Name: כרומוזום מלכודת הידיעות AP עבור זיהוי לטווח ארוך אינטראקציות DNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: למדו את שיטת ACT לזיהוי אינטראקציות DNA לטווח ארוך בתאי לוקמיה מיאלואידית אנושית. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לגלות שותפים גנומיים לא ידועים ולהבין את ארכיטקטורת הגרעין ורגולציית גנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו בזכות אדל Murell ו וולף רייק מאוד לשיתוף פרוטוקול 3C שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי מחלקת הביטחון של שירות המחקר של המחלקה לענייני יוצאי צבא.

1. פורמלדהיד קיבעון של ארוכי טווח אינטראקציות הכרומטין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התא האנושי והתרבות קו HL-60 במדיום RPMI1640 עם FBS 15% ו 1 x פניצילין / סטרפטומיצין כדי מפגש 80-90% באינקובטור מסופק עם 5% CO 2 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף התאים לתוך צינור Nunc 50 מ"ל, צנטריפוגה בסל"ד 1200 למשך 15 דקות ולאחר מכן להסיר את המדיום על ידי שאיפה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ"ל של מדיום תרבות resuspend את כדורי תא, לספור את התאים בעזרת hemocytometer. קח כ 1 x 10 7 תאים בהיקף של 40 מ"ל עם FBS RPMI1640 / 10%, ולאחר מכן להוסיף 1.7 מ"ל של פורמלדהיד 37% כדי לתקן את הכרומטין לדלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות עם רעד עדין, ולאחר מכן להרוות עם 2.4 מ"ל של גליצין 2M. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 1200 סל"ד ב 4 ° C, ולהסיר את supernatant. שטפו את הכדור פעם אחת עם 40 מ"ל קרח קר PBS, ואז לסובב את גלולה ולהסיר את PBS. </li></ol> 2. תא תמוגה לבודד גרעינים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 40 מ"ל של חיץ קרים תמוגה (10 mM טריס-HCl, pH8.0, 10 mM NaCl, 0.2% NP-40) עם מעכבי פרוטאז הוסיף טרי (1:500 דילול) ו 0.1 מ"מ PMSF. דגירה בחדר קר עם סיבוב במשך 90 דקות, צנטריפוגה בסל"ד 2500 למשך 15 דקות, ולהסיר את supernatant. </li></ol> 3. אנזים הגבלת העיכול עם Bgl II <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הגרעינים ב 0.5 מ"ל של 1 x 3 חוד חיץ, ולהוסיף 15 μlof SDS 10%. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם טלטולים, ולאחר מכן להוסיף 45 μl של 20% Triton X-100 כדי לעקל SDS. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש aliquot של גרעינים 1 x 10 6 (כ -15 מיקרוגרם, 1 / 10 של התאים המקוריים) לעיכול אנזים הגבלה. קח את 55 μl של פתרון גרעינים משלב 3.1 ולעשות עד μl 500 עם 433 μl של חיץ 1 חוד x 3 ו 12 μl של Bgl II (50U/ul). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> 4. קשירת מקטעי דנ"א אינטראקציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית את האנזים הגבלה על ידי הוספת 95 μl של 10% SDS, ו לפגל על ​​ידי חימום על 65 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 7 מ"ל של קשירת חיץ x 1 (30 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT, 1 mM ATP) ו - 360 μl של טריטון 20% X-100 ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את הטמפרטורה ל 16 מעלות צלזיוס ומוסיפים 50 μl של U 400 / μl האנזים T4 DNA. דגירה המדגם על 16 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות ואז בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li></ol> 5. ה-DNA טיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 מיקרוגרם של proteinase K, ו לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיקרוגרם של RNase A ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר DNA על ידי מיצוי פנול / כלורופורם, ו-DNA המשקע ב isopropanol. ממיסים-DNA של 150 μl מים מזוקקים סטריליים. </li></ol> 6. עיכול עם MSP אני ואת קשירת עם linkers oligonucleotide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 2μg מטוהרים DNA עם 5 יחידות של MSP אני ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4-6 שעות. להשבית MSP אני על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן להאיץ את ה-DNA של אתנול עם μl 1 של גליקוגן מ"ג / 5 מ"ל. ממיסים את גלולה דנ"א 50 μl של מים מזוקקים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 50 μl של ה-DNA אני שטופלו MSP עם 2 μl של L 20 oligonucleotide מקשר מיקרומטר (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 "), 1 μl של 20 מיקרומטר oligonucleotide S (5'-cggtgaatc-3"), 1 μl של מים מזוקקים סטריליים 6 μl של 10 x למאגר דנ"א האנזים T4. מכסים את התערובת עם שעווה נוזלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oligonucleotides לפגל על ​​50 מעלות צלזיוס למשך דקה 1 ולאפשר להתקרר בהדרגה עד 10 מעלות שיפוע 0.5 C / דקה · ב Cycler תרמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של 400 U / DNA μl האנזים T4 ו לדגור על 15 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לטהר את הדנ"א מקשר-ligated בעזרת ערכת ה-PCR QIAquick טיהור, elute ב 50 μl של מים מזוקקים סטריליים. </li></ol> 7. PCR הגברה רצף ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פריימר לאזור מסוים של הדנ"א שאתם רוצים לבחון את יחסי הגומלין ארוכי הטווח (כלומר, "פיתיון"). בדוגמה זו, אנו משתמשים ABL-1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1 μl של ה-DNA מטוהרים כדי לבצע סיבוב הראשון באמצעות PCR 1 μl של 20 מיקרומטר פריימר ABL -1 ספציפי # 4656 (5'-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 "), 1 μl של 20 מיקרומטר פריימר ספציפי מקשר # 2963 (5'- gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3 "), 3μl של 3 x Klen DNA פולימראז תקי אני קוקטייל 3 μl של מים מזוקקים סטריליים. שני μl של 32 P-dCTP מתווסף μl 100 של 3 x תקי DNA פולימראז Klen אני קוקטייל לפני הגברה PCR. מחזור תרמית התחלה PCR חם היא 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 95 ° Cfor 2 דקות, 18 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 65 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, 72 ° C למשך דקה 1: סיומת סופי מבוצע על 72 ° Cבמשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את המוצרים הראשונים בסיבוב PCR בעזרת ערכת ה-PCR QIAquick טיהור, ו-DNA elute ב 30 μl של מים מזוקקים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1 μl של 100 x בדילול first מוצר PCR לבצע הסיבוב השני של ה-PCR בעזרת פריימרים מקוננים על ידי הוספת 1 ​​μl של 20 מיקרומטר ABL-1 פריימר ספציפי # 4626 (5'-ggagaatttttatctgcctctgtga-3 ") (איור 1 א), 1 μl של 20 מיקרומטר של פריימר ספציפי מקשר # 2961 (5'-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 "), 3 μl של 3 x Klen DNA פולימראז תקי אני קוקטייל 3 μl של מים מזוקקים סטריליים. לוח הזמנים של רכיבה תרמית היא 25 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 67 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, 72 ° C עבור 1 דקה, ואחריו סיומת על 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את מוצרי ה-PCR על ידי הפעלת 5% אוריאה-PAGE ג'ל וסריקה המסך נחשף PhosphoImager (איור 1b). להקה כל PCR ניתן למחזר מן הג'ל על ידי המסת את רצועות ג'ל בשפופרת Eppendorf המכיל 60 μl של מים מזוקקים סטרילי, דוגרים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. צנטריפוגה בקצרה בסל"ד 10,000 עבור 10 שניות לאסוף את כל דגימות. הסר 1 μl להשתמש כתבנית ה-DNA כדי לבצע PCR עם 2961/4626 תחל זוג באמצעות באותם תנאים כפי שתואר לעיל. ניתוח רצף יכול להתבצע לאחר טיהור באמצעות ערכת ה-PCR QIAquick טיהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצפי DNA מנותחים באמצעות כלי מקוון כדי לקבוע את המיקום הכרומוזומלי שלהם באתר האינטרנט: http://genome.ucsc.edu (איור 1 ג'). לחץ על "בלאט" להיכנס חלון חדש המאפשר להדביק רצף ה-DNA, חלון חדש מופיע לאחר לחיצה על 'שלח', ומראה את' תוצאות חיפוש בלאט ". לחץ על 'הדפדפן' של פגע עם זהות 100% כדי להיכנס לחלון הבא כדי להראות את מיקומו של רצף ה-DNA. </li></ol> 8. נציג תוצאות 1. ACT assay באמצעות ABL-1 באזור כפיתיון כדי לקבוע את ה-DNA שלה אינטראקציות ארוכות טווח כמוצג באיור 1a, שני אתרי Bgl השנייה ואחד BamH אני באתר נבחרו assay את המעשה. בסיבוב השני של ה-PCR, תחל להגדיר 4626/2961 שימש להגביר ABL-M1, 4630/2961 שימש ABL-M2, ו 4636/2961 שימש ABL-M3. דפוס אופייני ג'ל מראה אחת כמה להקות (איור 1b). כל קטע מן assay ACT מורכב משני חלקים DNA משולב: קטע אחד נגזר באזור DNA הפיתיון, ואילו במגזר השני נובע השותף הקשורים, אשר הצטרפו למגזר באזור הפיתיון על ידי רצף הגבלה first אנזים הכרה. רצף second הכרה אנזים יופיעו בסוף רצף שותף הקשורים (איור 1 ג). משובטים ABL-M1 שבר מכיל DNA מאזור ABL1 הממוקם בכרומוזום 9q32.4 מ +133,592,306-133,592,399, והשותף הקשורים ממוקם בכרומוזום 3p13 מ +71,869,882-71,870,107. זהותם של השותפים הקשורים מתגלים על ידי פיצוץ רצפים שלהם באמצעות דפדפן הגנום UCSC (GRCh7/hg19 שוחרר בפברואר, 2009). PROK2 זוהה כשותף הקשורים ב מוקד chr3p13. כמו כן, השותף ABL-M2 הקשורים היה מקומי כדי chr5q21.1, בעוד שיבוט ABL-M3 זוהה העמותה תוך כרומוזומלית ליד מוקד-1 ABL. 2. קביעת נפוצה פחות אינטראקציות ארוכות טווח באמצעות assay ACT מבחני אחרים המבוססים על 3C דיווחו שותפים רבים יותר אינטראקציה מאשר שיש לנו שמוצג באיור 1 ובבית Igf2 / H19 מוקד 12. המתודולוגיה שיש לנו התווה יבחר את יחסי הגומלין הנפוצה ביותר לטווח ארוך. עם זאת, על ידי הגדלת מספר מחזורי ה-PCR, ניתן לזהות נוספות, עמותות פחות תכופים, כמו גם (איור 2). 3. הבדלים אינטראקציות ארוכות טווח בתאי סרטן בהשוואה לרקמות. Assay ACT יכול לשמש גם כדי לזהות הבדלים בארכיטקטורה גרעיני אינטראקציות ארוכות טווח בין תאים נורמליים לתאים סרטניים (איור 3). הבדלים אלה עשויים לשקף שינויים בארכיטקטורה גרעיני המתרחשים במהלך שינוי התא, ובכך assay זה עשוי בסופו של דבר להיות ישימה למטרות אבחון. דפוסי ג'ל דומים המתרחשים הן נורמליות רקמות סרטן ציינו כי assay ACT הוא אמין לשחזור. בעוד assay ACT ניתן לזהות DNA ארוך טווח שותפים, ניתוחים נוספים, כגון דגים מבחני CHIP, נדרשים לאמת את נוכחותם של עמותות זיהו בין לוקוסים הרחוק. מחקרים גנטיים, פיזיולוגיים ביוכימיים אז יכול להיות מבוצע על מנת להבהיר את ההשלכות הביולוגיות של עמותות אלה DNA ארוך טווח. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1 ACT assay באמצעות ABL-1 אזור ה-DNA כמו פיתיון ב HL-60 תאים. א ה-DNA structיור באזור 1-ABL. אנזים ההגבלה הראשונה השתמשו בחוק assay היה Bgl השנייה. Primers לסיבוב השני של ה-PCR מסומנים גם על ידי חיצים ומספרים פריימר המקביל. ב ג'ל דפוס של assay לפעול 5% אוריאה עמודים. זוג פריימר 4626/2961 שימש הגברה שיבוט ABL-M1 ב PCR מקוננות, 4630/2961 שימש שיבוט ABL-M2, ו 4636/2961 שימש שיבוט ABL-M3. ג רצף ה-DNA של שיבוט ABL-M1. קטע ה-DNA מ-DNA 1-ABL הפיתיון מסומן באדום, ואת שותף DNA הקשורים מסומן ב ציאן. Bgl השנייה באתר (AGACTC) היה מסומן ירוק, MSP אני באתר (CCGG) מסומן בסגול. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2 מחזורי PCR להשפיע על תוצאות ACT assay. שימוש בשלט החתמה האזור (ICR) בשעה מוקד Igf2/H19 כמו פיתיון DNA בתאים פיברובלסטים עכבר, תוכניות רכיבה שונים יושמו את הסיבוב הראשון והשני של ה-PCR ב assay את המעשה. 18-20 מחזורים בסיבוב הראשון של ה-PCR לא להגביר אות מספיק כדי להיות דמיינו. עשרים וחמישה מחזורים בתוצאות second-PCR בלהקות ברורה, תוך הגדלת מספר מחזורי לסיבוב השני של ה-PCR המושרה דפוס למרוח בנוסף להקות יותר. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3 איתור של הבדלים בארכיטקטורה גרעיני בין רקמת המעי הגס נורמלי סרטן רקמות המעי הגס assay ACT. A. מבנה ה-DNA של האזור ICR בבית מוקד IGF2/H19 ואת הגן IGF2. DPN אתרים II עבור assay ACT מסומנים. Primers בשימוש השני בסיבוב PCR מסומנים על ידי חצים ומספרים בצבעים שונים אשר מתאימות כל נתיב ב פאנל של הדמות. ב ג'ל דפוס של assay לפעול 5% אוריאה עמודים. רקמת המעי הגס רגיל MAD03-1423 ו - סרטן המעי הגס רקמות MAD04-149 התקבל רשת שיתופית רקמה אנושית (CHTN) החטיבה המערבית. לאחר כל רקמת המעי הגס היה הומוגני, assay ACT בוצע בעקבות הליכים המתוארים להלן. ליין 1 מייצג את תוצאות ה-PCR באמצעות זוג פריימר # # 2961and 4161 (5'-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 ") שכותרתו בוורוד בפאנל; מסלול 2 מייצג את תוצאות ה-PCR באמצעות זוג פריימר # # 2961 ו - 4163 (5'-3-gccgcgcggccacttccgattcc ') מסומן בכתום בפאנל: מסלול 3 מייצג את תוצאות ה-PCR באמצעות זוג פריימר # # 2961 ו - 5145 (5'-gccatgcaggtaggatttgagctg-3 ") שכותרתו בכחול בפאנל: מסלול 4 מייצג את תוצאות ה-PCR באמצעות זוג פריימר # 2961 ו # 5151 (5'-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3 ") שכותרתו בירוק בלוח א להקות ייחודיות שמופיעות רק ברקמות המעי הגס נורמלי מסומנים על ידי חצים צהובים, ואלה הלהקות שהופיעו רק ברקמת סרטן המעי הגס מסומנים ב החצים האדומים. ICR, שליטה באזור החתמה, DMR, אזור מפוגל שונים.

<ol><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li>
<li>Apostolou, E., Thanos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+Infection+Induces+NF-kappaB-dependent+interchromosomal+associations+mediating+monoallelic+IFN-beta+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression.</a> Cell. 134, 85-96 (2008).</li>
<li>Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+model+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional model of the yeast genome.</a> Nature. 465, 363-367 (2010).</li>
<li>Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchromosomal+interactions+and+olfactory+receptor+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice.</a> Cell. 126, 403-413 (2006).</li>
<li>Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+differentially+methylated+regions+partitions+the+imprinted+genes+Igf2+and+H19+into+parent-specific+chromatin+loops%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops.</a> Nat Genet. 36, 889-893 (2004).</li>
<li>Schoenfelder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat Genet. 42, 53-61 (2010).</li>
<li>Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchromosomal+associations+between+alternatively+expressed+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interchromosomal associations between alternatively expressed loci.</a> Nature. 435, 637-645 (2005).</li>
<li>Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+among+distant+regulatory+elements+at+the+beta-globin+locus+requires+GATA-1+and+FOG-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1.</a> Mol Cell. 17, 453-462 (2005).</li>
<li>Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+homologous+chromosome+pairing+marks+the+onset+of+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation.</a> Science. 311, 1149-1152 (2006).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li>
<li>Berkum, N. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C%3A+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Ling, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+mediates+interchromosomal+colocalization+between+Igf2%2FH19+and+Wsb1%2FNf1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1.</a> Science. 312, 269-272 (2006).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+%27C%27s+of+chromosome+conformation+capture%3A+controls%2C+controls%2C+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nat Methods. 3, 17-21 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

דקר et al. פיתח את הקונפורמציה כרומוזום ללכוד (3C) הגישה לזהות את התדר של אינטראקציה בין שני לוקוסים הגנומי 1, 3C נעשה שימוש נרחב לחקור עמותות התוך כרומוזומליות וכן בין הכרומוזומים בין שני אזורים הידועים DNA בתאי יונקים 2 -9. למרות פיתח מתודולוגיה Hi-C יכול להיות מיושם על המחקר של הגנום כולו DNA העמותה, assay ACT עדיין טכניקה יעילה ללימוד האינטראקציה מוקד ספציפי DNA 10-11. אנחנו צריכים לשנות את הגישה הזאת כדי לזהות אזורים DNA ידוע המשויכים באזור DNA ידוע עכבר בתרבית תאים אנושיים (איור 1). קראנו בשיטה זו מלכודת כרומוזום קשור (ACT) assay, כפי שהוא סיפק לנו שיטה אמינה לשעתקו לזהות רומן שותפים DNA ידוע כי לקשר עם אזור הידוע היעד DNA 12. Assay 3C מוצלח עם פקדי המתאים מבוצעת לפני ביצוע ההיבטים הרומן של assay ACT 13. על מנת tofind כמה אזורים DNA הקשורים ככל האפשר, יש צורך להשתמש שילובים שונים של אנזימי הגבלה הראשון והשני. חשוב במיוחד להשתמש אנזימי הגבלה, כי הם רגישים מתילציה CPG לבצע את הצעד הראשון קשירת 3C. מחייב חלבון מתילציה בדנ&quot;א יכולים גם להשפיע על אנזים הגבלה יעילות העיכול עלולה להוביל לכישלון של קשירת האזורים DNA הקשורים עבור digestions אנזים מסוים הגבלה. הופעתם של קשירת פנים או בין כרומוזומליות תלוי-DNA חלבון cross-linking ומפות גופנית מתאימה של שני האזורים DNA הקשורים. לכן, כמה ניסויים ראשוניים חיוניים להקים ריכוז פורמאלדהיד מעשי יעיל בזמן הטיפול assay את המעשה. טווח של ריכוזי הסופי של פורמלדהיד (from1.5% עד 2%) היו בשימוש במעבדות רבות במהלך החלק 3C של assay 7,9. לחלופין, oligonucleotides לשמש linkers יכול להיות מתוכנן להתאים את סוף מלוכדת לחתוך על ידי אנזים ההגבלה השנייה. אמנם מצאנו כי 18-20 מחזורים בסיבוב הראשון של ה-PCR ו 20-25 מחזורים בסיבוב השני של ה-PCR יכולה לספק להקות ברור, יש צורך לקבוע את התנאים PCR הטוב ביותר עבור כל ניסוי (איור 2). תוך מולקולת חישול בין הרצף 5&#39;-end 3&#39;סוף מתאם משלימה של גדיל הדנ&quot;א עלולה להתרחש PCR, זה מעכב מתאם ספציפי פריימר חישול עם מולקולת ה-DNA, וכתוצאה מכך יעילות הגברה נמוכה בהרבה את מספר מחזורי הראשון. אחרי ה-DNA היעד היה מוגבר על מחזורים, סכום שלה עשוי להיות הרבה יותר גדול מאשר התגובות האלה ספציפי, ויכול להקל על התחרות של פריימר חישול את מולקולות ה-DNA היעד. זו גם הסיבה שאנו עשויים לראות הגברה רקע, ומדוע המוצר הראשון בסיבוב PCR צריך להיות מדולל כדי להקטין amplification.It רקע חשוב להסיר primers עודף מן התגובה PCR על מנת להקטין את הרקע בסיבוב השני של ה-PCR. כמו בכל PCR מבוססי ניסויים, חיוני לתכנון primers שלא נמצאים ברצף אזורים חוזרים, המהווים את רוב הדנ&quot;א האנושי ועכבר. למרות פיתח מתודולוגיה Hi-C יכול להיות מיושם על המחקר של הגנום כולו DNA העמותה, assay ACT עדיין טכניקה יעילה ללימוד האינטראקציה מוקד ספציפי DNA.

<table><tbody><tr><td>תווך RPMI1640</td><td>Invitrogen</td><td>22400-105</td><td></td></tr><tr><td>אקרילאמיד</td><td>Invitrogen</td><td>15512-023</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת ATP, ריכוז 10mM</td><td>Invitrogen</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומייצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9856</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Invitrogen</td><td>12091-039</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>Invitrogen</td><td>15505-035</td><td></td></tr><tr><td>&lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM)&gt;BamHI&lt;/em&gt; אני</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית&gt;BglI&lt;/em&gt; II</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144M</td><td></td></tr><tr><td>&lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM)&gt;DpnI&lt;/em&gt; II</td><td>New England Biolabs</td><td>R0543T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM)&gt;MspI&lt;/em&gt; אני</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106S</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינז K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8102S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>פורמלהיד 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>ביס-אקרילאמיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>דיתיותרייטול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93482</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פרוטינאז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>קבוצת Roche</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>KlenTaq1</td><td>פפטידי נוגדנים</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>dCTP alpha P32</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU513H250UC</td><td></td></tr><tr><td>מעגל תרמי PTC-100</td><td>MJ Research</td><td>mjptc100</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5056</td><td></td></tr><tr><td>OmniPAGE Maxi</td><td>Aurogene Life Science</td><td>VS20D</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-78</td><td></td></tr></tbody></table>

כרומוזום מלכודת הידיעות ap עבור זיהוי לטווח ארוך אינטראקציות dna

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

מידע גנטי המקודד על ידי ה-DNA מאורגן במבנה הכרומטין מורכב פיקוח הדוק. כל כרומוזום תופסת שטח ספציפי, זה עלול להשתנות בהתאם לשלב ההתפתחות או מחזור התא. התבטאות גנים יכולה להתרחש במפעלים תעתיק התמחה בו קטעים הכרומטין יכול לולאה החוצה מהשטחים כרומוזומים שונים, המוביל לוקליזציה שיתוף קטעי DNA אשר עשוי להתקיים על כרומוזומים שונים או רחוקים אחד מהשני על כרומוזום זהה. מלכודת Associated כרומוזום (ACT) assay מספק מתודולוגיה יעילה לזהות אלו לטווח ארוך עמותות DNA באופן בלתי משוחד על ידי הרחבת ושינוי קונפורמציה כרומוזום טכניקת לכידת. Assay ACT מאפשר לנו לחקור את מנגנוני הרגולציה תעתיק של טרנס, ויכול לעזור להסביר את היחס של האדריכלות גרעינית ביטוי גנים בפיזיולוגיה נורמלי במצבי מחלה.

המלכודת קשורה כרומוזום (ACT) assay היא שיטה חדשנית לזיהוי משוחדת ארוכי טווח אינטראקציות-DNA. אפיון האינטראקציות DNA ארוך טווח תאפשר לנו לקבוע את הקשר של האדריכלות גרעינית ביטוי גנים בפיזיולוגיה הן נורמליות במדינות חולה.

כרומוזום מלכודת הידיעות AP עבור זיהוי לטווח ארוך אינטראקציות DNA

מידע גנטי המקודד על ידי DNA מאורגן במבנה כרומטין מורכב ומוסדר ביותר. כל כרומוזום תופס טריטוריה ספציפית, ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לגלות ולזהות שותפי DNA המקושרים למרחק רחב. דבר זה מושג על ידי קיבוע, ליזיס של תאים ועיכול של ה-DNA באמצעות אנזים הגבלה ראשון, ולאחריו ליגציה ליצירת DNA כימרי המורכב ממקטעים משני הגנים המקושרים. לאחר מכן, לינקרים מתווספים ל-DNA הכימרי לאחר עיכול הגבלה שני. כדי להקל על הגבירתו, מבוצעת הגברה באמצעות PCR תוך שימוש בפריימרים ספציפיים ללינקר ול-DNA הפיתיון (bait DNA), במטרה להשיג כמויות מספיקות של מקטעי ה-DNA המקושרים. התוצאות המתקבלות מראים את שותפי ה-DNA המקושרים למרחב רחב עם ה-DNA הפיתיון, בהתבסס על ניתוח רצפים של מקטעי ה-DNA שהוגברו.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון לכידה לאישור כרומוזומים או 3C, הוא שניתן להשתמש ב-A-C-T-S-A כדי לזהות ביעילות שותף DNA לא ידוע בעל קשר לטווח רחוק. זאת בעוד ששיטת 3C פותחה לצורך אימות של אינטראקציות שחשדו בקיומן מראש בלבד. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, גדלו תאי אדם באינקובטור עם 5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 °C עד להגעה ל-80% עד 90% confluent.לתצוגה זו משתמשים בתאי לוקמיה חומצית של בני אדם (prom acidic leukemia cells). אסוף את התאים על ידי מזיגתם למבחנה מסוג NOC בנפח 50 מיליליטר וסבב במסנטריפוגה ב-1200 RPM למשך 15 דקות. לאחר הסבב, הסר את המצע באמצעות שאיבה.הוסיפו חמישה מיליליטרים של מצע תרבית כדי להשעות מחדש את משקעי התאים. לאחר ספירת התאים באמצעות המו-ציטומטר, העבירו כ-1x10⁷ תאים לנפח של 40 מיליליטר של מצע RPMI 1640 המכיל 10% FBS. לאחר מכן, הוסיפו 1.7 מיליליטר של 37% formaldehyde כדי לקבע את הכרומטין המדולל.דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות תוך써 ניעור עדין. לאחר הדגירה, עצרו את התגובה באמצעות 2.4 milliliters של glycine בריכוז two molar. לאחר מכן, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-1200 RPM ובטמפרטורה של four degrees celsius.לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant), שטפו את המשקע פעם אחת עם 40 milliliters של PBS קר מאוד, ולאחר מכן סובבו את הדגימה בצנטריפוגה כדי להוציא את משקע התאים השטוף. השעיקו את המשקע שנוצר ב-40 milliliters של בופר ליזיס קר מאוד עם מעכבי פרוטאז שנוספו טריים ו-0.1 millimolar PMSF. דגרו את הדגימה בחדר קר עם סיבוב למשך 90 דקות. לבסוף, סובבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 2,500 RPM למשך 15 דקות, הסירו את הנוזל העליון והוציאו את הגרעינים המבודדים. השעיקו את הגרעינים ב-0.5 milliliters של one X NEB buffer 3 והוסיפו 15 microliters של 10% SDS.דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת תוך써 ניעור. לאחר מכן, הוסיפו 45 µL של 20% Triton X 100 כדי לסכך את ה-SDS ודגרו שוב בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת תוך ניעור, ובצעו חלוקה למנות (aliquot) של 1x10⁶. נעשה שימוש בגרעינים, כ-15 µg, עבור עיכול באנזימי הגבלה לתוך 55 µL של תמיסת גרעינים.הוסף 433 µL של XNEB buffer 3 בריכוז 1X ו-12 µL של BGL 2. כדי להגיע לנפח סופי של תגובת עיכול של 500 µL, דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. למחרת, השבתו את אנזים ההגבלה על ידי הוספת 95 µL של 10% SDS ובצעו דנטורציה לאנזים על ידי חימום בטמפרטורה של 65 °C למשך 20 דקות.בתוך מקבץ מים, הוסף שבעה מיליליטרים של תמיסת ליוגציה (ligation buffer) בריכוז 1x ו-360 microliters של 20%Triton X 100. דגרי את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. הורד את הטמפרטורה ל-16 °C והוסף 50 microliters של 400 units per microliter.T four DNA Ligase. יש להדגיר את תגובת הליגציה בטמפרטורה של 16 °C למשך ארבע שעות ולאחר מכן בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. עם השלמת הליגציה, יש להוסיף 300 µg של proteinase K ולהדגיר בטמפרטורה של 65 °C למשך הלילה.לאחר מכן, הוסיפו 5 µg של RNAA והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. טהרו את ה-DNA באמצעות סחירה בפנול-כלורופורם והשקיעו את ה-DNA באיזופרופנול; המיסו את ה-DNA שהושקע ב-150 µL של מים מזוקקים סטריליים. כדי להוסיף לינקרים ל-DNA הכימרי, בצעו תחילה עיכול של ה-DNA על ידי הדגרה של 2 µg DNA מטוהר עם 5 יחידות של msp, one בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבע עד שש שעות. לאחר העיכול, נטרלו את פעילות ה-MSP one בטמפרטורה של 65 °C למשך 10 דקות.לאחר מכן, שקיעו את ה-DNA באתנול עם מיקרוליטר אחד של גליקוגן בריכוז five milligrams per milliliter. המיסו את משקע ה-DNA שהתקבל ב-50 microliters של מים מזוקקים סטריליים. לאחר מכן, ערבבו 50 microliters של DNA שעובד ב-MSP one עם שני מיקרוליטרים של אוליגונוקלאיד מקשר L בריכוז 20 micromolar ומיקרוליטר אחד של אוליגונוקלאיד S בריכוז 20 micromolar, ואז הוסיפו מיקרוליטר אחד של מים מזוקקים סטריליים ו-six microliters של T4 DNA Ligase buffer בריכוז 10X.כסו את התערובת בשעווה נוזלית. דנטורו את האוליגונוקלאוטידים ב-50 °C למשך דקה אחת והניחו להם להתרכב באופן הדרגתי עד ל-10 °C במדרג של 0.5 °C לדקה. באמצעות תרמוסייקלר, הוסיפו 1 µL של T4 DNA ligase בריכוז 400 units/µL והדגירו את התגובה ב-15 °C למשך הלילה.ביום למחרת, טהרו את ה-DNA המחובר למקשר (linker ligated DNA) באמצעות ערכה לטיהור מהיר של PCR (kaya quick PCR purification kit) והעבירו אותו ב-50 µL של מים מזוקקים סטריליים. לאחר מכן, בחרו פריימר עבור אזור ה-DNA הספציפי שייבדק לאינטראקציות לטווח ארוך. בדוגמה זו, Abel ישמש כפריימר או כפיתיון (bait).הכינו את ה-DNA המזוכה לסבב ה-PCR הראשון על ידי ערבוב של 1 µL מה-DNA המזוכה עם 1 µL של פריימר ספציפי ל-able one בריכוז 20 µM, 46 56, ו-1 µL של פריימר ספציפי ללינקר בריכוז 20 µM, 29 63. לאחר מכן, הוסיפו 3 µL של תערובת (cocktail) של 3x ClinTech, DNA polymerase one אשר עורבבה מראש עם 32 P-D-C-T-P בהתאם לפרוטוקול הכתוב, ולאחריה 3 µL של מים מזוקקים סטריליים. בצעו הגברה ב-PCR באמצעות מחזור תרמי של hot start PCR כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב לאחר השלמת מחזור ה-PCR.טהרו את תוצרי ה-PCR מהסבב הראשון באמצעות ערכה לניקוי PCR מהיר של Kaya. בצעו אלוציה ל-30 µL של מים מזוקקים סטריליים. השתמשו ב-1 µL של תוצר ה-PCR הראשון, מדולל פי 100, לביצוע סבב שני של PCR באמצעות פריימרים מקננים (nested primers), על ידי הוספה של 1 µL של פריימר ספציפי ל-able one בריכוז 20 µM, 46 26, ו-1 µL של פריימר ספציפי ללינקר בריכוז 20 µM, 29 61.שוב, הוסיפו 3 µL של ClinTech 3x, DNA polymerase, one cocktail ו-3 µL של מים מזוקקים סטריליים. בצעו את סבב ה-PCR השני באמצעות תוכנית מחזורי תרמיים של 25 מחזורים של 95 °C למשך 20 שניות, 67 °C למשך 40 שניות ו-72 °C למשך דקה אחת, ולאחריהם שלב הארכה ב-72 °C למשך חמש דקות.בצעו ויזואליזציה של תוצרי ה-PCR על ידי הרצת ג'ל urea 5% וסריקה של המסך החשוף במכשיר phospho imager. ניתן להוציא כל פס PCR מהג'ל על ידי המסה של רצועות הג'ל בתוך מבחנה מסוג einor המכילה 60 µL של מים מזוקקים סטריליים ודגירה בטמפרטורה של 95 °C למשך חמש דקות. צנטריפוגו את תוצרי הג'ל המומסים קצרות ב-10,000 RPM למשך 10 שניות.לאחר איסוף כל הדגימות, יש להוציא 1 µL לשימוש כתבנית DNA לביצוע PCR עם הפריימרים 29 61 46 26.באמצעות אותם תנאים שתוארו לעיל, לאחר טהירה ניתן לבצע ניתוח רצף באמצעות כלי מקוון כדי לקבוע את המיקום הכרומוזומלי. עם ההגעה לאתר הביואינפורמטיקה של הגנום, יש ללחוץ על blatt כדי לפתוח חלון חדש ולהדביק את רצף ה-DNA. לאחר הגשת רצף ה-DNA, יופיעו תוצאות החיפוש של BLATT.לחצו על ה-browser בתוצאה עם 100% identity כדי לחשוף את מיקום רצף ה-DNA. אזור ה-able one שימש כפיתיון כדי לקבוע את אינטראקציות ה-DNA ארוכות הטווח שלו. שני אתרי BGL II ואתר BAM HI אחד נבחרו לבדיקת A CT. בסיבוב השני של ה-PCR, נעשה שימוש בסט הפריימרים 46 26 29 61 כדי להגביר את able M1, ב-46.30 29 61 עבור able M two, וב-46, 36 29 61 עבור able M three.תבנית ג'ל טיפית חושפת פס אחד עד מספר פסים, כפי שמוצג כאן עבור able M1, able M two, ו-able M three. רצף ה-DNA של השבט able M1 מוצג כדי להדגים שכל פרגמנט מבדיקת A CT מורכב משני מקטעי DNA משולבים. מקטע אחד נגזר מאזור ה-bait DNA בעוד שהמקטע השני מגיע מהשותף (partner) הקשור.המקטעים מחוברים זה לזה באמצעות רצף הזיהוי של אנזים ההגבלה הראשון. רצף הזיהוי של האנזים השני יופיע בקצה רצף השותף המשויך. מקטע ה-M1 הניתן לשיבוט מכיל DNA מאזור ABLE one הממוקם בכרומוזום תשע Q 32.4, והשותף המשויך ממוקם בכרומוזום שלוש P שלוש, אשר זוהה כ-proc two.באופן דומה, השותף המזווג של able M two מומקם בכרומוזום five Q 21.1, בעוד ש-clone able M three זוהה כאסוציאציה תוך-כרומוסומלית סמוך לאטרוס ABLE one, בניגוד לבדיקות three C. המתודולוגיה המתוארת בסרטון זה תבחר את האינטראקציות ארוכות הטווח השכיחות ביותר. עם זאת, על ידי הגדלת מספר מחזורי ה-PCR R, ניתן לזהות גם אסוציאציות נוספות פחות שכיחות. באמצעות שימוש באזור ההטבעה והבקרה או ICR בלוכס IGF two H 19 כ-bait DNA בתאי פיברובלסט של עכבר, הוחלו תוכניות מחזוריות שונות בסבבים הראשון והשני של ה-PCR בבדיקת A CT.ניתן להשתמש בבדיקת A CT גם כדי לזהות הבדלים בארכיטקטורה הגרעינית ובאינטראקציות למרחקים ארוכים בין תאים נורמליים לתאי סרטן. רקמת מעי גס נורמלית ורקמת סרטן של מעי הגס עברו הומוגניזציה, ובדיקת A CT בוצעה על פי הפרוטוקולים המתוארים כאן. מוצג כאן מבנה ה-DNA של אזור ה-ICR בלוקוס H 19 של IGF two והגן dpn של IGF two.שני אתרים עבור בדיקת A CT; הפריימרים המסומנים המשמשים בסבב השני של ה-PCR מסומנים על ידי חצים ומספרים בצבעים שונים. תבנית הג'ל של בדיקת A CT מייצגת את תוצאות ה-PCR באמצעות פריימר 29 61 עם כל אחד מזוגות הפריימרים 41, 61, 41 63, 51 45, ו-51 51. פסים ייחודיים המופיעים רק ברקמת מעי גס תקינה מסומנים בחצים צהובים, ואותם פסים שהופיעו רק ברקמת סרטן של המעי הגס מסומנים בחצים אדומים לאחר הפיתוח.טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה המולקולרית לחקור את הארכיטקטורה הגרעינית ואת ויסות הגנים באופן תלת-ממדי.

associated-chromosome-trap-for-identifying-long-range-dna-interactions

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטת Hi-C מאפשר זיהוי משוחדת, גנום רחב של אינטראקציות הכרומטין (1). Hi-C זוגות קשירת סמיכות וסדר מקבילי מאסיבי. הנתונים וכתוצאה מכך ניתן ללמוד אדריכלות גנומית בקני מידה מרובות: התוצאות הראשוניות זיהו תכונות כגון בשטחים כרומוזום, הפרדה של הכרומטין פתוח, סגור, מבנה הכרומטין בקנה מידה megabase.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

ניתוח הכרומטין אינטראקציה ידי מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) היא...

הכרומטין ניתוח אינטראקציה עם מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) עבור מיפוי אינטראקציות הכרומטין הבנת תקנה תמלול

הרכבות גנום המבוססות על טכנולוגיות ריצוף DNA מקבילי מאסיבי הן בדרך כלל מקוטעות מאוד. פיתוח מפות כרומוזומים פיזיות עשוי לשפר את הרכבות הגנום. כאן, אנו מציגים גישות חדשניות להכנת כרומוזומים, היברידיזציה פלואורסצנטית in situ ודימוי, המגבירות משמעותית את התפוקה של פיתוח המפה הפיזית.

תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

בידוד ואפיון תאי גידול במחזור הדם של חולי סרטן הוא סוג של ביופסיה נוזלית לא פולשנית וקשורה להישנות המחלה ולהתקדמות המחלה. סרטון זה מתאר את הטכניקה של הכלאה פלואורסצנטית באתרו של DNA (DNA FISH) על CTCs שנלכדו על חוט רפואי, כדי לחקור גן ספציפי מעניין.

דג DNA תלת-ממדי: טכניקה לאיתור גן מסוים על כרומוזום

כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי בו זמני של שינויי היסטון ידי רצפי DNA וimmunofluorescence ידי דגי DNA אחרי מיקרוסקופיה וניתוחים (דגי 3D החיסוני DNA) 3D.

Immunofluorescence שילוב ודגי DNA על 3D-השתמרו גרעיני Interphase לחקר שינויים בארגון גרעיני 3D

זיהוי המטרות הישירות של מולקולות מיקוד הגנום עדיין מהווה אתגר גדול. כדי להבין כיצד מולקולות ה- DNA מחייבת לעסוק הגנום, פיתחנו שיטה המסתמכת על crosslinking של מולקולות קטנות לבודד את הכרומטין (קוסמי).

מיפוי הגנום של תרופות-DNA בתאי אינטראקציות עם COSMIC (Crosslinking של מולקולות קטנות לבודד הכרומטין)

כרומטין לולאה משחק תפקיד משמעותי הכונה; עם זאת, היו לא הפיתוחים הטכנולוגיים המאפשרים שינוי סלקטיבית ולא הפיכים של לולאות כרומטין. כאן נתאר מערכת חזקה לארגון מחדש של לולאה כרומטין באמצעות CRISPR-dCas9 (CLOuD9), הדגימו באופן סלקטיבי ובלתי הפיכה לווסת ביטוי גנים-ממוקד לוקוסים.

CRISPR בתיווך ארגון מחדש של הכרומטין לולאה

אנו מדווחים על היישום של לכידת כרומוזום קונפורמציה כמותי ואחריו רצף תפוקה גבוהה בגופים embryoid שנוצרו בתאי גזע עובריים. טכניקה זו מאפשרת לזהות ולכמת את אנשי הקשר בין משפרי ואזורים היזם של גן נתון במהלך הבידול תא גזע עובריים.

זיהוי אנשי קשר של משפר-יזם ב Embryoid גופים על-ידי לכידת כרומוזום קונפורמציה כמותית (4C)

Hi-C 3.0 הוא פרוטוקול Hi-C משופר המשלב פורמלדהיד ודיסוקינימידיל גלוטראט קרוסלינקרים עם קוקטייל של אנזימי הגבלה DpnII ו- DdeI כדי להגדיל את יחס האות לרעש ואת הרזולוציה של זיהוי אינטראקציית כרומטין.

לכידת קונפורמציה של כרומוזומים על פני סולמות אורך

פרוטוקול זה מתאר את שיטת Capture Hi-C המשמשת לאפיון הארגון התלת-ממדי של אזורים גנומיים ממוקדים בגודל מגה-מבוסס ברזולוציה גבוהה, כולל גבולות של תחומים משויכים טופולוגית (TADs) ואינטראקציות כרומטין ארוכות טווח בין אלמנטים רגולטוריים ורצפי DNA אחרים.

פענוח ארגון כרומטין תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה באמצעות לכידת Hi-C

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללכידת אינטראקציות בין DNA-DNA כרומטין ל-RNA למיפוי ארגון הגנום התלת-ממדי הקשור ל-RNA.

שיטת האינטראקציה של כרומטין DNA-DNA המקושר ל-RNA

למדו את שיטת ACT לזיהוי אינטראקציות DNA לטווח ארוך בתאי לוקמיה מיאלואידית אנושית. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לגלות שותפים גנומיים לא ידועים ולהבין את ארכיטקטורת הגרעין ורגולציית גנים.

כרומוזום מלכודת הידיעות AP עבור זיהוי לטווח ארוך אינטראקציות DNA

גלה סרטונים נוספים