Name: ספירת אדם בתאי גזע עצביים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: למדו לספור תאי גזע עצביים אנושיים באמצעות המוציטומטר והצבע טריפן כחול. שיטה זו מאפשרת הבחנה בין תאים חיים למתים ומסייעת בהכנת ניסויים בתרביות רקמה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר ד&quot;ר פיליפ שוורץ ח של המשאבים הלאומיים האדם עצבית לתאי גזע בבית החולים לילדים, אורנג&#39; קאונטי מכון המחקר למתן תרבויות hNSPC.

Passaging אדם בתאי גזע עצביים הערה: אנא עיין <a href="/index/details.stp?ID=263">Passaging אדם בתאי גזע עצביים</a> מאמר על איך לנתק ו resuspend התאים. https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 הכנת תרחיף תאים עבור ספירת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 25 μl של 0.4 פתרון Trypan% כחול 20 μl של המדיה הנייד לתוך צינור Eppendorf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את התאים ייספרו בעדינות על ידי הקשה על שפופרת המכילה תאים בנפח ידוע של התקשורת ליצור השעיה הומוגנית. מקום 5 μl של תאים לתוך הצינור Eppendorf מהשלב הקודם. צעד זה מדלל את ריכוז תא בפקטור של 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הזכוכית המכסה על hemacytometer, ואת העומס על μl 11-12 ההשעיה התא. <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_4/262_Figure-01.png" alt="262_Figure-01" width="511" height="139"> </li></ol> ספירת תאים Hemacytometer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הרשת כולה hemacytometer של מיקרוסקופ לעומת שלב. התמקדות ברבע אחד לרשת (כגון אחד באדום). <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_5/262_Figure-02.png" alt="262_Figure-02" width="492" height="278"> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מתים או גוססים יופיעו כחול כי הממברנה שלהם נפגע והם אינם מסוגלים להוציא את הצבע הכחול Trypan. תאים חיים לא יופיע בכחול ויהיה מוקף "הילה" של אור בניגוד שלב (יהיה "שלב בהיר"). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים קיימא ברבע אחד (אזור 1 מ"מ 2). אתה יכול גם לקבוע כדאיות התא על ידי חלוקת מספר התאים קיימא על ידי המספר הכולל של תאים. ספירת התאים הרביעים אקראי 3-4 ולקבוע את המספר הממוצע של התאים לכל ברבע. מאז נפח ברבע ידוע להיות 10 מ"ל -4 או 0.1 μl, ריכוז של תאים ניתן לקבוע <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_6/262_Figure-03.png" alt="262_Figure-03" width="741" height="165"> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתה יכול להשתמש את קיצור הדרך הבא כדי לקבוע את התאים # / μl: <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_7/262_Figure-04.png" alt="262_Figure-04" width="368" height="69"> סך # של התאים בצינור = # תאים / X μl μl בצינור </li></ol>

<ol><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 
 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> (2007).</li>
<li>Caprette, D. avidR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+Hemacytometer%5BTitle%5D)+AND+%22BioEd+Online%22%5BJournal%5D)">Using a Hemacytometer.</a> BioEd Online. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3">http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3</a> (2008).</li>
<li>Caprette, D. avidR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Chamber+%28Hemacytometer%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioEd+Online%22%5BJournal%5D)">Counting Chamber (Hemacytometer).</a> BioEd Online. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2
">http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2
</a> (2008).</li>
</ol>

פרוטוקול זה מתאר דרך פשוטה ומהירה על מנת לקבוע את ריכוז התא עבור מגוון של ניסויים הכוללים תאים. באמצעות קיצור הדרך המתוארת 3d, ניתן במהירות ובאופן מדויק לקבוע את ריכוז התאים מספר התא הכולל נפח נתון.

<table><tbody><tr><td>המוציטומטר בניגודיות פאזה (Phase Contrast Hemacytometer)</td><td>כלי</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td>מופץ על ידי Fisher תחת מספר הקטלוג המצוין</td></tr><tr><td>צבע Trypan Blue בריכוז 0.4%</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>מופץ על ידי Invitrogen תחת מספר הקטלוג המצוין</td></tr></tbody></table>

ספירת אדם בתאי גזע עצביים

Counting Human Neural Stem Cells

ידיעת מספרם המדויק של תאים קיימא בנפח נתון של השעיה תא נדרש הרבה רקמות שגרתי מניפולציות תרבות, כגון תאים ציפוי עבור immunocytochemistry או transfections התא. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה ומהירה הבחנה בין תאים חיים ומתים לכימות ריכוז תאים מספר התאים הכולל שימוש hemacytometer. פרוצדורה זו הראשונה מחייבת ניתוק תאים ממשטח צמיחה resuspending אותם בתקשורת. לאחר מכן, התאים בדילול בתמיסה של Trypan כחול (אידיאלי ריכוז זה ייתן 20-50 תאים לכל רביע) והושמו hemacytometer. לבסוף, מונה בממוצע של תאים קיימא הרביעים שנבחרו באקראי מספר, חלוקת הממוצע לפי נפח של אחד 1 מ&quot;מ 2 ברבע (0.1 μl) ו הכפלה במקדם דילול נותן את מספר התאים לכל l. הכפלה זו על ידי ריכוז תא מהנפח הכולל של μl נותן את מספר התא הכולל. פרוטוקול זה מתאר סופר אנושי גזע עצביים / מבשר תאים (hNSPCs), אך יכול לשמש גם עבור הרבה סוגי תאים אחרים.

ידיעת מספרם המדויק של תאים קיימא נדרש מניפולציות תרבות רבים רקמות. פרוטוקול זה מתאר כיצד להבדיל בין תאים חיים ומתים ולכמת תאים באמצעות hemacytometer. למרות שזה מתאר הספירה האנושית גזע עצביים / מבשר תאים (hNSPCs), ניתן להשתמש בו עבור סוגי תאים אחרים.

ידע על המספר המדויק של תאים חיוניים בנפח נתון של תרחיף תאים נחוץ עבור מניפולציות רבות של תרביות רקמה שגרתיות, כגון...

כעת אראה לכם כיצד לספור תאי אב עצביים אנושיים; תספרו את התאים כאשר תרצו להעביר אותם לצביעה אימונוכימית או כאשר תרצו לבצע טרנספקציה עם nuclear factor machine. אני משתמשת ב-hemocytometer בניגודיות פאזה בעל רשת קצוות, ובנוסף אנו משתמשים בצבע הנקרא trypan blue. הצבע שימושי מכיוון שהוא מאפשר להבחין בין תאים חיים לתאים מתים.תאים מתים או גוססים קולטים את הצבע הזה ונראים כחולים. כאשר בוחנים את התאים ב-hemocytometer, תאים חיים מסוגלים לדחות את הצבע, ולכן הם אינם נראים כחולים. באופן זה ניתן לקבוע את חיוניות התאים שלכם; הכינו תמיסה של trypan blue במדיום.אני עומד להוסיף 20 µL של תמיסת trypan blue לשפרורת epi 0.5 mil זו. לאחר מכן אוסיף 25 µL של מצע גידול. כך שכרגע יש לי 45 µL של תמיסת trypan blue ומצע גידול, כדי שבעת הוספת 5 µL של תרחיף תאים, אקבל דילול של 1:10.ועכשיו אני עומד להוסיף 5 µL של תרחיף תאים. ראשית, אני אוודא שהתאים התערבבו היטב באמצעות ערבוב ידני (finger vortexing). כעת אני רוצה לוודא שתמיסה זו מעורבבת היטב.כעת אעלה ואוריד את השולחן מספר פעמים. ולבסוף, אטען כ-12 µL מתליהית התאים הזו לתוך המוציטומטר. יש לו שני פתחים וניתן להשתמש בכל אחד מהם.לכן, כל שעליכם לעשות הוא להחדיר את התמיסה בפתח זה, והנוזל יישאב על ידי פעולת נימיות. כעת אני מוכן לספור. להלן מבט על ה-hemo cytometer בהגדלה של 10x, וכאן אנו רואים רבע המכיל 16 ריבועים.וכפי שניתן לראות, אנו יכולים להבחין כאן בתאים חיים ומתים. כאן יש לנו תאים חיים כגון זה, וזה, וזה. ויש לנו גם כמה תאים מתים, כגון זה.אם תבחינו, התא המת נראה בכחול כהה, בעוד שלתאים חיים יש מעין הילה מסביבם. כעת אספור את כל התאים החיים. אעבור משמאל לימין ומלמעלה למטה.1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. כך שיש לנו סך הכל שלושים וששה תאים ברביע זה. לכן, כאשר אני רואה תאים שנמצאים על הגבול של הרביע, למשל לאורך הקו הזה ממש כאן, כדי לשמור על עקביות, אני סופרת תאים שנמצאים על הגבול השמאלי ועל הגבול העליון.ואני סופר באופן עקבי תאים על הגבולות הללו עבור כל הרביעים ב-hemo cytometer. כעת נחשב כמה תאים יש לנו למיקרוליטר. כדי לעשות זאת, אקח את הממוצע של התאים לרביע, שהוא 38, ואכפיל ב-10, שהוא פקטור הנקבע על ידי ממדי התא.כמו כן, נכפיל ב-10, שהוא מקדם הדילול במקרה זה. ובסופו של דבר, נקבל את מספר התאים למיקרוליטר. במקרה זה, יש לנו 3,800 תאים למיקרוליטר.ומכיוון שהשעינו את משקע התאים ב-500 microliters של תמיסה, ניתן לחשב את מספר התאים הכולל. וכעת סיימנו.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

היכרות עם גן עניין לתא היא שיטה חזקה הבהרת תפקידה in vivo. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה transfecting תרבות של גזע אנושי / מבשר תאים עצביים (hNSPCs) באמצעות מנגנון electroporation Nucleofector שנעשו על ידי Amaxa.

Transfecting אדם בתאי גזע עצביים עם Nucleofector Amaxa

היכולת לתפעל האדם גזע עצביים / מבשר תאים (hNSPCs) במבחנה מאפשרת לחקור את השירות שלהם, כמו השתלות תאים למטרות טיפוליות לחקור ההתפתחות העצבית האנושית. פרוטוקול זה מציג שיטה culturing ו hNSPCs passaging בתקווה reproducibility גדל והולך של מחקרים תא גזע אנושיים.

Passaging אדם בתאי גזע עצביים

Immunocytochemistry היא שיטה חזקה כדי לקבוע את הנוכחות, לוקליזציה subcellular, והשפע היחסי של אנטיגן עניין תאים בתרבית. פרוטוקול זה מציג קל לעקוב אחר שורה של צעדים שיאפשרו אחד לשמר נוגדנים להפיק את המרב של מכתים אחד.

Immunocytochemistry: אדם בתאי גזע עצביים

זה פרוטוקול וידאו מדגים כיצד להפלות ו למנות בתום תאים בתום גזע עצביים באוכלוסייה מעורבת של תאים עצביים מבשר באמצעות assay עצביים המושבה יוצרי התא.

עצבית, המושבה יצירת Assay נייד: Assay להפלות בונה תאים בתום גזע עצביים מן ובתאים עצבית

שיטה פשוטה ואמינה על בידוד תרבות בתאי גזע עצביים של רקמה אנושית מושלכים קליפת המוח העוברי מתואר. תרבויות שמקורם ידוע הפרעות נוירולוגיות האדם יכול לשמש אפיון של תהליכים פתולוגיים תאית ומולקולרית, כמו גם לספק פלטפורמה כדי להעריך את יעילות תרופתי.

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

פרוטוקול זה מתאר שיטת חיתוך מכאנית רומן המאפשרת ההתרחבות של אגרגטים גזע ותאים אב עצביים כדוריים ללא ניתוק להשעית תא בודד. שמירה על קשר תא / תא מאפשרת צמיחה מהירה ויציבה במשך 40 מעברים.

שיטת הרחבת cGMP-ישימה עבור מצרפים של עצבי אנושי ותאים שמקורם בתאי גזע pluripotent או רקמת מוח עוברית

שיטה פותחה לנובעת באופן ישיר בתאי גזע עצביים אנושיים מתאי אבות היווצרות הדם מועשרים מתאי דם היקפיים.

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

מתוך כוונה לאפיין שינויים ב-miRNAs על תאי גזע עצביים אנושיים מובחנים (hNSCs) אנו מתארים התמיינות hNSC במערכת תלת מימדית, הערכת שינויים בביטוי microRNA על ידי מערך miRNA PCR, וניתוח חישובי לחיזוי יעד miRNA ואימותו על ידי בדיקת לוציפראז כפולה.

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

חוט השדרה של יונקים בוגרים מכיל תאי גזע/אב עצביים (NSPCs) שניתן לבודד ולהרחיב בתרבית. פרוטוקול זה מתאר את הקציר, הבידוד, התרבית והמעבר של NSPCs שנוצרו מהאזור הפרי-חדרי של חוט השדרה הבוגר מהחולדה ומתורמי השתלת איברים אנושיים.

בידוד של תאי גזע / עצביים מהאזור סביב חדרי המוח של העכברוש למבוגרים וחוט השדרה אנושי

תאי גזע עצביים (NSCs) להתייחס לתאים אשר יכול עצמית לחדש ולבדל לשלוש השושלות עצביות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לקבוע תדירות המל"ל באוכלוסיית תא נתונה באמצעות neurosphere היווצרות והבחנה בתנאים משובטים.

ספירת בתאי גזע עצביים באמצעות מבחני המשובטים

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר גישה לניתוח התנהגות של מבוגרים בתאי גזע/מחולל קדמון בתגובה לטיפול כימוגנטי של מעגל מקומי ספציפי עצביים.

Assaying בוויסות מעגל ספציפי של היפוקמאל מבוגרים תאים מקודמן עצבי

למדו לספור תאי גזע עצביים אנושיים באמצעות המוציטומטר והצבע טריפן כחול. שיטה זו מאפשרת הבחנה בין תאים חיים למתים ומסייעת בהכנת ניסויים בתרביות רקמה.

ספירת אדם בתאי גזע עצביים

גלה סרטונים נוספים