Name: Whole-mount עבור ניתוח immunohistochemical vasculature לימב עובריים עור: מערכת מודל לחקר המורפוגנזה מסעף דם בעובר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: למדו שיטת whole-mount immunohistochemistry לניתוח רשתות כלי דם בעור גפיים עובריים בעכברים. טכניקה זו משלבת מיקרוסקופיית קונפוקל לדימוי ברזולוציה גבוהה של מבני וסקולריים בתהליכי התפתחות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ק גיל לסיוע עם גידול העכבר טיפול לניהול מעבדה. תודה גם לחברי Mukoyama מעבדה לעזרה טכנית. המימון ניתן על ידי תוכנית המחקר עירונית של מכוני Naitonal הבריאות.

1. איסוף לימב עובריים בעכבר העור (E13.5 ~ E17.5) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים פקוק נוהל שאושר על ידי נשים. על פי פרוטוקול שאושר שלנו חיה, הנקבות מומתים על ידי חשיפה CO 2 והבטיחה מכן על ידי נקע בצוואר הרחם. הנח את חיה על מגבת נייר סופג שלה ולספוג אותו ביסודיות 70% EtOH / H 2 O מבקבוק לחיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח הרחם שלם ולמקם אותו תבשיל 100 x 15 מ"מ פטרי המכילה תמיסת מלח מאוזן קר כקרח "הנקס (HBSS) כדי לשטוף את הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד לנתח את העובר. הסר את amnion דק מאוד מן העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציה) לנתח עובר יחיד 35 x 10 צלחת פטרי מ"מ אם העובר כל צריך להיות genotyped. זנב גזור מועברת צינורית PCR 0.2 מ"ל עבור genotyping. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את forelimbs של העובר והעברת forelimbs ידי מלקחיים הטבעת לתוך צלחת 24 היטב המכיל 2 מ"ל של Paraformaldehyde קר כקרח 4% טרי (PFA) ב פוספט הצפת מלוחים (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את forelimbs עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator ב 4 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להסיר את PFA לשטוף שלוש פעמים בתוך 5 דקות של 2 מ"ל PBS עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את forelimbs ב 100% מתנול (MeOH) ולאחסן אותן במקפיא -20 ° C אנזים (במקפיא עם בקרת טמפרטורה קריטית וללא פונקציה להפשיר אוטומטית). נוגדנים ראשיים הרשומים לעבוד טבלה מס '1 לאחר הטיפול MeOH 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקלפים את העור מן forelimb באמצעות פינצטה בסדר. העור האיבר, כאשר מיובש, צריך להפריד בקלות בין הגפה. ראשית המקום איבר עם הצד הגחוני (צד כף) פונה כלפי מעלה. ואז בעזרת פינצטה בסדר, לחתוך את העור כפי שמוצג בסרטון. הבא לנתח סביב האיבר כולו, לקלף את העור בעדינות, ללא כל נזק. </li></ol> 2. Whole-Mount מכתים immunohistochemical של Skins לימב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם העור איבר בצינור 5 מ"ל פוליפרופילן מסביב לתחתית ידי דוגרים דרך הסדרה מדורגת של MeOH / PBT דקות (PBS 0.2% + טריטון X-100) 5 (75%, 50%, 25%) עבור כל אחד. שים לב להחלפת פתרונות צריכים להיות זהירים כדי למנוע נזק עורות איבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים בתוך 5 דקות PBT עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את איבר עם עורות עיזים או 10% נסיוב / PBS 0.2% TX100 חיץ חסימת עבור נוגדנים עז משני או 10% חמור בדם / PBS 0.2% TX100 חיץ חסימת עבור נוגדנים חמור משני 2 שעות עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בבית טמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקליפות על איבר 35 x 10 מ"מ צלחת פטרי והעברת ידי מלקחיים הטבעת לתוך צינור microcentrifuge 2ml, עם 800μl של נוגדנים הראשי (דילול בהתאם המפורטים בטבלאות) במאגר חסימת (או 10% עיזים סרום / PBS 0.2 TX100% או 10% חמור בדם / PBS 0.2% TX100). דגירה עורות איבר עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator ב 4 ° C למשך הלילה. שים לב כי נוגדנים העיקרי מרובים שמקורם מינים שונים (למשל, נוגדן חד שבטי עכברוש + נוגדן ארנבת polyclonal) יכול לשמש בעת ובעונה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, במקום עורות איבר על 35 x 10 מ"מ צלחת פטרי והעברת ידי מלקחיים לתוך טבעת פוליפרופילן 5 מ"ל מסביב לתחתית צינור עם 4ml של למאגר כביסה (או 2% סרום / PBS עיזים 0.2% TX100 או 2 % דונקי סרום / PBS 0.2% TX100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חמש פעמים במשך 15 דקות עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקליפות על איבר 35 x 10 מ"מ צלחת פטרי והעברת ידי מלקחיים הטבעת לתוך צינור microcentrifuge 2ml, עם 800μl של נוגדנים משני למאגר החסימה (או 10% נסיוב / PBS עיזים 0.2% או 10% TX100 חמור בדם / PBS 0.2% TX100). בדרך כלל אנו משתמשים נוגדנים משני מג'קסון ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 דילולים) או Invitrogen (אלקסה פלואוריד 488, 568 פלואוריד Alexa, Alexa פלואוריד 633, 1:250 דילול). סנן הפתרון נוגדנים משני באמצעות מזרק 0.22μm PVDF מסננים קרום להסיר חלקיקים מצטברים של נוגדנים משני. דגירה עורות איבר בחושך או עטוף בנייר אלומיניום למשך שעה 1 עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. שים לב שונות נוגדנים ניאון משני מצומדות נגזר מינים שונים יכול לשמש בעת ובעונה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקליפות על איבר 35 x 10 מ"מ צלחת פטרי והעברת ידי מלקחיים הטבעת לתוך צינור פוליפרופילן 5 מ"ל עגול עם תחתית 4ml של למאגר כביסה (או 2% סרום / PBS עיזים 0.2% או 2% TX100 חמור בדם / PBS 0.2% TX100). לשטוף חמש פעמים במשך 15 דקות בחושך או עטופים ברדיד אלומיניום עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אפשרות counterstaining נגד גרעין) דגירה עורות איבר עם 4ml של למאגר כביסה (או עיזים 2% סרום / PBS 0.2% או 2% TX100 סרום / PBS דונקי 0.2% TX100) עם To-Pro-3 (Invitrogen T3605 , 1:3000 דילול) בחושך או עטוף בנייר אלומיניום עבור 10 דקות עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בחדר temperatuמחדש. לאחר מכן, לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות עם 4ml של למאגר כביסה (או 2% סרום / PBS עיזים 0.2% או 2% TX100 חמור בדם / PBS 0.2% TX100) בחושך או עטוף בנייר אלומיניום עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. שים לב, מכתים חזקה ספציפית עבור גרעינים הוא ציין עבור To-Pro-3 הפליטה ספציפי (עירור HeNe 633 ננומטר). </li></ol> 3. הרכבה Skins לימב על הסט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקליפות על איבר 35 x צלחת פטרי 10 מ"מ. הסר dusts, קריסטלים, סיבים בשכבה הפנימית של העור בעזרת פינצטה קנס כאמור stereomicroscope עם תאורה נמוכה, כדי למנוע צילום נרחב הלבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הקליפות איבר להחליק מיקרוסקופיים דבק ידי מלקחיים טבעת. מניחים את הקליפות בשכבה הפנימית שוכב מעלה בשקופית (כלומר כלפי coverslip). שטחו את הקליפות בזהירות באמצעות פינצטה בסדר להסיר לשאת על כביסה חיץ ידי Kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר אנטי לדעוך התקשורת הרכבה ללא בועות אוויר. אנו משתמשים coverslip 25 "x25". Cure על משטח שטוח בחושך (למשל, באמצעות דגימות רכוב להאריך מגיב זהב ממוקמים לילה בטמפרטורת החדר בחושך לפני הצפייה). עבור אחסון לטווח ארוך, לאטום את coverslip לשקופית ולאחסן ב 4 ° C. </li></ol> 4. Confocal מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת לייזרים מתאים fluorophores. אנו משתמשים Leica SP5 TCS מיקרוסקופ confocal עם שלושה מקורות לייזר כולל ארגון 488nm (עבור Alexa פלואוריד 488 ו-GFP), DPSS 561nm (עבור Alexa פלואוריד 568 ו Cy3) ו HeNe 633nm (עבור Alexa פלואוריד 633, Cy5 ו To-Pro-3) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלי סריקה רציפים כדי למנוע או להפחית את crosstalk שבו כל צבעי בדגימות להכפיל או לשלש מוכתם יהיה נרגש באותו זמן. במצב סריקה סדרתית, תמונות תירשם צו רציפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מידע כללי נוסף על צבעי ניאון ולייזרים עבור עירור ניתן נוסדה בשנת "מיקרוסקופיה confocal עבור ביולוגים" של היבס (2004) </li></ol> 5. נציג תוצאות Whole-Mount מיקרוסקופיה immnofluorescence תווית משולשת confocal בעור forelimb העכבר E15.5 עם נוגדנים סמן הפאן אנדותל התא PECAM-1 (איור 1A-C, D כחול), סמן neurofilament 2H3 (איור 1A ירוק), תא השריר החלק סמן αSMA (איור 1 א ', ב' אדום) עולה דפוס אופייני הסתעפות של העורקים αSMA +, מיושר עם 2H3 + עצבים היקפיים בעור איבר. בנוסף כלי הדם הסתעפות העור זה איבר מודל vasculature משמש ללמוד דפוסים של כלי הלימפה הסתעפות באמצעות נוגדנים את הסמן אנדותל הלימפה תא LYVE-1 (איור 1D, E אדום) Neuropilin2 (NRP2) (1D איור, F ירוק ). <img src="/files/ftp_upload/2620/2620fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. (AC) העורקים להתיישר עם העצבים ההיקפיים בעור איבר עוברי. Whole-Mount תווית משולשת מיקרוסקופיה immnofluorescence confocal עם נוגדנים סמן הפאן אנדותל התא PECAM-1 (AC, כחול), סמן neurofilament 2H3 (A, ירוק), תא השריר החלק סמן αSMA (A ו-B, אדום ) מוצג. בשלב E15.5, 2H3 + העצבים ההיקפיים (חיצים פתוח) לקשר עם העורקים (ראשי חץ) אשר מכוסים על ידי αSMA + לתאי שריר חלק. (DF) הלימפה בכלי הדם בעור איבר עוברי. התווית Triple-מיקרוסקופיה immnofluorescence confocal עם נוגדנים סמן הפאן אנדותל התא PECAM-1 (D, כחול), סמן תא האנדותל הלימפה LYVE-1 (D ו-E, אדום) Neuropilin2 (NRP2) (D ו-F, ירוק ) מוצג. כלי הלימפה הם דמיינו ידי שני LYVE-1 ו NRP2, ואילו LYVE-1 מתבטא גם על ידי משנה של מקרופאגים (ראשי חץ פתוח). בר סולם: 100μm.

<ol><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+distinction+and+angiogenic+interaction+between+embryonic+arteries+and+veins+revealed+by+ephrin-B2+and+its+receptor+Eph-B4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4.</a> Cell. 93, 741-753 (1998).</li>
<li>Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetrical+mutant+phenotypes+of+the+receptor+EphB4+and+its+specific+transmembrane+ligand+ephrin-B2+in+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development.</a> Mol Cell. 4, 403-414 (1999).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מערכת כלי הדם חיונית להתפתחות איבר במהלך embryogenesis כמו גם עבור פונקציות תחזוקה איבר הרבייה אצל מבוגרים, כי הוא מספק מספיק חמצן וחומרים מזינים את האיברים. רשת כלי דם תקין היא מבוססת היטב עם תהליכים מורכבים ורב צעד אנגיוגנזה שבו קיימים רשת נימי הוא מחדש עם מבנים מסועפת מאוד היררכי. למרות עבודות רבות הראו כי מגוון של מולקולות מעורב בתהליכים הללו, זה לא היה ברור עד כמה איברים או רכיבים שלהם לספק את האותות כדי לקדם את התהליך בשלבים של התפתחות כלי הדם, כולל בידול דפוסים האנדותל של כ...

נוגדנים פאן תא האנדותל סמן <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> אוגר ארמני (M) </td><td> Chemicon </td><td> MAB1398Z </td><td> 1:100 דילול # 1 </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> עכברוש (ז) </td><td> BD </td><td> 553369 </td><td> דילול 1:300 </td></tr><tr><td> VEGFR2 </td><td> עכברוש (ז) </td><td> eBioscience </td><td> 14-5821-82 </td><td> דילול 1:200 </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> עכברוש (ז) </td><td> eBioscience </td><td> 13-0341 </td><td> דילול 1:300 </td></tr><tr><td> קולגן IV </td><td> הארנב (P) </td><td> עבד Serotec </td><td> 2150-1470 </td><td> 1:300 דילול # 2 </td></tr></tbody></table> העורקים תא האנדותל סמן <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> Neuropilin1 </td><td> הארנב (P) </td><td> Kolodkin אלכס מעבדה # 3 </td><td></td><td> 1:3000 דילול </td></tr><tr><td> Unc5H2 </td><td> עיזים (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF1006 </td><td> דילול 1:200 </td></tr></tbody></table> ורידי סמן תא האנדותל <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> EphB4 </td><td> עיזים (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF446 </td><td> דילול 1:100 </td></tr></tbody></table> תא האנדותל הלימפה סמן <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> הארנב (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14917 </td><td> דילול 1:200 </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> עכברוש (ז) </td><td> MBL </td><td> D225-3 </td><td> דילול 1:200 </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> הארנב (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5475 </td><td> 1:1000 דילול </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> עיזים (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF2727 </td><td> 1:50 דילול </td></tr><tr><td> Neuropilin2 </td><td> הארנב (P) </td><td> תא האיתות </td><td> 3366 </td><td> 1; 100 דילול </td></tr><tr><td> Podoplanin </td><td> אוגר סורי (M) </td><td> Hybridoma בנק </td><td> 8.1.1 </td><td> דילול 1:200 </td></tr></tbody></table> שריר חלק תא / pericyte סמן <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> αSMA-Cy3 </td><td> עכבר (M) # 5 </td><td> סיגמא </td><td> c-6198 </td><td> 1:500 דילול # 6 </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> הארנב (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5320 </td><td> דילול 1:200 </td></tr><tr><td> SM22α </td><td> הארנב (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14106 </td><td> דילול 1:200 </td></tr></tbody></table> נוגדנים עבור עיתונאי ה-GFP <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> GFP </td><td> הארנב (P) </td><td> Invitrogen </td><td> A11122 </td><td> דילול 1:300 </td></tr><tr><td> GFP </td><td> עכברוש (ז) </td><td> Nacalai tesque </td><td> 04404-84 </td><td> 1:1000 דילול </td></tr><tr><td> GFP </td><td> צ&#39;יק (P) </td><td> Chemicon </td><td> P42212 </td><td> דילול 1:300 </td></tr></tbody></table> נוגדנים עבור כתב LacZ <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> הארנב (P) </td><td> MP ביו </td><td> 55976 </td><td> 1:5000 דילול </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> עיזים (P) </td><td> עבד Serotec </td><td> 4600-1409 </td><td> דילול 1:500 </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> צ&#39;יק (P) </td><td> Abcam </td><td> ab9361 </td><td> דילול 1:200 </td></tr></tbody></table> נוגדנים עבור האקסון הפריפריה <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> 2H3 </td><td> עכבר (M) # 7 </td><td> Hybridoma בנק </td><td> 2H3 </td><td> דילול 1:200 </td></tr><tr><td> Tuj1 </td><td> עכבר (M) # 8 </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td><td> דילול 1:500 </td></tr><tr><td> Peripherin </td><td> הארנב (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB1530 </td><td> 1:1000 דילול </td></tr></tbody></table> נוגדנים להעברת בתאי שוואן <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> BFABP </td><td> הארנב (P) </td><td> תומאס מולר המעבדה # 9 </td><td></td><td> 1:3000 דילול </td></tr></tbody></table> (P): נוגדן polyclonal, (M): נוגדנים חד שבטיים # 1: אנטי ארמני עיזים אוגר-Cy3 (ImmunoResearch ג&#39;קסון 127-165-160) נוגדן צריך לשמש נוגדן משנית. # 2: הנוגדן IV קולגן יכול לשמש כדי לזהות כלי דם לאחר הכלאה ב באתרה. # 3: הנוגדן Neuropilin1 מסופק על ידי חביב במעבדה Kolodkin של אלכס באוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס. כבשה נגד נוגדן אנושי Neuropilin1 זמין במו&quot;פ (AF3870), למרות שאנו לא צריך לבדוק את זה עדיין. # 4: LYVE-1 נוגדנים גם לזהות תת קבוצה של מקרופאגים בעור עובריים. # 5: נוגדנים נגד αSMA הוא עכבר נוגדנים חד שבטיים IgG2a. # 6: נוגדן Cy3-מצומדות αSMA הוא מודגרות שעה 1 בטמפרטורת החדר יחד עם שניותנוגדנים ondary עבור נוגדנים ראשוניים אחרים. # 7: 2H3 נוגדן הוא עכבר נוגדנים חד שבטיים נגד IgG1 neurofilament. # 8: Tuj1 נוגדן הוא עכבר נוגדנים חד שבטיים נגד IgG2a Neuron ספציפיים בכיתה ג&#39;בטא טובולין. # 9: נוגדן (מוח ספציפיים חומצת שומן חלבון מחייב) BFABP מסופק בחביבות על ידי המעבדה של תומאס מולר ב-Max-Delbrück המרכז לרפואה מולקולרית.

whole-mount עבור ניתוח immunohistochemical vasculature לימב עובריים עור: מערכת מודל לחקר המורפוגנזה מסעף דם בעובר

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-Mount ניתוח immunohistochemical הדמיה vasculature כולו מרכזי להבנת מנגנוני הסלולר של הסתעפות המורפוגנזה. פיתחנו את העור איבר vasculature מודל ללמוד פיתוח כלי הדם שבו קיימים מקלעת נימי פרימיטיבי הוא ארגן מחדש לתוך רשת מסועפת של כלי הדם הירארכי. Whole-Mount מיקרוסקופיה confocal עם תיוג מרובים מאפשר הדמיה החזקה של כלי הדם ללא פגע, כמו גם מרכיבים תאיים שלהם כולל תאים, pericytes אנדותל ותאי שריר חלק, באמצעות סמנים ניאון ספציפיים. ההתקדמות מודל זה עור vasculature איבר עם מחקרים גנטיים השתפרו הבנה של המנגנונים המולקולריים דפוסים התפתחות כלי הדם. העור האיבר מודל vasculature נעשה שימוש כדי ללמוד איך העצבים ההיקפיים לספק תבנית מרחבית על בידול ועל דפוסים של העורקים. מאמר זה מתאר וידאו פרוטוקול פשוט חזקים כדי כתם הדם שלם עם נוגדנים ספציפיים כלי הדם נוגדנים משני פלורסנט, אשר ישים עבור איברים עובריים vascularized שבו אנו מסוגלים לבצע את תהליך ההתפתחות של כלי הדם.

אנחנו מציגים אימונוהיסטוכימיה כל הר לייזר מיקרוסקופיית confocal עם תיוג מרובים לניתוח רשת סבוכה היווצרות כלי דם בעור איבר עכבר עובריים.

Whole-mount עבור ניתוח immunohistochemical vasculature לימב עובריים עור: מערכת מודל לחקר המורפוגנזה מסעף דם בעובר

ניתוח אימונוהיסטוכימי של דגימה שלמה (Whole-mount) לצורך הדמיה של מערכת כלי הדם כולה הוא קריטי להבנת המנגנוים התאיים של מורפוגנזה מסועפת. פיתחנו את מודל כלי הדם של עור הגפה כדי לחקור התפתחות וסקולרית, שבה רשת נימיים פרימיטיבית קיימת עוברת ארגון מחדש לרשת כלי דם מסועפת היררכית. מיקרוסקופיה קונפוקלית של דגימה שלמה עם סימון רב-מרכיבי מאפשרת הדמיה חזקה של כלי דם שלמים וכן של מרכיביהם התאיים, כולל תאי אנדותל, פריציטים ותאי שריר חלק, תוך שימוש בסמנים פלואורסצנטיים ספציפיים. התקדמות במודל זה של כלי דם של עור הגפה, בשילוב עם מחקרים גנטיים, שיפרה את ההבנה של המנגנונים המולקולריים של התפתחות ודפוסים וסקולריים. מודל כלי הדם של עור הגפה שימש לחקירת האופן שבו עצבים פריפריאליים מספקים תבנית מרחבית להבחנה ולדפוס של עורקים. מאמר וידאו זה מתאר פרוטוקול פשוט ואמין לצביעת כלי דם שלמים באמצעות נוגדנים ספציפיים לכלי דם ונוגדנים משניים פלואורסצנטיים, אשר ניתן ליישמו באיברים עובריים מכווסים בכלי דם שבהם אנו יכולים לעקוב אחר תהליך ההתפתחות הוסקולרית.

המטרה הכללית של הליך זה היא ביצוע אנליזה אימונוהיסטוכימית בשיטת whole mount לצורך הדמיה של כל מערכת כלי הדם בעור הגפה המתפתחת. דבר זה מושג תחילה על ידי חיתוך ארבע גפיים מהעובר, קיבוע ארבע הגפיים ב-4% paraformaldehyde ב-PBS, ולאחר מכן דהידרטציה שלהן ב-100% methanol. השלב השני הוא שימוש בפינצטה עדינה כדי לקלף את העור בבסיס הגפה.עקבו אחר הקווים הכחולים המקווקווים וקלפו את העור בתוך צלחית המכילה 100% methanol. הסירו את העור מהגפה. לאחר מכן, ביצעו צביעה אימונוהיסטוכימית של עור הגפה באמצעות נוגדנים ראשוניים ספציפיים לכלי דם ונוגדנים משניים פלואורסצנטיים.לבסוף, מיקרוסקופיה קונפוקלית של דגימה שלמה (whole mount) עם סימון רב-ערוצי תאפשר הדמיה רבבתית של כל מערכת כלי הדם בעור הגפה. יתרונה של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ניתוח היסטולוגי של חתכים, טמון בכך שניתוח אימונוהיסטוכימי של דגימה שלמה של כלי הדם בעור הגפה מאפשר לנו לא רק להדגים את כל מערכת כלי הדם, כולל מרכיבי התאים, אלא גם לחקור תהליכי התמיינות, את התבניית תאי כלי הדם ואת ההסתעפות של כלי הלימפה. אני מדגימה את הפרוטוקול יחד עם ד"ר ואינדה, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. עורות של גפיים עובריות נאספים מעכברות נקבות הרות.לאחר הסרת הרחם ושטיפתו, עבדו תחת מיקרוסקופ דיסקציה כדי להפריד ולבודד את העוברים. ברגע שהעוברים בודדו, השלב הבא הוא להסיר את ארבעת ה-LIMS מהעוברים באמצעות פינצטה עדינה. חתכו את ארבעת הגפיים באזור הכתף, ולאחר מכן השתמשו בפינצטה טבעתית כדי להעביר את ארבעת הגפיים לפלטת 24 בארות המכילה קרח.הנח שתי גפיים של עובר (LIMS) לכל באר בשני מיליליטר של 4% PFA (Paraform Hyde) טרי וקר ב-PBS. קבע את הגפיים באמצעות ערבוב עדין במערבל סיבובי (rotator mixer) בטמפרטורה של 4°C למשך לילה. למחרת, הסר את ה-PFA מכל באר והוסף שני מיליליטר של PBS.שטוף את הדגימות במשך חמש דקות תוך ערבוב עדין במערבל mutator בטמפרטורת החדר. חזור על שטיפה זו פעמיים, לסך הכל שלוש שטיפות. לאחר מכן, העבר את ארבע הגפיים לנבובת פוליפרופילן בעלת תחתית עגולה בנפח 5 mL המכילה 100% methanol ואחסן בטמפרטורה של 20°C- במקפיא אנזימים עם בקרת טמפרטורה קריטית וללא פונקציית הפשרה אוטומטית. לאחר אחסון לילה ב-20°C-, ניתן לקלף את העור מהגפה.זהו אחד ההיבטים הקריטיים ביותר של הליך זה, מכיוון שההצלחה של הצביעה וההדמיה העוקבות תלויה בכך שלא ייגרם נזק לעור. העור של הגפה נפרד בקלות מהגפה כאשר היא עוברת דהידרטציה באופן זה, כדי לקלף את העור מארבע הגפיים. ראשית, הניחו את הגפה כאשר הצד הוונטרלי פונה כלפי מעלה.לאחר מכן, באמצעות פינצטה עדינה, בצעו דיסקציה דרך העור ליד בסיס הגפה לכיוון הכף בקו ישר. לאחר מכן, בצעו דיסקציה סביב הגפה כולה, תוך קילוף העור תוך כדי סיבוב הגפה. לאחר שהעור קולף.ארבע הגפיים מתחילות את הצביעה האימונוהיסטוכימית בשיטת whole mount של עור הגפיים. יש להכין מראש שלושה מבחנות מלאי של 50 milliliter עם 75%, 50% ו-25% methanol ב-PBT לצורך רהידרציה. העורות, עור הגפיים, עוברים רהידרציה על ידי אינקובציה בסדרה מדורגת של methanol, מהריכוז הגבוה לנמוך ביותר, למשך חמש דקות בכל שלב.כדי להתחיל, העבירו את עור הגפה למבחנה עגולה מポリפרופילן בנפח 5 מיליליטר המכילה 75% methanol ב-PBT. לאחר חמש דקות במיקסר (mutator mixer), שאבו בזהירות את ה-75% methanol ומלאו שוב ב-50% methanol ו-PBT. לאחר חמש דקות נוספות.החליפו את ה-50%methanol ב-25%methanol ו-PBT. בסיום הדגירה האחרונה, שאבו בזהירות את ה-25%methanol PBT ומלאו שוב ב-PBT.שטפו את עורי הגפיים במשך חמש דקות תוך ערבוב עדין בערבב (mutator mixer) בטמפרטורת החדר. חזרו על שטיפה זו פעם אחת. יש להיזהר כדי למנוע פגיעה בעורי הגפיים במהלך החלפת התמיסות.לאחר שהעור של הגפיים הוחזר למצב רווי מים, חסמו אותם באמצעות תמיסת חסימה מתאימה. דגרו למשך שעתיים עם ערבוב עדין במיקסר מסוג nutt בטמפרטורת החדר. לאחר שעתיים, הניחו את עור הגפיים בצלחת פטרי של 35 על 10 מילימטר. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה טבעתית כדי להעביר את העורות לשפרוret של 2 מיליליטר המכיל 800 microliters של נוגדנים ראשוניים המדוללים בתמיסת חסימה מתאימה.בשלב זה, ניתן להשתמש בו-זמנית במספר נוגדנים ראשוניים המופקים ממינים שונים. דגרו את עורות הגפיים עם ערבוב עדין במיקסר (mutator mixer) בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה; למחרת, הניחו את עורות הגפיים בצלחת פטרי במידה של 35 על 10 מילימטר. העבירו את העורות לשפופרת פוליפרופילן עגולה בתחתית בנפח של 5 מיליליטר המכילה 4 ליטר של תמיסת שטיפה מתאימה.שטפו חמש פעמים למשך 15 דקות בכל פעם תוך ערבוב עדין במכשיר mutator mixer בטמפרטורת החדר. החליפו בזהירות את הבאפר המשומש בבאפר חדש בכל אחד משלבי השטיפה. הכינו את הנוגדנים המשניים כדי להסיר חלקיקים מצומדים של הנוגדנים המשניים.השתמשו במסנן מזרקה עם ממברנת PVDF של 0.22 micron כדי לסנן את תמיסת הנוגדן המשני אל תוך מבחנת צנטריפוגה של 1.5 milliliter. לאחר מכן, צנטריפוגו את הדגימה המסוננת ב-15, 000 RPM למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius כדי להסיר חלקיקים ובועות אוויר. אספו את תמיסת הנוגדן המסוננת למבחנת מיקרו-צנטריפוגה של שני milliliter.בסיום חמשת השטיפות, הניחו את עורות הגפיים בצלחת פטרי של 35 על 10 מילימטר והעבירו אותם לנבובת מיקרו-צנטריפוגה בנפח שני ליטר המכילה 800 µL של נוגדנים שניים בתוך תמיסת החסימה. בשלב זה ניתן להשתמש בו-זמנית בנוגדנים שניים שונים המשורשרים לפלואורופורים ונגזרים ממינים שונים. דגרו את עורות הגפיים בחושך למשך שעה אחת עם ערבוב עדין על מעבב (mutator mixer) בטמפרטורת החדר.לאחר דגירה של שעה אחת, הניחו את עורי הגפיים בצלחת פטרי של 35 על 10 מילימטר והעבירו אותם למבחנה עגולה עם תחתית מ-polypropylene בנפח חמישה מיליליטר המכילה ארבעה מיליליטר של בופר השטיפה המתאים. שטפו חמש פעמים למשך 15 דקות בכל פעם בחושך, תוך ערבוב עדין במיקסר Tator בטמפרטורת החדר, לקראת דימוי במיקרוסקופיה קונפוקלית. יש להרכיב את עורי הגפיים על סלייד לאחר הצביעה האימונוהיסטוכימית.כדי להתחיל בהליך זה, הניחו את עורות הגפיים הצבועים בתוך צלחת פטרי בגודל 35 על 10 מילימטרים, תוך עבודה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי עם תאורה נמוכה. כדי למנוע פוטו-בליצ'ינג (photo bleaching) נרחב, השתמשו בפינצטה עדינה כדי להסיר גבישי אבק וסיבים מהשכבה הפנימית של העורות. העבירו את עורות הגפיים לזכוכית מיקרוסקופ דביקה.הניחו את העורים על הפלסטורה כך שהשכבה הפנימית פונה כלפי מעלה, לכיוון הזכוכיתית. לאחר מכן, השטיחו את העורים בזהירות באמצעות פינצטה עדינה. הסירו שאריות של תמיסת השטיפה בעזרת נייר Kim wipe.הוסיפו מדיום הרכבה מסוג Antifa לעורות והניחו זכוכית כיסוי של 25 על 25 מעל הדגימות. תוך הקפדה על מניעת בועות אוויר, השאירו את הדגימות להתקשות על משטח שטוח בחושך ובטמפרטורת החדר לצורך אחסון ארוך טווח. אטמו את זכוכית הכיסוי לזכוכית העצם באמצעות לק שקוף ואחסנו בטמפרטורה של 4 °C.דפוסי ההיווצרות של עצבים וכלי דם בעור הגפה של עכבר ביום ה-E 15.5 מוצגים בתוצאות מייצגות אלו של מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה קונפוקלית עם סימון משולש של דגימה שלמה (whole mount); אימונופלואורסצנציה של סמן תאי האנדותל pcam one היא בכחול. סמן הנוירופילמנט two H three הוא בירוק, וסמן תאי השריר החלק alpha SMA הוא באדום. תמונות אלו חשפו דפוס התבססות אופייני של עורקים חיוביים ל-alpha SMA, המסומנים בחצי חץ לבן, המיושרים עם עצבים פריפריאליים של two H three, המסומנים בחצים פתוחים, בנוסף להתבססות של כלי הדם.מודל כלי דם של עור הגפה זה יכול לחשוף גם את התבניות של הסתעפות כלי הלימפה באמצעות הסמן לתאי אנדותל לימפטיים LYVE1 המוצג באדום ו-Neuropilin 2 המוצג בירוק; כלי לימפה מזוהים הן על ידי LYVE1 והן על ידי NRP2, בעוד ש-LYVE1 מבוטא גם על ידי תת-קבוצה של מקרופאגים, המסומנים על ידי ראשי החיצים הפתוחים. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של כלי דם לחקור את התבניות המורכבות ואת תהליכי ההגבהה של כלי הדם במהלך התפתחות רקמות, תיקון רקמות ובמצבי מחלה.

whole-mount-immunohistochemical-analysis-for-embryonic-limb-skin

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר שיטה תיוג עור וכלי דם עובריים התימוס.

שיטה תיוג vasculature ב עכברים עובריים

הרשתית העכברית הילוד מספקת מודל מאופיין היטב פיסיולוגי של אנגיוגנזה, המאפשר חקירה של התפקידים של גנים או תרופות שונים המווסתים אנגיוגנזה...

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

כלי דם הוא מפתח לגישות בהנדסת רקמות מוצלחת. לכן, טכנולוגיות אמינות נדרשות כדי להעריך את ההתפתחות של רשתות כלי דם ברקמות מבנים. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה, יעיל וחסכונית כדי לחזות ולכמת כלי דם בגוף חי.

עור מלא פגמים דגם להערכת כלי דם של Biomaterials<em&gt; בVivo</em

אנו מתארים גישה מיקרו עבור הדור של בלופ arteriovenous (AV) כמודל לניתוח כלי דם in vivo בסביבה מבודדת היטב מאופיין. מודל זה הוא לא רק שימושי עבור חקירת אנגיוגנזה, אלא גם מתאים באופן אופטימלי עבור הנדסה vascularized axially ורקמות להשתלה.

Arteriovenous (AV) Loop במודל בעלי חיים קטנים לחקר אנגיוגנזה והנדסת רקמות כלי דם

אנו מציגים פרוטוקול לניתוח הכליליים כולן לבבות בעכברים עובריים עד E15.5, בשיטות מכתימות אימונולוגיים תקן ואחריו אישור אופטי מיקרוסקופיה confocal. טכניקה זו מאפשרת הדמיה של כלי דם בכל הלב השלם ללא הצורך בניתוח רב-פעמי של סעיפי סדרתי.

ניתוח של כלי דם כליליים ב הותרו עוברי לבבות

פרוטוקול זה מדגים שיטה מבוססת הקרינה לדמיין את כלי הדם וכדי לכמת את המורכבות שלה tropis Xenopus . כלי הדם ניתן הדמיה דקות לאחר הזרקת צבע פלואורסצנטי לתוך הלב הפועם של עובר לאחר מניפולציות גנטיות ו / או תרופתי ללמוד התפתחות הלב וכלי הדם in vivo .

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

עבודה זו מדגימה גישה חדשנית להעריך את התפשטות, הבחנה, ואת היכולת להרכיב פוטנציאל של תאי גזע אנדותל כלי הדם (VESCs) באמצעות השתלת כרית שומן החלב ואחריו הכנת רקמות הר שלם עבור תצפית מיקרוסקופית. א השושלת מעקב אחר אסטרטגיה לחקור את ההתנהגות של VESCs in vivo מוצג גם.

רומן חדש פאט שומן טכניקת השתלת לדמיין את כלי השיט הדור של כלי הדם בתאי גזע אנדותל

כאן נתאר שיטת הדמיה כולה-הר ברזולוציה גבוהה בעור האוזן והעכבר כולו למבוגרים, אשר מאפשרת לנו לדמיין מורפוגנזה מסעף והמתבנת של העצבים ההיקפיים, כלי הדם, כמו גם התפלגות תא החיסון.

כולה-הר מיקרוסקופיה קונפוקלית לעור מבוגר האוזן: מערכת מודל ללמוד מורפוגנזה מסעף נוירו-וסקולרית והפצה תא החיסון

בדיקה זו משתמשת בתאי גזע עובריים של עכברים המתמיינים לגופי עובר בתרבית בג'ל קולגן תלת-ממדי כדי לנתח את התהליכים הביולוגיים השולטים באנגיוגנזה נובטת במבחנה. הטכניקה יכולה להיות מיושמת לבדיקת תרופות, מידול מחלות, ולחקר גנים ספציפיים בהקשר של מחיקות קטלניות עוברית.

במבחנה בדיקת הנבטה תלת מימדית של אנגיוגנזה באמצעות תאי גזע עובריים של עכבר לצורך מידול מחלות כלי דם ובדיקות סמים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל ייחודי ורלוונטי מבחינה קלינית של מחלת עורקים היקפית המשלב עורק הירך ואלקטרו-קרישת ורידים עם ניהול מעכב סינתאז תחמוצת החנקן כדי לגרום לנמק אחורי בעכברים FVB. זלוף תוך-לבבי DiI משמש לאחר מכן להדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של כלי הדם של משטח כף הרגל.

הדמיה תלת מימדית ברזולוציה גבוהה של כלי הדם של משטח כף הרגל במודל נמק הינדלימב מורין

פרוטוקול זה מציג שיטה מהירה להדמיית כלי דם תלת מימדית כמותית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור. יעילות השיטה מודגמת באמצעות מערכת עורקי קשת הלוע של מודל עובר האפרוח, עם כוחות המודינמיים המכומתים באמצעות דינמיקת נוזלים חישובית.

הדמיה מהירה ברזולוציה גבוהה של כלי דם של בעלי חיים קטנים למחקרים כמותיים

למדו שיטת whole-mount immunohistochemistry לניתוח רשתות כלי דם בעור גפיים עובריים בעכברים. טכניקה זו משלבת מיקרוסקופיית קונפוקל לדימוי ברזולוציה גבוהה של מבני וסקולריים בתהליכי התפתחות.

Whole-mount עבור ניתוח immunohistochemical vasculature לימב עובריים עור: מערכת מודל לחקר המורפוגנזה מסעף דם בעובר

גלה סרטונים נוספים