בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

נתאר שיטה אשר מודד את קינטיקה של תחבורה יון של חלבונים בממברנה לצד ניתוח אתר ספציפי של שינויים קונפורמציה באמצעות הקרינה על תאים בודדים. טכניקה זו ניתנת להתאמה תעלות יונים, מובילי משאבות יונים יכול להיות מנוצל כדי לקבוע מגבלות המרחק בין יחידות משנה חלבון.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את דינמיקת האישור של חלבוני ממברנה המשתמשים בתיוג פלואורסצנטי מכוון אתר על פני תאים בודדים. זה מושג על ידי מוטציה אינדיבידואלית ראשונה של שאריות בממשק של התחומים החוץ-תאיים והטרנסממברניים לציסטין כפי שמוצג על ידי C.It האדום יש צורך לקבוע אם ניתן לתייג שאריות אלה עם ציסטין המגיב פלואורו ארבע. השלב השני של ההליך הוא לבחון האם ציסטין, מוטגנזה או תיוג פלואורו ארבע משפיעים על הקינטיקה ו/או מצב האישור של החלבון.

פעולה זו מתבצעת באמצעות ההגדרה המוצגת. השלב השלישי של ההליך הוא השוואה וניגוד של שינויים בעוצמת הקרינה לפרמטרים הקינטיים של חלבון המטרה. עקבות פלואורסצנטיים טיפוסיים מוצגים כאן.

השלב האחרון של ההליך הוא לתייג זוגות ציסטאין מוטנטיים עם רביעיות פלואור של תורם או ארבע פלואור של מקבל תורם כדי למדוד את שיעורי הרס הצילום במקביל למדידות מהדק מתח כדי לקבוע אילוצי מרחק. איור זה מציג את שיעורי השמדת תמונות התורם בהיעדר מקבל בשחור השמדת תמונות תורם בנוכחות המקבל באדום. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות כי שינויים בעוצמת הקרינה, שהם תוצאה של שינויים באישור חלבון, יכולים להיות קשורים לתפקוד חלבון הממברנה באמצעות פלואורומטריית מהדק מתח.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הובלת יונים ממברנה, כגון כיצד השינויים במצב האישור של החלבון מקלים על הובלת מולקולות ויונים קטנות על פני קרום הפלזמה. התחל את ההליך על ידי שיבוט משאבת הנתרן אשלגן לווקטור המתאים לעמודי xop, ביטוי ביציות Lavis. השלב הבא הוא יצירת מוטציות ציסטאין בשאריות הממוקמות בממשק בין התחום הטרנסממברני לתחום החוץ-תאי כמתואר במאמר הנלווה.

בסיום, ודא את החדרת המוטציה על ידי ריצוף DNA לאחר שעתוק ה-DNA של הפלזמה ל-mRNA כמתואר במאמר המצורף, כמת את תפוקת ה-mRNA באמצעות ספקטרופוטומטר לפני הניתוח. יש לצום את הצפרדע במשך 12 שעות כדי למנוע הקאות במהלך הניתוח. כדי להתחיל את הניתוח למחרת, טבלו את הצפרדע בתמיסת ההרדמה עד שהצפרדע לא מגיבה לצביטה בבוהן.

הוציאו את הצפרדע מתמיסת ההרדמה והניחו אותה עם הצד הגבי כלפי מטה על הצד הסופג של כרית החתלה. הניחו מגבת נייר רטובה על הצפרדע כדי לשמור על לחות הצפרדע. כמו כן, אם עיני הצפרדע פקוחות, שמרו עליהן לחות עם תמיסת מלח.

בצע חתך סמיך קטן בצד אחד של קו האמצע של הצפרדע. אתר את השחלה והביא אותה לחלק החיצוני של הצפרדע. הימנע מלגעת בשחלה בעור.

הסר את השחלה והניח אותה בצלחת פטרי המכילה תמיסת צלצול. בדוק את הרקמה הנותרת לאיתור דימום לפני שתחזיר אותה לחלל הסמיך. אם מתרחש דימום, הפעל לחץ עם קצה Q סטרילי עד שהוא נעצר.

סיים את הניתוח על ידי תפירת החתך באמצעות דפוס תפר קטוע. החזר את הצפרדע לביתה כדי להתאושש מההרדמה באמצעות מספריים. חלקו את אונת השחלה המבודדת לחלקים קטנים יותר.

מעבירים את הגושים לתמיסת רינגר בתוספת סידן עם קולגנאז. לאחר מכן, יש לנער בעדינות את תמיסת העיכול למשך שעתיים בחום של 18 מעלות צלזיוס. כאשר רוב הציטים מופרדים, שטפו את הביציות בתמיסת רינגר מינוס סידן.

לאחר מכן דגרו על הביציות למשך 10 דקות בתמיסת רינגר מינוס סידן בטמפרטורת החדר. בשלב זה, שטפו את הציטים באופן ממצה בצלצולים בתוספת תמיסת סידן. לאחר מכן העבירו את הביציות לתמיסת רינגר בתוספת סידן לאחסון לפני ההזרקה.

לשלב הבא, אחזר את ה-mRNA המסונתז מהמקפיא של מינוס 20 מעלות צלזיוס. הוסף 25 ננוגרם של ה-mRNA לנפח סופי של 50 ננו-ליטר. לאחר מכן יש להזריק את ה-mRNA לתוך הציטים לאחר ההזרקה.

הניחו את הביציות בתמיסת צלצול ומיליגרם אחד למיליליטר גנטמיצין ודגרו אותן בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס בחושך למשך שלושה עד שבעה ימים. זה מאפשר למשאבת הנתרן אשלגן להתבטא בתוך קרום הפלזמה של הביציות. ביום הניסוי, הוציאו את הביציות מהחממה והניחו אותן במאגר הטעינה למשך 45 דקות ולאחר מכן במאגר לאחר הטעינה למשך 45 דקות.

זה מגדיל את ריכוז הנתרן התוך תאי כדי להקל על מדידת משאבת הנתרן אשלגן. למדידות פלואורסצנטיות, דגרו את הציטים במאגר לאחר טעינה המכיל חמישה מיקרומולר של הפלואורופור הרצוי, כגון TMRM או FM למשך חמש עד 10 דקות בחושך. לאחר תיוג הפלורה הרביעית, שטפו את הביציות באופן ממצה עם מאגר פוסט נטול צבע.

שמור את הביציות בחושך כדי למנוע הלבנת תמונות. כדי להתכונן לשתי האלקטרודות, מהדק מדידות התחל במילוי המיקרו אלקטרודות בשלוש אשלגן כלורי מולארי ובדיקת ההתנגדות. ההתנגדות צריכה להיות בין 0.5 ל -1.5 מגה אוהם.

לניסויי סריקת ציסטאין, ציידו את המיקרוסקופ הקרינה במסנן עירור 5 35 DF 50, מסנן פליטת 5 65 EFLP ומראה 5 70 DRLP. לאחר מכן, הנח את האוקט בתא RC 10 על שלב המיקרוסקופ הפלואורסצנטי. לאחר מכן הכנס בעדינות את שתי המיקרו-אלקטרודות לתוך האוקט באמצעות המגבר כדי להחזיק את פוטנציאל הממברנה בערך קבוע.

מדוד את שטף היונים על פני הממברנה על ידי הפעלת החלבון בטכניקה מתאימה כגון החלפת תמיסה או שינוי פוטנציאל הממברנה. למדידות פלואורסצנטיות במקביל, השתמש במקור אור טונגסטן של 100 וואט כדי לעורר את הפלואורופור התורם וכדי להצמיד 0 2 2, צילום DDE כדי לזהות שינויים בעוצמת הקרינה לתיוג פלואורסצנטי. לאחר סריקת ציסטאין.

מדוד את השינוי בעוצמת הפלואורסצנט בזרם נייח באמצעות שלבי מתח הנשלטים על ידי תוכנת P clamp 10. חלק שני של הפרוטוקול כולל ביצוע מדידות אנטרופיה לצד מדידות מרחק. כדי לחשב את טווח ערכי הקאפה בריבוע, אטרופיה מודדת את הניידות היחסית של הפלואורו ארבע עקב סיבוב.

ראה את המאמר הנלווה לפירוט החישובים. כדי למדוד אילוצי מרחק, השתמש באנזים הולו, שיש לו שתי שאריות ציסטאין חוץ-תאיות נגישות שניתן לתייג עם ארבע פלואורו. הוסף מאגר לאחר טעינה המכיל FM מיקרומולרי אחד וארבעה TMRM מיקרומולרי.

זה התורם והמקבל. רביעיות פלואורו לאצווה אחת של ביציות מוסיפות FM מיקרו-מולרי אחד בלבד. זה רק התורם פלואורו.

ארבע לקבוצה נוספת של ביציות דוגרות על שתי קבוצות הביציות על הקרח למשך 30 דקות בחושך. זה מאפשר לבצע מדידות של אנזימי הולו המסומנים עם ובלי פלואורו ארבע מקבל. לאחר מכן, ציידו את המיקרוסקופ במסנן עירור 4 75 DF 40, מסנן פליטה 5 30 DF 30 ומראה דיכרואית 5 0 5 DRLP.

לאחר מכן הנח את הביצית בתא על שלב המיקרוסקופ הקרינה. שמירה על זרימת תמיסה רציפה מודדת את תלות הזמן של הלבנת התורם בנוכחות ובהיעדר הפלורה המקבלת. ארבע. ניתן להשתמש בתוצאות אלה כדי לחשב את המרחק בין שתי השאריות במשאבת הנתרן אשלגן באמצעות פורסטר.

משוואה שנייה: יש לבצע מדידות מהדק מתח אלקטרודה במקביל כדי להבטיח שהחלבון מתפקד. שימוש בתכונת המהדק X ב-P clamp 10 ממוצע את תוצאות השמדת הצילום של התורם פלואורו ארבע עבור מינימום של ארבע הקלטות באתר. כדי למדוד את התנועה היחסית של תת-יחידות חלבון השתמש במבנים כפולים של ציסטאין המכילים רביעיות פלואורו של מקבל ותורם.

עוצמת הקרינה בשאריות אלה אינה רגישה למצב האישור של החלבון ותהיה פונקציה של המרחק בין שני הארבעים. לאחר מכן, החלף את המסנן המוגדר במיקרוסקופ למסנן עירור 4 75 a F 40, מסנן פליטה 5 95 a F 60 ומראה דיכרואית 5 0 5 DRLP. לאחר מכן הנח את ה-OI בתא על שלב המיקרוסקופ הקרינה.

לאחר מכן, התורם נרגש עם מקור אור טונגסטן של 100 וואט ועוצמת הקרינה של המקבל. פלואורו ארבע נמדד בשיטה מתאימה כגון ליגנד מתח או החלפת תמיסה, מפעילים את חלבון הממברנה ומודדים בו זמנית את השינוי בעוצמת הקרינה. איור זה מראה את המתאם בין הובלת יונים על פני קרום התא ושינויים בעוצמת הקרינה.

העקבה העליונה מציגה מדידות מהדק נוכחיות בנוכחות תמיסת בדיקת נתרן ותמיסת בדיקת אשלגן בנוכחות 10 מיקרומולר ו -10 מילימולר. העקבה התחתונה מראה שינויים בעוצמת הקרינה הנמדדת בד בבד עם מדידות המהדק הנוכחיות. איור זה מציג שתי ביציות המסומנות ב-TMRM, המקבל פלואורו ארבע.

הביצית משמאל מבטאת נתרן אשלגן אטפה מסוג בר, בעוד שהביצית מימין מבטאת נתרן אשלגן APAs עם שאריות ציסטאין נגישות אחת. העקבות העליונים של איור זה מציגים נתוני זרם חולף על דופק מתח. העקבות התחתונים מראים הקלטות בזמן אמת של שינויים בעוצמת הקרינה עם דופק המתח.

איור זה מראה את התלות בזמן של פוטו-הלבנה, השמדת תמונות תורם נמדדת בהיעדר ונוכחות של פלואורו מקבל ארבע הלבנת פוטו מתרחשת מהר יותר ללא פלואורו מקבל ארבע. כל עקבה היא הממוצע של ארבע הקלטות אתר oh. איור זה מציג תנועה יחסית של תת-יחידה עם שינויים מאושרים.

שינויים פלואורסצנטיים מוצגים בעקבות האדומים וזרימת הזרם מוצגת בעקבות השחורים. עלייה בעוצמת הקרינה המוצגת משמאל מצביעה על כך שרצפות הצומח מתקרבות זו לזו. שום שינוי בעוצמת הקרינה המוצג באמצע מצביע על כך שמרחק הפלואור ארבע נשאר סטטי.

ירידה בעוצמת הקרינה המוצגת מימין מצביעה על כך שארבע הפלואורסצנטיות מתרחקות זו מזו בזמן ניסיון הליך זה. חשוב לזכור לתאם שינויים בעוצמת הקרינה הקינטית והיציבה לשינויים המאשרים בחלבון.