כרומוזום מלכודת הידיעות AP עבור זיהוי לטווח ארוך אינטראקציות DNA

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לגלות ולזהות שותפי DNA קשורים לטווח ארוך. זה מושג על ידי קיבוע, ליזיס תאים ועיכול של DNA על ידי אנזים ההגבלה הראשון ואחריו קשירה ליצירת DNA כימרי המורכב ממקטעים משני הגנים הקשורים. המקשרים הבאים מתווספים ל-DNA הכימרי לאחר עיכול ההגבלה השני כדי להקל על ההגברה שלו, הגברת PCR מתבצעת לאחר מכן באמצעות פריימרים ספציפיים ל-DNA של מקשר ופיתיון על מנת להשיג כמויות מספיקות של שברי ה-DNA הקשורים מתקבלות תוצאות המראות את שותפי ה-DNA הקשורים לטווח הארוך עם ה-DNA של הפיתיון על סמך ניתוח רצף של שברי ה-DNA המוגברים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו לכידת אישור כרומוזומים או שלוש C, הוא שניתן להשתמש ב-A-C-T-S-A כדי לזהות שותף DNA לא ידוע לטווח ארוך ביעילות. ואילו שלוש C התעוררו לצורך אימות של אינטראקציות שנחשדו בעבר בלבד. כדי להתחיל בתרבית פרוטוקול זו, תאים אנושיים באינקובטור סיפקו 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס עד שהם מתכנסים ל-80 עד 90%.

תאי לוקמיה חומציים לנשף אנושי משמשים להדגמה זו. אסוף את התאים על ידי שפיכתם לצינור NOC של 50 מיליליטר וצנטריפוגה במהירות של 1200 סל"ד למשך 15 דקות. לאחר צנטריפוגה, הסר את המדיום על ידי שאיפה.

הוסף חמישה מיליליטר של מדיום תרבית כדי להשעות מחדש את כדורי התא. לאחר ספירת התאים עם ציטומטר המו, קח בערך פעם אחת 10 לתאים השביעיים לנפח של 40 מיליליטר עם RPMI 1640, מדיום המכיל 10% FBS. לאחר מכן הוסף 1.7 מיליליטר של 37% פורמלדהיד כדי לתקן את הכרומטין המדולל.

דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בניעור עדין. לאחר הדגירה יש להרוות את התגובה עם 2.4 מיליליטר של שני גליצין מולארי. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה למשך 15 דקות ב-1200 סל"ד וארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הסרת הסופר נטין, שטפו את הכדור פעם אחת עם 40 מיליליטר PBS קר כקרח ואז צנטריפוגה את הדגימה כדי לאחזר את כדור התא השטוף השעו מחדש את הגלולה שהתקבלה ב-40 מיליליטר של מאגר ליזה קר כקרח עם מעכבי פרוטאז טריים שנוספו ו-0.1 מילי-מולרי PMSF דגרו על הדגימה בחדר קר עם סיבוב למשך 90 דקות. לבסוף, צנטריפוגה של הדגימה ב-2,500 סל"ד למשך 15 דקות והסר את הסופר נאטין וקבל את הגרעינים המבודדים. השעו מחדש את הגרעינים ב-0.5 מיליליטר של מאגר XNEB אחד שלוש והוסיפו 15 מיקרוליטר של 10% SDS.

דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה עם ניעור. לאחר מכן הוסף 45 מיקרוליטר של 20% טריטון X 100 כדי לבודד את ה-SDS ולדגור שוב ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת עם טלטול ועלייה של אחת כפול 10 לשישית. הגרעינים או כ -15 מיקרוגרם משמשים לעיכול אנזימי הגבלה ל -55 מיקרוליטר של תמיסת גרעינים.

הוסף 433 מיקרוליטר של מאגר XNEB אחד שלוש ו-12 מיקרוליטר של BGL שתיים. כדי ליצור נפח תגובת עיכול כולל של 500 ליטר, דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת יש לנטרל את אנזים ההגבלה על ידי הוספת 95 מיקרוליטר של 10% SDS ולפרק את האנזים על ידי חימום ב-65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

באמבט מים, הוסף שבעה מיליליטר של מאגר קשירה אחד x ו -360 מיקרוליטר של 20% טריטון X 100. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. מנמיכים את הטמפרטורה ל -16 מעלות צלזיוס ומוסיפים 50 מיקרוליטר של 400 יחידות למיקרוליטר.

T ארבע DNA ליגאז. אפשר לתגובת הקשירה לדגור בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות ולאחר מכן בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר השלמת הקשירה, הוסיפו 300 מיקרוגרם של פרוטאינאז K ודגרו בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

לאחר מכן מוסיפים חמישה מיקרוגרם של RNAA ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. טיהור DNA על ידי מיצוי פנול כלורופורם וזירוז DNA באיזופרופנול ממיסים את ה-DNA המשקע ב-150 מיקרוליטר מים מזוקקים סטריליים. כדי להוסיף מקשרים ל-DNA הכימרי, עכל תחילה את ה-DNA על ידי דגירה של שני מיקרוגרם של DNA מטוהר עם חמש יחידות של msp, אחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך ארבע עד שש שעות לאחר העיכול, השבת MSP אחד ב-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר מכן זרז את ה- DNA באתנול עם מיקרוליטר אחד של חמישה מיליגרם למיליליטר. גליקוגן ממיס את חיך ה-DNA שנוצר ב-50 מיקרוליטר מים מזוקקים סטריליים. לאחר מכן, מערבבים 50 מיקרוליטר של MSP, DNA מטופל אחד עם שני מיקרוליטר של 20 מיקרו-מולארי מקשר אוליגונוקלאוטיד L ומיקרוליטר אחד של 20 מיקרו-מולרי אוליגונוקלאוטיד S, ואז מוסיפים מיקרוליטר אחד של מים מזוקקים סטריליים ושישה מיקרוליטרים של 10 XT, ארבעה DNA Ligase buffer.

מכסים את התערובת בשעווה נוזלית. דנטורציה של האוליגונוקלאוטידים ב-50 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת והניחו להתקרר בהדרגה ל-10 מעלות צלזיוס בשיפוע של 0.5 מעלות צלזיוס לדקה. בעזרת מחזור תרמי, הוסף מיקרוליטר אחד של 400 יחידות למיקרוליטר T ארבע DNA ליגאז ודגר את התגובה ב-15 מעלות צלזיוס בן לילה.

למחרת יש לטהר את ה-DNA הקשור באמצעות ערכת טיהור PCR מהירה של קאיה ולשטוף פנימה 50 מיקרוליטר של מים מזוקקים סטריליים. בחר פריימר לאזור הספציפי של ה-DNA שיש לחקור עבור אינטראקציות ארוכות טווח. בדוגמה זו, הבל ישמש כפריימר או כפיתיון.

הכן את ה-DNA המטוהר ל-PCR הסיבוב הראשון על ידי שילוב של מיקרוליטר אחד של ה-DNA המטוהר עם מיקרוליטר אחד של 20 מיקרו-מולארי המסוגל פריימר ספציפי אחד, 46 56, ומיקרוליטר אחד של 20 פריימר ספציפי לקישור מיקרו-מולרי 29 63. לאחר מכן הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של שלושה x ClinTech, DNA פולימראז קוקטייל אחד שעורבב בעבר עם 32 P-D-C-T-P על פי הפרוטוקול הכתוב, ואחריו שלושה מיקרוליטרים של מים מזוקקים סטריליים. בצע הגברת PCR באמצעות המחזור התרמי של PCR להתחלה חמה המתואר בפרוטוקול הכתוב לאחר השלמת מחזור ה-PCR.

טהר את מוצרי ה-PCR הסבב הראשון באמצעות ערכת טיהור PCR מהירה של קאיה ב-30 מיקרוליטר מים מזוקקים סטריליים. השתמש במיקרוליטר אחד של מוצר ה-PCR הראשון שדולל 100 פעמים כדי לבצע סבב שני של PCR באמצעות פריימרים מקוננים על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של 20 מיקרו-מולארי המסוגל פריימר ספציפי אחד, 46 26 ומיקרוליטר אחד של 20 פריימר ספציפי לקישור מיקרו-מולרי. 29 61.

שוב, הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של שלושה x ClinTech, DNA פולימראז, קוקטייל אחד ושלושה מיקרוליטרים של מים מזוקקים סטריליים. בצע את הסבב השני של PCR באמצעות לוח זמנים תרמי של 25 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות. 67 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך דקה, ולאחר מכן הארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

דמיין את מוצרי ה-PCR על ידי הפעלת ג'ל עמוד אוריאה של 5% ולאחר מכן סריקת המסך החשוף בהדמיית פוספו. ניתן למחזר כל רצועת PCR מהג'ל על ידי המסת רצועות הג'ל בשפופרת einor המכילה 60 מיקרוליטר מים מזוקקים סטריליים ודגירה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. צנטריפוגה. מוצרי הג'ל המומסים לזמן קצר ב -10, 000 סל"ד למשך 10 שניות.

לאסוף את כל הדגימות. הסר מיקרוליטר אחד לשימוש כתבנית ה-DNA לביצוע PCR עם התיקון הראשוני. 29 61 46 26.

באמצעות אותם תנאים כמתואר לעיל, לאחר טיהור וניתוח ריצוף ניתן לבצע באמצעות כלי מקוון לקביעת מיקום כרומוזומלי. ברגע שהגעתם לאתר הביואינפורמטיקה של הגנום, לחצו על blatt כדי ליצור חלון חדש ולהדביק את רצף ה-DNA. לאחר הגשת רצף ה-DNA, יופיעו תוצאות החיפוש של BLATT.

לחץ על הדפדפן על הלהיט עם 100% זהות כדי לחשוף את המיקום של רצף ה-DNA. האזור היחיד המסוגל שימש כפיתיון לקביעת אינטראקציות ה-DNA ארוכות הטווח שלו. שני BGL, שני אתרים ו-BAM H אחד, אתר אחד נבחרו לבדיקת A CT בסבב השני של ערכת פריימר PCR, 46, 26, 29, 61 שימש להגברת M1 המסוגל, 46.30, 29, 61 שימש ליכולת M 2 ו-46, 36, 29, 61 שימש ל-M 3.

דפוס ג'ל טיפוסי חושף רצועה אחת עד כמה רצועות כפי שמוצג כאן עבור מסוגל M1, מסוגל M שתיים ומסוגל M שלוש כאן. רצף ה-DNA של M1 המסוגל לשיבוט מוצג כדי להדגים שכל שבר מבדיקת A CT מורכב משני מקטעי DNA משולבים. מקטע אחד נגזר מאזור ה-DNA של הפיתיון ואילו המקטע השני מגיע מבן הזוג המשויך.

המקטעים מחוברים זה לזה על ידי רצף זיהוי אנזימי ההגבלה הראשון. רצף זיהוי האנזים השני יופיע בסוף רצף השותפים המשויך. שבר ה-M1 המשובט מכיל DNA מאזור ABLE אחד הממוקם בכרומוזום 9 Q 32.4, והשותף הקשור ממוקם בכרומוזום 3 P 3, שזוהה כ-proc two.

באופן דומה, השותף המסוגל M 2 הקשור היה ממוקם לכרומוזום 5 Q 21.1 בעוד ששיבוט M 3 זוהה כקשר תוך כרומוזומלי ליד לוקוס ABLE אחד בניגוד לשלוש בדיקות C. המתודולוגיה המתוארת בסרטון זה תבחר את האינטראקציות ארוכות הטווח הנפוצות ביותר. עם זאת, על ידי הגדלת מספר מחזורי ה-PCR R, ניתן לזהות אסוציאציות נוספות פחות תכופות גם באמצעות אזור ההטבעה והבקרה או ICR בלוקוס IGF 2 H 19 כ-DNA פיתיון בתאי פיברבלסט עכברים, תוכניות מחזוריות שונות יושמו בסבב הראשון והשני של PCR בבדיקת A CT.

בדיקת A CT יכולה לשמש גם לזיהוי הבדלים בארכיטקטורה גרעינית ואינטראקציות ארוכות טווח בין תאים נורמליים לתאים סרטניים. רקמת המעי הגס הרגילה ורקמת סרטן המעי הגס הומוגניות ובדיקת A CT בוצעה בהתאם להליכים המתוארים כאן. מוצג כאן מבנה ה-DNA של אזור ה-ICR בלוקוס IGF שני H 19 ובגן IGF שני dpn.

שני אתרים לבדיקת A CT מסומנים פריימרים המשמשים בסיבוב השני PCR מסומנים על ידי חצים ומספרים בצבעים שונים. דפוס הג'ל של בדיקת A CT מייצג את תוצאות ה-PCR באמצעות פריימר 29, 61 עם זוג פריימר 41, 61, 41, 63, 51, 45 ו-51, 51, 51. רצועות ייחודיות המופיעות רק ברקמת המעי הגס הרגילה מסומנות בחצים צהובים, ואותן רצועות שהופיעו רק ברקמת סרטן המעי הגס מסומנות בחצים אדומים לאחר התפתחותו.

טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של השוק לחקור ארכיטקטורה גרעינית וויסות גנים בצורה תלת מימדית.