הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח
24 במרץ 2011
ג elegans היא מערכת רבת עוצמה ללימוד ביולוגיה של התא ופיתוח. אנו מציגים פרוטוקול הדמיה חיה של ג elegans עוברים ניצול אופטיקה DIC או באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי epifluorescent זמינים מקור פתוח תוכנה.
פרוטוקול זה מדגים כיצד לצלם אירועים דינמיים בעוברים מוקדמים של CL egan באמצעות אופטיקת Norky DIC או פלואורסצנציה, תוך שימוש במיקרוסקופים נפוצים ובתוכנות קוד פתוח. הפרוטוקול פותח בתיאור אופן הדיסקציה של עוברי CL gans והצבתם לצילום. לאחר מכן, נסקור את ההגדרה הנכונה של אופטיקת ה-DIC nor masky כדי להבטיח תמונות אופטימליות ברמת פירוט מרבית.
בנוסף, נסקר כיול של מערכת תאורה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי-מיקרוסקופי בשדה רחב לצורך איסוף נתוני תמונה פלואורסצנטיים איכותיים בשילוב עם תוכנה בקוד פתוח. מיקרוסקופיה איכותית יכולה להמחיש דינמיקה תאית בעובר בהתפתחות. הדגמות חזותיות של שיטה זו הן קריטיות, שכן הגדרה נכונה של ה-D iic Optics היא משימה קשה בשל טרמינולוגיה שעלולה להטעות וטכניקה שקשה לתאר בצורה כתובה.
בנוסף, על החוקרים להקפיד לצמצם את החשיפה לאור בעת ביצוע דימות פלואורסצנטי. כדי להגביל פוטוטוקסיות ופוטובליצ'ינג (דה-פלואורסצנציה), לצורך הכנת עוברים לדימות, הכינו תחילה שני תמיסות קיבוע. הראשונה היא וזלין מומס והשנייה היא 2% עד 3% agarose בבופר.
ניתן להכין AROs בצפיפות גבוהה יותר אם המבנים המיועדים לדימות שבריים מאוד, תוך הקפדה למנוע רתיחה. שני תמיסות המקור מומסות במיקרוגל ואז מאוחסנות כאליקוטים של ארבעה עד חמישה מיליליטר. ביום הדימוי, המסו אליקוט של תמיסת וזלין בבלוק חימום של 65 עד 70 degrees Celsius והמיסו אליקוט אחד של תמיסת ARO במיקרוגל.
שוב, יש להימנע מרתיחה. לאחר מכן, כדי לשמור על תמיסות אלו במצב נוזלי, אחסנו אותן בבלוק חימום. בשלב הבא, כסו את החלק העליון והתחתון של שתי זכוכיות כיסוי ברצועת סרט הדבקה למעבדה והניחו זכוכית כיסוי נקייה בין שתי הזכוכיות המודבקות.
כעת טפטפו מספר טיפות של ה-aros הנוזלי על השקף הנקי וכסו אותו בשקף נקי נוסף. ה-Aros נפרס למספח ריבועי דק, וכך מוכן מספח התולעים. השתמשו במיקרוסקופ דיסקציה ובפינצטה מחוט פלטינה כדי להעביר שתי תולעים בוגרות לטיפה של 9 עד 12 µL של בופר על כיסוי זכוכית בגודל 18 על 18 מילימטר.
לאחר מכן גזרו. פתחו את התולעים באמצעות מחט או סכין מנתחים כדי לשחרר את העוברים כאשר צדו של האגר פונה כלפי מטה. מקמו את משטח התולעים על לבישת זכוכית (cover slip) בגודל 18 על 18 מילימטרים, וגזרו בעזרת תער כל שארית אגר בולטת.
לבסוף, כדי לאטום את זכוכית הכיסוי, מרחו את תמיסת הוזלין המומסת לאורך היקפה בעזרת מברשת צבע או קיסם. התאים מוכנים כעת לדימות. בעת הנחת הזריקה על המיקרוסקופ, ודאו ששני המקדבים (polarizers) מיושרים בניצב זה לזה.
וודאו ששני הסססנים והפריזמות נמצאים מחוץ למסלול האור. אם השדה אינו חשוך, סובבו את המקטב שמתחת למעבה עד שיהיה חשוך. אתרו את העוברים באמצעות עדשה עם הגדלה של 10 פעמים.
חפשו סביב גופי התולעים קבוצות של עוברים צעירים כדי להשיג מספר עוברים בתוך שדה הדמיя. הימנעו מעוברים שנמצאים בתוך התולעת כדי להגיע לתמונות מיטביות. לאחר איתור העוברים המתאימים ביותר, עברו לעדשה עם הגברה גבוהה יותר.
כעת העבירו את קוביית המסנן ל-DIC. לאחר מכן, הכניסו את פריזמת וולסטון (Walstone) העליונה של העדשה אל נתיב האור, וסובבו את המגדל בקונדנסור כדי לבחור את פריזמת וולסטון התחתונה התואמת לעדשה. כאשר הפריזמות במקומן, כווננו את המחוון שמתחת למגדל זה כך שיתאים למספר המפתח (numerical aperture) של העדשה.
כדי להשיג תאור קולר (Kohler) אופטימלי, כוון את המיקוד של הקונדנסור עד שקצה דיאפרגמת הקונדנסור ייראה חד בצורה המקסימלית. החדות המרבית היא כאשר הגבול בין האור לחושך הוא הברור ביותר או נמצא במיקוד המדויק. כדי להשיג ניגודיות אופטימלית, כוון את דופן התפוח ואת הפריזמה על ידי סיבוב הכפתור שעל המחולק.
כעת המיקרוסקופ כמעט מוכן לשימוש. זהו הזמן לשלוט בפרמטרי הדמיה נוספים במחשב באמצעות תוכנת micromanager ותוכנות קוד פתוח. התחילו בהגדרת הגב (gain) של המצלמה לאפס.
לאחר מכן, שנו את הגדרות השמירת קבצים ל-TIFF של שמונה ביט, ולא 16 ביט. ניתן לנתח קבצי TIFF מאוחר יותר באמצעות תוכנות קוד פתוח כגון Image J. בשלב הבא, כווננו את רמת התאורה כך שהפיקסלים הבהירים ביותר יהיו ממש מתחת לרמות הרוויה. אם התהליך בוצע נכון, התמונה תיראה תלת-ממדית, כאשר האור נראה כמגיע בזווית.
כעת, לאחר שהתמונה נראית ברורה, בחרו את העוברים שברצונכם לצלם וסמנו אזור עניין (ROI). אם למיקרוסקופ יש מנוע פוקוס, השתמשו בו כדי לאסוף מספר מישורי מוקד בכל נקודת זמן. פתחו את חלון הרכישה הרב-ממדית והגדירו את המישור העליון והתחתון של ה-Z stack על ידי סיבוב כפתור הפוקוס כדי למצוא את מישורי המוקד הראשונים והאחרונים שבהם חלק מגרנולות החלמון נמצאים בפוקוס.
הגדירו את גודל הצעד. פעולה זו תקבע את מספר מישורי המוקד שייאספו. כעת, הגדירו מרווח זמן ארוך מספיק כדי לרכוש את כל מישורי המוקד.
ניתן להגדיר את נקודות הזמן המקסימליות כגבוהות מאוד, כך שהתוכנה תבצע צילומים עד לעצירה ידנית. הגדירו את התוכנה להציג רק את התמונה האחרונה שנרכשה כדי שניתן יהיה לנטר את התהליך. כעת תנו שם לקובץ התמונות והתחילו ברכישת התמונות.
ניתוח תמונות ייסקר בקצרה בסוף הסעיף הבא. בניית סרט GFP דומה מאוד להפקת תמונות DIC ב-4D או Musky, אך נעשה שימוש בקובץ הגדרות הכולל בקרה תוכנתיות של ה-fluorescent shatter. לאחר איתור העובריים, ודאו שה-upper walstone prism אינו נמצא בנתיב האור והעבירו את קוביית המסנן ל-F-I-T-C-G-F-P.
אם הגדרה זו לא בוצעה באופן אוטומטי בעת הפעלת התוכנה, ודאו שהגב היתוך (gain) של המצלמה מוגדר ל-255. קובץ התמונה מוגדר בפורמט tiff של 16 bit. כעת כבו את מקור האור המועבר ולחצו על הדמיה חיה (live imaging).
כווננו את עוצמת מקור אור ה-UV ואת זמן החשיפה כדי להשיג יחס אות לרעש טוב עבור אות הפלואורסצנציה, אך שמרו על חשיפה מינימלית לאור כדי לשמר את התאים. לאחר מכן, הגדירו את מרווחי הזמן. קבעו את מספר נקודות הזמן ואת מספר מישורי המוקד, וכעת המשיכו ברכישת התמונות כפי שתואר קודם לכן.
לניתוח הסרטים, השתמשו בתוכנה בקוד פתוח. Image J עם תוסף micromanager מותקן. ניתן לייבא סרטים גדולים מאוד ל-Image J באמצעות תוסף loci. זהו עובר מסוג wild type שצולם עם nor masky, באופטיקת DIC.
החלק האחורי (Posterior) נמצא למטה מימין, והחלק הבטני (Ventral) נמצא למטה משמאל. הסרטון מציג רצף של תמונות במישור מוקד יחיד שנאספו מדי 15 שניות. קצב ההשמעה מוגדר ל-14 פריימים לשנייה.
עובר זה מביע פלואורסצנציה במהלך החלוקה העוברית הראשונה; כאן, הצד האחורי (posterior) נמצא בפינה הימנית העליונה. סרטון זה מציג את השינויים במישור מוקד בודד בכל 10 שניות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן הדמיית עוברים חיים באמצעות אופטיקת DIC Naski ופלואורסצנציית epi לחקר אירועים דינמיים.
אנו מקווים שעתה יש לכם הבנה טובה יותר לגבי האופן שבו יש להגדיר את האופטיקה של DIC Nomar כדי לקבל תמונות אופטימליות, וכי הבנתם שניתן להשיג נתונים פלואורסצנטיים באיכות גבוהה באמצעות הארה של epi fluorescence, ושאינכם תמיד תלויים במיקרוסקופים מתקדמים יותר. תוכלו ליישם טכניקות דימוי אלו גם כדי לבחון עוברים החסרים תפקוד של גן ספציפי, במטרה לחקור לעומק את הדרישות הגנטיות לאירועים המועדפים עליכם במהלך חלוקת התאים או ההתפתחות.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים דימות חי של עוברי C. elegans באמצעות אופטיקת DIC או פלואורסצנציה. הוא מספק שלבים מפורטים להכנת עוברי והתאמה אופטימלית של טכניקות הדימות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- עוברי C. elegans מהווים מערכת מודל לחקר דינמיקה תאית.
- טכניקות של דימיון חי (Live imaging) חיוניות לצפייה בתהליכי התפתחות.
- הגדרה נכונה של ציוד הדימיון היא קריטית לקבלת תוצאות באיכות גבוהה.
- צמצום החשיפה לאור חשוב למניעת פוטו- độcסיות (phototoxicity).
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול מקיף לדימוג של עוברים של *C. elegans*.
- העמקת ההבנה של הדינמיקה התאית במהלך השלבים המוקדמים של ההתפתחות.
- שימוש בכלי מיקרוסקופיה נגישים ובתוכנות בקוד פתוח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הדסקציה והרכבה של עוברי C. elegans.
- כיול של אופטיקת DIC והגדרות פלואורסצנציה.
- שימוש בתוכנה בקוד פתוח לרכישת תמונות וניתוחן.
- אופטימיזציה של פרמטרי הדמיה להשגת תמונות באיכות גבוהה.
תוצאות עיקריות
- הצלחה במיפוי תמונה של אירועים דינמיים בעוברים של C. elegans.
- הוכחת חשיבותו של הגדרה אופטית נכונה להשגת בהירות.
- מתן הנחיות לצמצום החשיפה לאור במהלך המיפוי.
- סייע באיסוף נתוני תמונה רב-ממדיים.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר דימוי יעיל של עוברי C. elegans.
- טכניקה והגדרה נכונות הן קריטיות להצלחת הדימוי.
- תוכנה בקוד פתוח משפרת את הנגישות עבור חוקרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי חי של עוברים של C. elegans מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של תהליכים תאיים כגון הרכבת כרומוזומים וציטוקינזה, ובכך מספק ביטחון ניבוי בתיקוף מטרות עבור תוכניות גילוי מוקדמות. הפרוטוקול עושה שימוש במיקרוסקופיה נגישה ובתוכנה בקוד פתוח כדי לתמוך בסריקה פנוטיפית ניתנת לשחזור ובקנה מידה רחב במערכת רלוונטית למחלה עם שושלת ידועה ויכולת מניפולציה גנטית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה ישירה של אירועים תאיים דינמיים in vivo.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת תפקוד גנים במסלולים התפתחותיים באמצעות רפורטרים פלואורסצנטיים או ניגודיות DIC.
- ערך חיזוי: מסייע בזיהוי מובילים (leads) על ידי קישור הפרעות גנטיות לתוצאות פנוטיפיות במודל עוברי בעל נאמנות גבוהה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מכינה מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף להערכת תרכובות בשלבים הבאים, באמצעות תהליכי עבודה סטנדרטיים של קיבוע עוברים והדמיה.
- תוצרים כמותיים: מאפשרת רכישת Z-stacks בשיטת time-lapse ונתונים רב-ממדיים למדידה הדירה של דינמיקה תאית.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: מנצלת מיקרוסקופים אפי-פלואורסצנטיים זמינים ותוכנות קוד פתוח כדי להפחית את התלות בתשתיות הדמיה ייעודיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מקשר בין מנגנונים תאיים בסיסיים לפנוטיפים התפתחותיים עם פוטנציאל להתאמה של סמנים ביולוגיים (biomarkers) תרגומיים.
- המשכיות פרה-קלינית: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אספקת נתונים דינמיים ברזולוציית שושלות תאים ממחקרי הפרעה גנטית.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מפחיתה עמימות בתיקוף מטרות על ידי תצפית בזמן אמת על השלכות של השתקה גנטית (knockdown) או מוטציה על האמבריוגנזה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי כך שהיא מאפשרת בדיקת השערות, הבהרת מסלולים וסריקה פנוטיפית לפני שלבי אופטימיזציית המולקולות המובילות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובצמצום סיכונים ביולוגיים באמצעות דימיון חי של חלוקות תאי עוברי ומעברים התפתחותיים.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה ושחזור של בדיקות באמצעות קיבוע מבוקר של העובריים, כיול תאורה ורכישת נתונים בקוד פתוח.
- אנליטיקה: מייצרת קריאות כמותיות כגון עוצמת פלואורסצנציה, מורפולוגיה גרעינית ותזמון של ציטוקינזה לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם תיקוף פרה-קליני על ידי קישור פנוטיפים עובריים להפרעות גנטיות הרלוונטיות למודלים של מחלות אנושיות.
- שימוש חוזר בארגון: מבססת יכולת דימיון ניתנת לשימוש חוזר במגוון פרויקטים החוקרים מנגנונים תאיים שמורים במודלים ניתנים למניפולציה גנטית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בבקרת תהליכים תאיים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים ותאימות לתוכנות קוד פתוח.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) על ידי אספקת נתונים פנוטיפיים מוקדמים in vivo המפחיתים סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על חומרת הפנוטיפ והביטוי שלו בהתפתחות עוברית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-C. elegans, בדיסקציה של עובריו ובטכניקות קיבוע.
- תלוי במיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי תקין עם אופטיקת DIC, קוביית מסננים ומנוע פוקוס עבור Z-stacking.
- מחייב סטנדרטיזציה של רמות התאורה, זמני חשיפה והכנת תמיסת הקיבוע בין המשתמשים השונים.
- כולל שיקולי התאמה עבור רקעים גנטיים שונים או זני מוטציה המשפיעים על חיוניות העוברים או המורפולוגיה שלהם.
- כולל מגבלות מעשיות כגון סיכון לפוטוטוקסיות במהלך דימוי פלואורסצנטי וסחיפת עוברים במהלך רכישות ארוכות.
