בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבחון את הדינמיקה הקונפורמציונית של חלבוני ממברנה באמצעות סימון פלואורסצנטי מכוון לאתר על פני שטח של תאים בודדים. דבר זה מושג תחילה על ידי מוטציה פרטנית של שאריות בממשק שבין הדומיינים החוץ-תאיים והטרנס-ממברנליים לציסטאין, כפי שמוצג על ידי ה-C האדום. לאחר מכן, יש לקבוע האם ניתן לסמן שארית זו באמצעות פלואורופור המגיב עם ציסטאין. השלב השני של הפרוצדורה הוא לבחון האם מוטגנזה לציסטאין ו/או סימון בפלואורופור משפיעים על הקינטיקה ו/או על המצב הקונפורמציוני של החלבון.

פעולה זו מבוצעת באמצעות המערך המוצג. השלב השלישי של הפרוטוקול הוא השוואה וניתוח של שינויים בעוצמת הפלואורסצנציה אל מול הפרמטרים הקינטיים של חלבון המטרה. עקבה טיפוסית של פלואורסצנציה מוצגת כאן.

השלב הסופי של הפרוצדורה הוא סימון זוגות ציסטאין מוטנטיים באמצעות Fluor fours תורמים או Fluor fours תורמים-מקבלים, כדי למדוד קצבי פוטו-הריס (photo destruction) במקביל למדידות voltage clamp לקביעת אילוצי מרחק. איור זה מציג קצבי פוטו-הריס של תורם בהיעדר מקבל בצבע שחור, ופוטו-הריס של תורם בנוכחות מקבל בצבע אדום. בסופו של דבר, ניתן להגיע לתוצאות המראות כי שינויים בעוצמת הפלואורסצנציה, הנובעים משינויים קונפורמציונליים בחלבון, ניתנים למתאם לתפקוד חלבוני הממברנה באמצעות voltage clamp fluorometry.

שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הובלת יונים דרך ממברנות, כגון האופן שבו שינויים במצב הקונפורמציוני של החלבון מקלים על הובלת יונים ומולקולות קטנות דרך ממברנת הפלזמה. התחל את הפרוטוקול על ידי שיבוט של משאבת נתרן-אשלגן לתוך וקטור המתאים לביטוי ב-Xenopus laevis oocytes. השלב הבא הוא יצירת מוטציות של ציסטאין בשאריות הממוקמות בממשק שבין התחומים התת-ממברנליים והחוץ-תאיים, כפי שמתואר במאמר המצורף.

עם הסיום, יש לאמת את הכנסת המוטציה באמצעות ריצוף DNA לאחר שעתוק ה-DNA הפלסמי ל-mRNA כפי שפורט במאמר הנלווה, ולכמת את תנובת ה-mRNA באמצעות ספקטרופוטומטר לפני הניתוח. יש להשביע את הצפרדע בחומיה במשך 12 שעות כדי למנוע הקאות במהלך הניתוח. כדי להתחיל בניתוח למחרת, יש להטביל את הצפרדע בתמיסת ההרדמה עד שהצפרדע לא תגיב יותר לצביטה בבוהן.

הוציאו את הצפרדע מתמיסת ההרדמה והניחו אותה כשהצד הגבי (dorsal) פונה כלפי מטה על הצד הסופג של פד חיתול. הניחו מגבת נייר רטובה על הצפרדע כדי לשמור עליה לחה. כמו כן, אם עיני הצפרדע פתוחות, שמרו עליהן לחות באמצעות תמיסת סליין.

בצעו חתך קטן ומדויק בצד אחד של קו האמצע של הצפרדע. אתרו את השחלה והוציאו אותה אל מחוץ לגוף הצפרדע. הימנעו ממגע של השחלה עם העור.

הסר את השחלה והנח אותה בצלחת פטרי המכילה תמיסת רינגר. בדוק אם יש דימום ברקמה שנותרה לפני החזרתה לחלל הבטן. אם מתרחש דימום, הפעל לחץ באמצעות מקלון צמר גפן סטרילי עד להפסקתו.

סיימו את הניתוח על ידי תפירת החתך באמצעות תפרים נפרדים. החזירו את הצפרדע למכלאתה כדי להתאושש מההרדמה באמצעות מספריים. חלקו את אונה השחלה המבודדת לחלקים קטנים יותר.

העבירו את הגושים לתמיסת רינגר בתוספת סידן עם קולגנאז. לאחר מכן, נערה בעדינות את תמיסת העיכול למשך שעתיים בטמפרטורה של 18 °C. כאשר מרבית התאים הופרדו, שטפו את הביציות בתמיסת רינגר ללא סידן.

לאחר מכן, דגרו את התאים הביציות למשך 10 דקות בתמיסת רינגר ללא סידן בטמפרטורת החדר. בשלב זה, שטפו את התאים ביסודיות בתמיסת רינגר עם סידן. לאחר מכן, העבירו את התאים הביציות לתמיסת רינגר עם סידן לצורך אחסון לפני ההזרקה.

בשלב הבא, הוצא את ה-mRNA המסונתז מהמקפיא בטמפרטורה של 20°C- . הוסף 25 nanograms של ה-mRNA לנפח סופי של 50 nanoliters. לאחר מכן, הזרק את ה-mRNA אל התאים לאחר ההזרקה.

העבירו את התאי הביצית (oocytes) לתמיסת רינגר עם 1 mg/mL גנטמיצין והדגירו אותם בטמפרטורה של 18 °C בחושך למשך שלושה עד שבעה ימים. פעולה זו מאפשרת את ביטויו של משאבת הנתרן-אשלגן בתוך ממברנת הפלזמה של התא הביצית. ביום הניסוי, הוציאו את התאי הביצית מהאינקובטור והעבירו אותם לתמיסת טעינה (loading buffer) למשך 45 דקות, ולאחר מכן לתמיסת טעינה מאוחרת (post loading buffer) למשך 45 דקות.

פעולה זו מעלה את ריכוז הנתרן התוך-תאי כדי להקל על מדידת משאבת הנתרן-אשלגן. למדידות פלואורסצנציה, דגרו את התאים בבופר לאחר טעינה (post loading buffer) המכיל 5 µM מהפלואורופור הרצוי, כגון TMRM או FM, למשך 5 עד 10 דקות בחושך. לאחר הסימון בפלואורופור, שטפו את האוציטים ביסודיות עם בופר לאחר טעינה נטול צבע.

שמרו את התאי הביצית (oocytes) בחשכה כדי למנוע פוטו-بلیצ'ינג (photo bleaching). כדי להיערך למדידות voltage clamp באמצעות שתי אלקטרודות, התחילו במילוי המיקרו-אלקטרודות ב-three molar potassium chloride ובדיקת ההתנגדות. ההתנגדות צריכה להיות בין 0.5 ל-1.5 mega ohms.

עבור ניסויי סריקת ציסטאין, ציידו את מיקרוסקופ הפלואורסצנציה במסנן עירור 5 35 DF 50, מסנן פליטה 5 65 EFLP ומראה דיכרואית five 70 DRLP. לאחר מכן, הניחו את האוקט (octe) בתא RC 10 עלבמתו של מיקרוסקופ הפלואורסצנציה. לאחר מכן, הכניסו בעדינות את שתי המיקרו-אלקטרודות אל האוקט, תוך שימוש במגבר לשמירה על פוטנציאל ממברנה בערך קבוע.

מדוד את שטף היונים דרך הממברנה על ידי הפעלת החלבון באמצעות טכניקה מתאימה, כגון החלפת תמיסה או שינוי פוטנציאל הממברנה. למדידות פלואורסצנציה סימולטניות, השתמש במקור אור טונגסטן של 100 watt כדי לעורר את הפלואורופור התורם וב-0 2 2, A photo DDE כדי לזהות שינויים בעוצמת הפלואורסצנציה עבור סימון פלואורסצנטי. לאחר סריקת ציסטאין.

מדדו את השינוי בעוצמת הפלואורסצנציה בזרם סטציונרי באמצעות מדרגות מתח הנשלטות על ידי תוכנת P clamp 10. חלק שני של הפרוטוקול כולל ביצוע מדידות anes atropy לצד מדידות מרחק. כדי לחשב את טווח ערכי הקאפה בריבוע, מדידות atropy בודקות את הניידות היחסית של ה-fluoro four כתוצאה מסיבוב.

ראו את המאמר הנלווה לפרטים על החישובים. למדידת אילוצי מרחק, השתמשו באנזים הולו (holo enzyme), לו שתי שאריות ציסטאין חוץ-תאיות נגישות שניתן לסמן באמצעות פלואורופורים. הוסיפו באפר לאחר טעינה (post loading buffer) המכיל 1 µM FM ו-4 µM TMRM.

אלו הם התורם והמקבל. לקבוצת ביציות אחת מוסיפים 1 µM של FM בלבד. זהו צבע התורם בלבד.

העבירו ארבעה ציטות לסבב נוסף של ציטות; דגרו את שני סבבי הציטות על קרח למשך 30 דקות בחושך. דבר זה מאפשר לבצע מדידות של אנזימי hollo המסומנים עם ובלי מקבל fluoro ארבע. לאחר מכן, ציידו את המיקרוסקופ במסנן עירור 475 DF 40, מסנן פליטה 530 DF 30 ומראה דיכרואית 505 DRLP.

לאחר מכן, מקמו את התאי הביצי (oocyte) בתא שנמצא על במת מיקרוסקופ הפלואורסצנציה. תוך שמירה על זרימה רציפה של תמיסה, מדדו את התלות בזמן של הבהרה (bleaching) של התור בנוכחות ובהיעדר הפלורה של המקבל. ארבע. ניתן להשתמש בתוצאות אלה כדי לחשב את המרחק בין שני השאריות במשאב הנתרן-אשלגן באמצעות שיטת Forester.

יש לבצע מדידות של קיבוע מתח (voltage clamp) באלקטרודה שתיים במקביל כדי להבטיח שהחלבון תפקודי. באמצעות תכונת ה-clamp X ב-P clamp 10, חשבו את ממוצע התוצאות של ההרס הפוטו-כימי של הפלואורופור התורם עבור ארבעה הקלטות מאתרים שונים לפחות. כדי למדוד את התנועה היחסית של תת-יחידות החלבון, השתמשו במבני ציסטאין כפולים המכילים פלואורופורים מקבלים ותורמים.

עוצמת הפלואורסצנציה בשיירים אלו אינה רגישה למצב הקונפורמציוני של החלבון ותהיה פונקציה של המרחק בין שני הפלואורים. לאחר מכן, שנו את מערכת המסננים במיקרוסקופ למסנן עירור 475 a F 40, מסנן פליטה 595 a F 60 ומראה דיכרואית 505 DRLP. לאחר מכן, הניחו את ה-OI בתא שעל במה של מיקרוסקופ הפלואורסצנציה.

בשלב הבא, התור מעורר באמצעות מקור אור טונגסטן של 100 watt ועוצמת הפלואורסצנציה של המקבל, Fluoro four, נמדדת באמצעות שיטה מתאימה כגון voltage ligand או החלפת תמיסה; הפעילו את חלבון הממברנה ומדדו בו-זמנית את השינוי בעוצמת הפלואורסצנציה. איור זה מציג את המתאם בין הובלת יונים דרך ממברנת התא לבין שינויים בעוצמת הפלואורסצנציה.

העקבה העליונה מראה מדידות current clamp בנוכחות תמיסת בדיקה של נתרן ותמיסת בדיקה של אשלגן בנוכחות 10 micromolar ו-10 millimolar ing. העקבה התחתונה מראה שינויים בעוצמת הפלואורסצנציה שנמדדו במקביל למדידות ה-current clamp. איור זה מציג שני ציטים (oocytes) המסומנים ב-TMRM, הפלואורו-מקבל הרביעי.

האוציט משמאל מבטא sodium potassium atpa מסוג בר (wild type), בעוד שהאוציט מימין מבטא sodium potassium APAs עם שארית ציסטאין נגישה אחת. העקומות העליונות באיור זה מציגות נתונים של זרם חולף בעקבות פולס מתח. העקומות התחתונות מציגות הקלטות בזמן אמת של שינויים בעוצמת הפלואורסצנציה בעקבות פולס מתח.

איור זה מציג את התלות בזמן של פוטובליצ'ינג; הרס פוטו-כימי של התורד נמדד בהיעדרו ובנוכחותו של מקבל פלואורו-4. פוטובליצ'ינג מתרחש במהירות רבה יותר ללא מקבל פלואורו-4. כל עקבה היא ממוצע של ארבעה רישומי oh site. איור זה מציג תנועה יחסית של תתי-יחידות בעקבות שינויים קונפורמציונליים.

שינויים בפלואורסצנציה מוצגים בעקבות האדומות וזרימת זרם מוצגת בעקבות השחורות. עלייה בעוצמת הפלואורסצנציה המוצגת משמאל מעידה על כך ששכבות הפלואור נעות קרוב יותר זו לזו. היעדר שינוי בעוצמת הפלואורסצנציה המוצג במרכז מעיד על כך שהמרחק בין שכבות הפלואור נותר סטטי.

ירידה בעוצמת הפלואורסצנציה המוצגת מימין מעידה על כך שהפלואורופורים מתרחקים זה מזה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לקשר בין שינויים בעוצמת הפלואורסצנציה במצב קינטי ובמצב יציב לבין שינויים קונפורמציוניים בחלבון.