הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

פרוטוקול זה מדגים כיצד לדמות אירועים דינמיים בעוברים מוקדמים של CL egan עם אופטיקה או פלואורסצנטיות של Norky DIC על ידי שימוש במיקרוסקופים זמינים ותוכנת קוד פתוח. הפרוטוקול מתחיל בתיאור כיצד לנתח עוברי CL gans ולהרכיב אותם להדמיה. לאחר מכן נבדקת הגדרה נכונה של ה-DIC או אופטיקה מסיכה כדי להבטיח תמונות אופטימליות בפירוט הגבוה ביותר.

כיול של אפי פלואורסצנטי ותאורה בשדה רחב נבדק גם לאיסוף נתוני תמונה פלואורסצנטיים טובים בשילוב עם תוכנת קוד פתוח. מיקרוסקופיה טובה יכולה לדמיין דינמיקה תאית בעובר מתפתח. איורים חזותיים של שיטה זו הם קריטיים מכיוון שהגדרת אופטיקה D iic כראוי היא קשה מכיוון שהטרמינולוגיה יכולה להיות מבלבלת וקשה לתאר את הטכניקה הנכונה בצורה כתובה.

בנוסף, על החוקרים להקפיד למזער את החשיפה לאור בעת ביצוע הדמיה פלואורסצנטית. על מנת להגביל פוטוטוקסיות והלבנת פוטו כדי להכין עוברים להדמיה, ראשית, הכינו שני פתרונות הרכבה. האחד הוא וזלין מומס והשני הוא 2 עד 3% בבופר.

ניתן ליצור ארוסים צפופים יותר אם המבנים שיש לצלם שבירים מאוד, תוך הקפדה על רתיחה. שתי תמיסות המלאי נמסות במיקרוגל ולאחר מכן מאוחסנות כארבעה עד חמישה מיליליטר. ביום ההדמיה, ממיסים תמיסת וזלין בבלוק חום של 65 עד 70 מעלות צלזיוס וממיסים אליקוט אחד של תמיסה שנוצרה במיקרוגל.

שוב, הימנעות מהרתחה. ואז כדי לשמור על פתרונות אלה מותכים, אחסן אותם בגוש חום. לאחר מכן, כסו את החלק העליון והתחתון של שתי שקופיות ברצועת סרט מעבדה ומקמו שקופית נקייה בין שתי השקופיות המודבקות.

כעת שפכו כמה טיפות מהארוס המותך על המגלשה הנקייה וכסו אותה בשקופית נקייה נוספת. הארוס מתפשט לכרית מרובעת דקה עם כרית התולעת מוכנה. השתמש בטווח ניתוח ובקיסם חוט פלטינה כדי להעביר שתי תולעים בוגרות לטיפה של 9 עד 12 מיקרוליטר של חיץ על תלוש כיסוי בגודל 18 על 18 מילימטר.

ואז חותכים. פתחו את התולעים בעזרת מחט או אזמל כדי לשחרר את העוברים כשצד האגרו כלפי מטה. מקם את כרית התולעת על החלקת הכיסוי בגודל 18 על 18 מילימטר וסכין גילוח כל אגר תלוי.

לבסוף, כדי לאטום את החלקת הכיסוי, יש למרוח את תמיסת הווזלין המותכת לאורך היקפו בעזרת מברשת צבע או קיסם. התאים מוכנים כעת להדמיה. בעת הנחת השקופית על המיקרוסקופ, ודא ששני המקטבים מיושרים בניצב זה לזה.

ודא שגם הקירות וגם המנסרות נמצאים מחוץ לנתיב האור. אם השדה אינו חשוך, סובב את המקטב מתחת למעבה עד שהוא כעת. מצא את העוברים באמצעות המטרה פי 10.

חפש ליד גופי התולעים קבוצות של עוברים צעירים על מנת לקבל עוברים מרובים בתוך שדה ההדמיה. הימנע מעוברים בתוך התולעת לקבלת התמונות הטובות ביותר. כאשר העוברים הטובים ביותר ממוקמים, עבור ליעד בעל עוצמה גבוהה יותר.

כעת העבר את קוביית המסנן ל-DIC. לאחר מכן, הכנס את מנסרת הוולסטון העליונה לנתיב האור וסובב את הטארט על המעבה כדי לבחור את מנסרת הוולסטון התחתונה התואמת את המטרה. עם מנסרות במקומן, כוונן את המחוון מתחת לצריח זה כך שיתאים לצמצם המספרי של העדשה.

כדי לקבל את תאורת Kohler האופטימלית, מקד את המעבה עד שקצה דיאפרגמת המעבה יופיע בצורה החדה ביותר. החדה ביותר היא כאשר הגבול בין שחור בהיר הוא החד ביותר או ממוקד. כדי לקבל ניגודיות אופטימלית, כוונן את קיר התפוח ואת המנסרה על ידי סיבוב הכפתור במחוון.

כעת המיקרוסקופ כמעט מוכן לשימוש. הגיע הזמן לשלוט בפרמטרי הדמיה נוספים במחשב באמצעות מיקרו-מנהל ותוכנת קוד פתוח. התחל בהגדרת רווח המצלמה לאפס.

לאחר מכן עבור לשמירת קבצים כ-tiffs של שמונה סיביות, ולא כ-tiffs של 16 סיביות. מאוחר יותר ניתן לנתח קבצי TIFF על ידי תוכנת קוד פתוח כמו Image J.Next, להתאים את רמת האור למקום שבו הפיקסלים הבהירים ביותר נמצאים ממש מתחת לרמות הרוויה. אם הכל נעשה כהלכה, התמונה תיראה תלת מימדית עם אור שנראה כאילו הוא זורח בזווית.

כעת, כשהתמונה נראית מבריקה, בחר את העוברים שברצונך לדמיין וצייר אזור מעניין. אם למיקרוסקופ יש מנוע מיקוד, השתמש בו כדי לאסוף מישורי מוקד מרובים בכל פעם. נקודה, פתח את חלון הרכישה הרב-ממדית והגדר את המישור העליון והתחתון של מחסנית Z על ידי כוונון כפתור המיקוד כדי למצוא את מישור המוקד הראשון והאחרון עם כמה גרגירי עול בפוקוס.

הגדר את גודל המדרגה. זה יגדיר את מספר מישורי המוקד שנאספו. כעת, הגדר מרווח זמן ארוך מספיק כדי לרכוש את כל מישורי המוקד.

ניתן להגדיר את נקודות הזמן המקסימליות גבוהות מאוד כך שהתוכנה תצלם תמונות עד לעצירה ידנית. הגדר את התוכנה כך שתציג רק את התמונה האחרונה שנרכשה כך שניתן יהיה לעקוב אחר התהליך. כעת תן לתמונות שם קובץ והתחל לרכוש תמונות.

ניתוח התמונות ייסקר בקצרה בסוף החלק הבא. בניית סרט GFP דומה מאוד ליצירת ארבעה D או Musky DIC, אך נעשה שימוש בקובץ תצורה הכולל בקרת תוכנה של ניפוץ פלואורסצנטי. במקום זאת, כאשר העוברים ממוקמים, ודא שמנסרת האבן העליונה אינה בנתיב האור והחלף את קוביית המסנן ל-F-I-T-C-G-F-P.

אם זה לא הוגדר אוטומטית בעת ההפעלה באמצעות התוכנה, ודא שרווח המצלמה מוגדר ל-255. קובץ תמונה מוגדר לתבנית tiff של 16 סיביות. כעת כבה את מקור האור המשודר ולחץ על הדמיה חיה.

התאם את עוצמת מקור האור ה-UV וזמן החשיפה כדי להשיג יחס אות לרעש טוב עבור אות הקרינה, עם זאת, שמור על חשיפת האור למינימום כדי לשמר את התאים. לאחר מכן, הגדר את מרווח הזמן. מספר נקודות הזמן ומספר מישורי המוקד ממשיכים כעת ברכישת תמונה כפי שתואר קודם לכן.

כדי לנתח את הסרטים, השתמש בתוכנת קוד פתוח. תמונה J עם תוסף המיקרו-מנהל מותקן ניתן לייבא גם סרטים גדולים מאוד לתמונה J באמצעות תוסף הלוקי. זהו עובר מסוג פרא שנלכד עם אופטיקה DIC או מסכה.

החלק האחורי נמצא בפינה הימנית התחתונה והגחון נמצא בפינה השמאלית התחתונה. הסרט מציג רצף של תמונות מישור מוקד בודד שנאספו כל 15 שניות. ההשמעה מוגדרת ל -14 פריימים לשנייה.

עובר זה מבטא פלואורסצנטיות במהלך החלוקה העוברית הראשונה כאן האחורי נמצא מימין למעלה. סרטון זה מציג את השינויים במישור מוקד יחיד כל 10 שניות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לדמות עוברים חיים באמצעות אופטיקה של DIC Naski ו-epi fluorescence כדי לחקור אירועים דינמיים.

אנו מקווים שיש לך הבנה טובה יותר כיצד להגדיר אופטיקה של DIC Nomar כדי לקבל תמונות אופטימליות ולהבין שאתה יכול לקבל נתונים פלואורסצנטיים באיכות גבוהה באמצעות תאורת אפי פלואורסצנטית, ולא תמיד תלויים במיקרוסקופים מתקדמים יותר. אתה יכול גם ליישם טכניקות הדמיה אלה כדי לבחון עוברים חסרי תפקוד גנים ספציפי כדי לחקור עוד יותר את הדרישות הגנטיות לאירועים המועדפים עליך במהלך חלוקת התא או התפתחותו.