ניתוח Transcriptome של תאים בודדים
April 25th, 2011
במאמר זה אנו מתארים שיטה פשוטה קצירת של תאים בודדים מתרבויות עכברוש העיקרי העצבית וניתוח transcriptome הבאים באמצעות הגברה ארנה. גישה זו היא להכליל לכל סוג תא.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין דגימות מתאים בודדים לניתוח טרנסקריפטום. זה מושג על ידי מציאת תא מתאים לבידוד. לאחר מכן המיקרו פיפטה ממוקמת ליד התא שיש לבודד.
לאחר מכן, יניקה מוחלת על המזרק עד שהתא נמשך לקצה המיקרו פיפטה. השלב האחרון בהליך הוא לשבור את קצה המיקרו פיפטה לתוך צינור האיסוף ולהשליך את יתרת תכולת המיקרו פיפטה לתוך הצינור. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות הבדלים באוכלוסיות mRNA בין תאים באמצעות ניתוח מיקרו-מערך של חומר מוגבר בשיטת הגברת ארנה, המתוארת גם בפרוטוקול או ליישומים אחרים כגון PCR או ריצוף הדור הבא.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה והבדלים בין תאים בודדים, ניתן ליישם אותה גם על תאים תת-תאיים כגון דנדריטים או מחלקות של דנדריטים, ולספק מידע חשוב על תפקוד הדנדריטים. תדגים את ההליך ג'ניפר סינג, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלי לפני תחילת פרוטוקול זה, נוירונים ראשוניים מהיום העוברי ה-18, היפופוטם קמפי חולדה צופו על פתקי כיסוי של 12 מילימטר בצלחת של 35 מילימטר ונשמרו כמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי להכין פיפטות לקציר, השתמש במושך מיקרו פיפטות כדי למשוך פיפטות זכוכית חיטוי לקוטר המתאים לאלקטרופיזיולוגיה.
באמצעות התוכנית המוגדרת מראש של היצרן, גודל הקידוח אינו קריטי מכיוון שהקצה יישבר לפני איסוף התאים. אחסן בזהירות את הפיפטות בסביבה נטולת אבק, כגון צנצנת אחסון מיקרו פיפטה, שם הקצוות יישארו שלמים כשהם מוכנים לקצור תאים. הכן את המספר הרצוי של צינורות איינור של 1.7 מיליליטר על ידי הוספת שני מיקרוליטר PBS לאחסון החומר שנקטף.
הסר צלחת 1 35 מילימטר של החלקות כיסוי מהחממה במכסה מנוע לתרבית רקמות. העבירו במהירות פתק כיסוי אחד מהצלחת הזו למכסה של צלחת חדשה בגודל 35 מילימטר המכילה HBSS. זה קריטי להחזיר לאינקובטור פתקי כיסוי שאינם עוברים מניפולציה מכיוון שהתאים הופכים לא בריאים.
אם משאירים אותו בחוץ לפרקי זמן ממושכים. מיקרוסקופ אור הפוך עם מטרה של פי 40 המצויד במניפולטור מיקרו נחוץ לקצירת תאים. השתמש במחזיק פיפטה עם צינור גמיש המוביל הרחק מהמחזיק, הצמד את הצינור למשטח יציב כדי למנוע תנועה לא רצויה של הפיפטה במהלך האיסוף.
בקצה הצינור, הכנס מחט כך שניתן יהיה לחבר ולהחליף מזרק מיליליטר אחד עם חיבור נעילת פיתוי בין המשתמשים. הכן את המיקרו פיפטה על ידי שבירת הקצה בצורה מבוקרת על ידי החזקת מגבון קים מתוח בין אצבעות יד אחת והברשה עדינה מאוד של קצה הפיפטה על פני הנייר פעם עד פעמיים. הפתח צריך להיות בערך 75 עד 100% מגודל תא המטרה.
אבטח את המיקרו פיפטה במחזיק המיקרו פיפטה והצמד את מחזיק המיקרו פיפטה לתוספת על המניפולטורים המיקרו. לבסוף, הגדר את יעד ה-40 x. הניחו את המנה על במת המיקרוסקופ ומצאו אזור תאים המתאים לקציר.
במקרה של תרבויות עצביות ראשוניות, התא צריך להיות מבודד יחסית משכניו. כדי למנוע קציר של תאים ו/או תהליכים מסביב, מקם את התא המיועד לקציר במרכז שדה הראייה. השתמש במניפולטור המיקרו כדי לקדם את המיקרו פיפטה לעבר התמיסה בצלחת לנתיב האור.
הורד את קצה הפיפטה לתמיסה. בהסתכלות דרך העינית, הפיפטה צריכה להופיע כצל בשדה הראייה. הפעל לחץ חיובי מנקודה זו ואילך על ידי נשיפה קלה דרך המזרק הרבה מעל מישור התאים.
כוונן את מיקום קצה הפיפטה עד שהוא נמצא בשדה הראייה והתמקד בקצה הפיפטה באמצעות כפתורי המיקוד של המסלול. בשלב זה, העריכו אם גודל הקדח של הפיפטה גדול מדי או קטן מדי. אם גודל הקדח שגוי, החלף במיקרו פיפטה אחרת עד למציאת גודל הקדח הנכון כדי למנוע שבירת פיפטה באזור האיסוף.
השתמש במיקוד הקורס כדי לקדם את מישור המוקד לפני קידום קצה הפיפטה לעבר התאים באמצעות מניפולטורים מיקרוניים. כאשר התאים מתקרבים, השתמש במיקוד העדין עד שגם התאים וגם קצה הפיפטה יהיו ממוקדים. הפסק להפעיל לחץ חיובי לפני שמגיעים לתאי התובע כדי להימנע מפיצוץ אותם מהחלקת הכיסוי.
מקם את קצה הפיפטה עם המניפולטורים המיקרו כך שהוא נוגע בסומה של התא שיש לקצור. בעזרת המזרק, הפעל יניקה עדינה דרך הפה עד שהתא נכנס לקצה הפיפטה. אם התא אינו נכנס לפיפטה, קרב בעדינות את הקצה לתא וכלפי מטה עד שהוא מתרומם מהחלקת הכיסוי.
השתמש במניפולטור המיקרו כדי להזיז מיד את הפיפטה למעלה והחוצה מהתמיסה. הסר את הפיפטה מהמחזיק. החזיקו ביד אחת את צינור ה-einor המוכן בנפח 1.7 מיליליטר, ושברו בעדינות את קצה הפיפטה בצד הצינור לכיוון התחתון.
מכוון לסימן של 0.1 מיליליטר כשהקצה השבור מרוכז בתוך הצינור, הכנס מחט המחוברת למזרק מיליליטר אחד לפתח העליון של הפיפטה. לחץ במהירות על הבוכנה, ואילץ את התמיסה בפיפטה להתיז החוצה לתוך הצינור. הקפד לא לגעת בקצה בנוזל כלשהו בצידי הצינור.
מכיוון שפעולה נימית תחזיר את הנוזל לתוך הפיפטה, התא צריך להישאר ממש בקצה הפיפטה, וזה צריך להיות מספיק כדי להוציא את התא כראוי. סובב במהירות את תכולת הצינור באמצעות מיקרו פוגה שולחנית והקפיא על קרח יבש או הניח על קרח לעיבוד נוסף או ליישומים אחרים כגון PCR או ריצוף מהדור הבא. מוצגת כאן דוגמה לקציר מוצלח של תא עצב מבודד.
כדי להתחיל, נבחר אזור תאים בצפיפות נמוכה יחסית. לאחר מכן הוקדם קצה הפיפטה לעבר התא הרצוי. כאן שדה הראייה מוצג לאחר קצירת התא.
שימו לב שהתהליכים שמסביב נשארים על תלוש הכיסוי. לעומת זאת, איור זה מדגים שתי תמונות של קצות פיפטות, שגודלן אינו מתאים לקטיף יעיל. טיפ זה יוביל לקציר לא שלם ואילו הטיפ המוצג כאן יביא לקציר הסביבה שמסביב.
לאחר הקציר, וניתוח הגברת RNA, מומלץ להשתמש בביואנלייזר כדי לבחון את התפלגות וכמות ה-RNA המוגבר. הגברה מוצלחת מחומר תא בודד תניב כמויות כוללות במיקרוגרמים הנמוכים ותהיה לה פיזור חלק ורחב לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך דקות אם מבוצעת כראוי תוך ביצוע הליך זה, חשוב להשתמש בטכניקה נטולת RNA.
סקירה
מאמר זה מציג שיטה לאיסוף תאים בודדים מתרביות עצביות ראשוניות של חולדות לניתוח טרנסקריפטום באמצעות הגברת aRNA. הטכניקה ניתנת להתאמה לסוגי תאים שונים, ומאפשרת מחקר מפורט של ביטוי גנים ברמת תא בודד.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירו-מדע
- ביולוגיה תאית
- טרנסקריפטומיקה
רקע
- ניתוח תא בודד מספק תובנות לגבי הטרוגניות תאית.
- הבנת הבדלי ביטוי גנים חיונית למחקר בנוירו-מדע.
- תרביות עצביות ראשוניות חיוניות לחקר תפקוד עצבי.
- טכניקות איסוף הן חיוניות לניתוח טרנסקריפטום מדויק.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה אמינה לבידוד נוירונים בודדים.
- להקל על ניתוח טרנסקריפטום של תאים בודדים.
- להעמיק את ההבנה של השונות בביטוי גנים בנוירונים.
שיטות בהן נעשה שימוש
- בידוד תאים בודדים באמצעות טכניקות מיקרו פיפטה.
- יישום של הגברת aRNA לניתוח טרנסקריפטום.
- שימוש במיקרוסקופ אור הפוך לויזואליזציה של תאים.
- מניפולטור מיקרו להנחת פיפטה מדויקת.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של נוירונים בודדים מתרביות ראשוניות.
- הוכחת הבדלים באוכלוסיות mRNA בין תאים מבודדים.
- יישומים פוטנציאליים ב-PCR ורצף דור הבא.
- תובנות לגבי תפקוד דנדריטי דרך איסוף ממוקד.
מסקנות
- השיטה מאפשרת ניתוח טרנסקריפטומי מפורט ברמת תא בודד.
- ניתן להתאים אותה לסוגי תאים שונים מעבר לנוירונים.
- גישה זו משפרת את הבנתנו על גיוון תאי בתצורות עצביות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Single-cell transcriptome analysis enables biopharma teams to resolve cellular heterogeneity and uncover gene expression differences that are masked in bulk tissue assays. This capability is critical for target validation, mechanistic de-risking, and prioritizing disease-relevant cell populations in early discovery. Integrating robust single-cell workflows strengthens predictive confidence and informs portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene expression at the resolution of individual cells, clarifying pathway activity and target engagement.
- Supports biological de-risking by distinguishing molecular signatures between cell types and subcellular compartments.
- Improves predictive confidence for target selection by revealing heterogeneity within disease-relevant tissues.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated single-cell samples for downstream transcriptomic assays.
- Enables reproducible isolation and amplification of RNA from individual cells, supporting quantitative assay development.
- Provides scalable input material for microarray, PCR, or next-generation sequencing platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant neuronal subtypes or compartments, supporting translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation by enabling single-cell resolution analyses.
- Reduces risk of advancing non-representative targets by confirming expression in relevant cell populations.
Pipeline & Workflow Integration
This single-cell isolation and aRNA amplification workflow bridges early discovery and preclinical research, providing high-resolution transcriptomic data for target validation and lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling gene expression analysis at the single-cell level.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA outputs suitable for downstream high-throughput assays.
- Analytics: Generates amplified RNA for microarray or sequencing, enabling robust comparison of gene expression across conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease-relevant neuronal subtypes or compartments.
- Enterprise Reuse: Provides a standardized, adaptable workflow for diverse cell types and experimental models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes single-cell isolation and amplification, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with validated cellular relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell handling and RNA-free technique to prevent contamination.
- Needs access to micro-manipulation instrumentation and analytical platforms for RNA quantification and analysis.
- Demands cross-team standardization of isolation and amplification protocols for reproducibility.
- Adaptable to various cell types and subcellular compartments with protocol modifications.
- Sample integrity and RNA yield are sensitive to handling and timing, requiring careful workflow management.
