות בנוזלים של צלחת שש הבארות. היזהר למנוע היווצרות בועות אוויר מתחת לרשת לאחר הנחת פרוסה אחת בכל אחת מהבארות המלאות בנוזלים.

מניחים את שתי שש צלחות הבאר בחזרה לחממה ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך כשעה. בינתיים, יש לנקות את אזור העבודה מתחת למכסה הזרימה הלמינרי לקראת העברה. השלב הבא הוא לטעון את אקדח הגן BioRad Helios, ולהשאיר את המיקום הראשון פנוי.

טען מחסנית המכילה כדורים מצופים CD NA לכל מיקום אחר של מחזיק המחסנית של אקדח הגנים. לאחר מכן הנח את מחזיק המחסנית לתוך אקדח הגנים. ראשית, נקה את האקדח על ידי ירי קנה ללא כדורים.

לאחר מכן קדם את הקנה למחסנית המכילה CDNA. כדורים. קח את שש צלחות הבאר מהחממה והנח אותן מתחת למכסה הזרימה הלמינארי, המחזיק את האקדח אנכית ממש מעל החלק העליון של צלחת שש הבארות, ירה פרוסה ב-100 PSI, ואז קדם את הקנה ונקה אותו שוב על ידי ירי ריק. צלם את הפרוסות הנותרות בזריקה אחת לכל פרוסה.

לאחר הצילום, החזירו את שש צלחות הבאר לחממה ודגרו את הפרוסות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך יומיים עד שבעה ימים עם 5% פחמן דו חמצני במהלך תקופת הדגירה. החלף את המדיה כל יומיים באופן הבא, עבד מתחת למכסה הזרימה הלמינרית, הוסף מדיה חדשה לשלוש הבארות הלא מאוכלסות. לאחר מכן החלף את צלחת שש הבארות בחממה למשך שעה לפחות, לאחר שעה, החזר את צלחת שש הבארות למכסה המנוע הלמינרי והשתמש במלקחיים מעוקלים מנוקים באתנול כדי להעביר כל תוספת רשת ואת הפרוסה שלה לבאר חדשה, שאב את המדיה הישנה והחזיר את הצלחת לחממה.

לאחר מספר ימים של דגירה, הפרוסות מוכנות כעת להקלטות תאים שלמים. הסר צלחת שש בארות מהחממה מתחת למכסה הזרימה הלמינרית. השתמש במלקחיים מעוקלים מנוקים באתנול כדי להסיר תוספת רשת אחת ואת הפרוסה שלה.

לאחר מכן החלף את צלחת שש הבארות בחממה. לאחר מכן, העבירו את צלחת הפטרי עם תוספת רשת ופרסו לאזור ההקלטה, תוך הפעלת מתח בעזרת מלקחיים או חתיכת מתכת גמישה. השתמש באזמל מספר 11 כדי לחתוך את הרשת מסביב לפרוסה במידת הצורך, סיים את החיתוכים הסופיים עם המספריים.

לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי להעביר את הפרוסה ואת הרשת המחוברת לתא ההקלטה. בשלב של מיקרוסקופ זקוף, רחצו את הפרוסה בנוזל עמוד השדרה המוחי המלאכותי הקשור לקרבוגן תחת אופטיקה IR DIC. דמיין את נוירוני הפרמטאל בשכבות שתיים, שלוש או חמש תחת אפי פלואורסצנטי ומסנן פיץ.

אתר את התאים הירוקים שעברו טרנספטציה תחת מיקרוסקופ IR DIC. חפש את כדורי ה-CDNA, המופיעים כנקודות שחורות קטנות בתוך התאים. בחר תא שעבר טרנספטציה להקלטת תא שלם.

לאחר מכן, קדם מיקרו אלקטרודה לתא הנבחר והשתמש ביניקה עדינה כדי להשיג איטום של ג'יגה אוהם. לאחר מכן החל יניקה נוספת כדי לפרוץ לתא כולו. הקלטה. התא מוכן כעת להקלטות מהדק זרם או מתח.

איור זה מציג תמונה פלואורסצנטית של תאים שהועברו עם CDNA עבור GFP. ההקלטות הבאות נלקחות מתאים שהועברו עם CDNA עבור GFP. מוצג כאן פוטנציאל פעולה בתא פרמטאלי בשכבה שלוש בתגובה להזרקת זרם של 10 אלפיות שנייה בסף על.

איור זה מציג ירי חוזר ונשנה מתא עצב פרמטאלי בשכבה חמש בתגובה להזרקת זרם של שתי שניות של 400 פיקו אמפר. איור זה מציג רשומת מהדק מתח מנוירון פרמטאלי משכבה חמש. טטרודטוקסין שימש לחסימת זרם הנתרן המגודר במתח.

העקבות מייצגים זרמי אשלגן כלפי חוץ הנוצרים על ידי משפחה של צעדי מתח של 500 מילי-שניות מפוטנציאל החזקה של מינוס 70 מילי-וולט. לאחר המאסטר, ניתן לבצע את ההכנה וההעברה הקלה תוך כשעתיים, כולל זמן ההכנה. בעת ניסיון הליך זה.

חשוב לשמור על תנאים סטריליים ולהגביל את עובי ומידות הפרוסה כדי למנוע ייבוש. תודה שצפית. בהצלחה בניסוי שלך.

תודה.