ניתוח Transcriptome של תאים בודדים
25 באפריל 2011
במאמר זה אנו מתארים שיטה פשוטה קצירת של תאים בודדים מתרבויות עכברוש העיקרי העצבית וניתוח transcriptome הבאים באמצעות הגברה ארנה. גישה זו היא להכליל לכל סוג תא.
המטרה הכללית של הליך זה היא להכין דגימות מתאים בודדים לצורך אנליזה של הטרנסקריפטום. דבר זה מושג תחילה על ידי מציאת תא המתאים לבידוד. לאחר מכן, המיקרו-פיפט ממוקם לצד התא המיועד לבידוד.
בשלב הבא, מפעילים יניקה באמצעות המזרק עד שהתא נמשך אל קצה המיקרו-פיפט. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא שבירת קצה המיקרו-פיפט לתוך מבחנת האיסוף וריקון התכולה שנותרה במיקרו-פיפט לתוך המבחנה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות הבדלים באוכלוסיות mRNA בין תאים באמצעות ניתוח microarray של חומר שהוגבר בשיטת arna amplification, המתוארת אף היא בפרוטוקול, או עבור יישומים אחרים כגון PCR או next generation sequencing.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ההבדלים בין תאים בודדים, ניתן להחיל אותה גם על מדורים תת-תאיים כגון דנדריטים או סוגים של דנדריטים, ובכך להפיק מידע חשוב על תפקוד הדנדריטים. את הפרוצדורה תדגים ג'ניפר סינג, פוסט-דוקטורנטית במעבדתי. לפני תחילת הפרוטוקול, נוירונים ראשוניים מיום עוברי 18 של Hippo Campi של חולדה נזרעו על לבישות זכוכית (cover slips) בקוטר 12 מילימטר בתוך צלחת של 35 מילימטר ונשמרו כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. להכנת פיפטות לאיסוף, השתמשו במכשיר משיכה של מיקרו-פיפטות כדי למשוך פיפטות זכוכית שעברו עיקור באוטוקלאב לקוטר המתאים לאלקטרופיזיולוגיה.
בשימוש בתוכנית המוגדרת מראש של היצרן, גודל הפיה אינו קריטי כיוון שהקצה יישבר לפני איסוף התאים. אחסנו את הפיפטים בזהירות בסביבה נקייה מאבק, כגון צנצנת אחסון לפיפטים מיקרו, כדי שהטיפים יישמרו שלמים עד למועד קצירת התאים. הכינו את מספר צינורות ה-eppendorf בנפח 1.7 milliliter הרצוי על ידי הוספת 2 µL של PBS לאחסון החומר שנקצר.
הוצא מתוך האינקובטור, תחת מנדף לתרביות רקמה, צלחת אחת בקוטר 35 מילימטר המכילה לוחות כיסוי. העבר במהירות לוח כיסוי אחד מצלחת זו אל המכסה של צלחת חדשה בקוטר 35 מילימטר המכילה HBSS. חשוב להחזיר את לוחות הכיסוי שאינם בטיפול לאינקובטור, שכן התאים עלולים להיפגע.
אם הם נשארים בחוץ לפרקי זמן ממושכים. לצורך קצירת התאים נדרש מיקרוסקופ אור הפוך עם עדשה אובייקטיבית של 40x המצוידת במניפולטור מיקרוסקופי. השתמש במחזיק פיפט עם צינור גמיש המוביל הרחק מהמחזיק, והצמד את הצינור למשטח יציב כדי למנוע תזוזה לא רצויה של הפיפט במהלך האיסוף.
בקצה הצינור, הכנס מחט כך שניתן יהיה לחבר ולהחליף מזרק של one milliliter עם חיבור lure lock בין משתמשים שונים. הכן את המיקרופיפט על ידי שבירה מבוקרת של הטיפ, תוך כדי מתיחת נייר Kim wipe בין אצבעות יד אחת והעברה עדינה מאוד של קצה הפיפט על פני הנייר פעם אחת עד פעמיים. הפתח צריך להיות בערך 75% עד 100% מגודל התא המטרה.
הדק את המיקרו-פיפט במחזיק המיקרו-פיפט וחבר את מחזיק המיקרו-פיפט למתאם של המיקרו-מניפולטורים. לבסוף, הגדר את העדשה האובייקטיבית 40x. הנח את הצלחת עלבמה של המיקרוסקופ ואתר אזור של תאים המתאים לאיסוף.
במקרה של תרביות נוירונים ראשוניות, התא צריך להיות מבודד יחסית משכניו. כדי למנוע איסוף של תאים סביבים ו/או של שלוחותיהם, מקמו את התא המיועד לאיסוף במרכז שדה הראייה. השתמשו במיקרו-מניפולטור כדי להקדם את המיקרו-פיפט לעבר התמיסה שבצלחת אל תוך נתיב האור.
הנמיקו את קצה הפפיטה אל תוך התמיסה. במבט דרך העינית, הפפיטה צריכה להופיע כצל בשדה הראייה. מהשלב הזה ואילך, הפילו לחץ חיובי על ידי נשיפה קלה דרך המזרק, הרחק מעל מישור התאים.
כוון את מיקום קצה הפיפטה עד שיהיה בתוך שדה הראייה, ובצע פוקוס על קצה הפיפטה באמצעות גלגלי המיקוד הגס. בנקודה זו, הערך האם קוטר החור של הפיפטה גדול מדי או קטן מדי. אם קוטר החור אינו נכון, החלף במיקרו-פיפטה אחרת עד למציאת קוטר החור המתאים, וזאת כדי למנוע שבירה של הפיפטה באזור האיסוף.
השתמשו בגלגל המיקוד הגס כדי להקדים את מישור המיקוד לפני קידום קצה הפ pipette לעבר התאים באמצעות המיקרו-מניפולטורים. ככל שהתאים מתקרבים, השתמשו במיקוד העדין עד שהתאים וקצה ה-pipette נמצאים במיקוד. הפסיקו להפעיל לחץ חיובי לפני ההגעה לתאי המטרה כדי למנוע את דחיפתם מהזכוכית של כיסוי הלמינציה.
מקמו את קצה הפפטה באמצעות המיקרו-מניפולטורים כך שיהיה במגע עם סומת התא המיועד לאיסוף. באמצעות המזרק, הפעילו יניקה עדינה בעזרת הפה עד שהתא יישאב לתוך קצה הפפטה. אם התא אינו נשאב לפפטה, הזיזו בעדינות את הקצה קרוב יותר לתא ומטה עד שהוא יתנתק מזכוכית הכיסוי.
השתמשו במיקרו-מניפולטור כדי להרכיב מיד את הפ pipette כלפי מעלה ולהוציאו מהתמיסה. הוציאו את ה-pipette מהמעמד. החזיקו ביד אחת את מבחנת ה-einor בנפח 1.7 milliliter שהוכנה, ושברו בעדינות את קצה ה-pipette על דופן המבחנה לכיוון התחתית.
כוון אל סימון ה-0.1 milliliter כאשר הקצה השבור ממורכז בתוך המבחנה, והחדר מחט המחוברת למזרק של one milliliter אל הפתח העליון של הפיפטה. לחץ במהירות על הבוכנה כדי לדחוף את התמיסה שבפיפטה להתרסס אל תוך המבחנה. הקפד שהקצה לא ייגע בנוזל כלשהו על דפנות המבחנה.
מכיוון שפעולת הנימיות תחזיר את הנוזל אל תוך הפיפטה, התא אמור להישאר בקצה הפיפטה, ודבר זה אמור להספיק כדי להוציא את התא כראוי. סובבו במהירות את תכולת המבחנה באמצעות מיקרו-צנטריפוגה שולחנית והקפיאו על קרח יבש או הניחו על קרח לעיבוד המשך או ליישומים אחרים כגון PCR או ריצוף מהדור הבא. מוצגת כאן דוגמה לאיסוף מוצלח של נוירון מבודד.
בתחילה, נבחר אזור בעל צפיפות תאים נמוכה יחסית. לאחר מכן, קצה הפ pipette הובא לעבר התא הרצוי. כאן מוצג שדה הראייה לאחר שהתא נאסף.
שימו לב שהתהליכים שסביב נשארים על לביב הכיסוי. לעומת זאת, איור זה מציג שתי תמונות של קצות פיפט, שגודלם אינו מתאים לאסוף את הדגימות ביעילות. קצה פיפט זה יוביל לאיסוף חלקי, בעוד שקצה הפיפט המוצג כאן יגרום לאיסוף של הסביבה המקיפה.
לאחר הקצירה, וביצוע אנליזת הגברה של RNA, מומלץ להשתמש ב-bioanalyzer כדי לבחון את ההתפלגות והכמות של ה-RNA שהוגבר. הגברה מוצלחת מחומר של תא בודד תניב כמויות כוללות בסדר גודל של מיקרוגרמים בודדים ותהיה בעלת התפלגות חלקה ורחבה. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן להשלימה תוך דקות במידה והיא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להשתמש בטכניקה נטולת RNA.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לאיסוף תאים בודדים מתרביות ראשוניות של נוירונים של חולדה לצורך ניתוח טרנסקריפטום באמצעות הגברה של aRNA. הטכניקה ניתנת להתאמה לסוגי תאים שונים, ומאפשרת מחקר מפורט של ביטוי גנים ברמת התא הבודד.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טרנסקריפטומיקה
רקע
- ניתוח של תא בודד מספק תובנות לגבי הטרוגניות תאית.
- הבנת ההבדלים בביטוי גנים היא קריטית למחקר בתחום מדעי המוח.
- תרביות נוירונים ראשוניות הן חיוניות לחקר התפקוד הנוירונלי.
- טכניקות קציר הן חיוניות לצורך ניתוח מדויק של התסריפטום.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לבידוד נוירונים בודדים.
- הבטחת יכולת לביצוע ניתוח טרנסקריפטום של תאים בודדים.
- שיפור ההבנה של השונות בביטוי גנים בנוירונים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- בידוד תאים בודדים באמצעות טכניקות של מיקרו-פיפטה.
- יישום הגברת aRNA לצורך אנליזה של התראנסקריפטום.
- שימוש במיקרוסקופיית אור הפוכה לוויזואליזציה של תאים.
- מיקרו-מניפולטור למיקום מדויק של הפיפטה.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של נוירונים בודדים מתרביות ראשוניות.
- הדגמה של הבדלים באוכלוסיות mRNA בין תאים מבודדים.
- יישומים פוטנציאליים ב-PCR ובריצוף מהדור הבא (next-generation sequencing).
- תובנות לגבי תפקוד דנדריטי באמצעות איסוף ממוקד.
מסקנות
- השיטה מאפשרת ניתוח טרנסקריפטומי מפורט ברמת התא הבודד.
- ניתן להתאימה לסוגי תאים שונים מעבר לנוירונים.
- גישה זו מעמיקה את הבנתנו לגבי השונות התאית ברקמות עצביות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח טרנסקריפטום של תא בודד מאפשר לצווטי ביו-פארמה לפתור הטרוגניות תאית ולחשוף הבדלי ביטוי גנים המוסתרים בבדיקות רקמה כוללתות (bulk tissue assays). יכולת זו היא קריטית לתיקוף מטרות (target validation), להפחתת סיכונים מכניסטיים ולתיעדוף אוכלוסיות תאים רלוונטיות למחלה בשלבי הגילוי המוקדמים. שילוב של תהליכי עבודה חסונים של תא בודד מחזק את הביטחון בחיזוי ומסייע בקבלת החלטות לגבי תעדוף תיקי פיתוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של ביטוי גנים ברזולוציה של תאים בודדים, ובכך מבהיר את הפעילות של מסלולים ואת המעורבות של מטרות.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבחנה בין חתימות מולקולריות בין סוגי תאים ומדורים תת-תאיים.
- משפר את הביטחון החזוי בבחירת מטרה על ידי חשיפת ההטרוגניות בתוך רקמות רלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מקל על הכנת דגימות של תאים בודדים שעברו תיקוף עבור בדיקות טרנסקריפטומיות בהמשך התהליך.
- מאפשר בידוד והגברה הדירים של RNA מתאים בודדים, ובכך תומך בפיתוח של בדיקות כמותיות.
- מספק חומר מוצא הניתן להרחבה (scalable) עבור פלטפורמות של מערכי מיקרו (microarray), PCR או ריצוף דור הבא (next-generation sequencing).
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- מתאם בין פרופיל מולקולרי לבין סוגי תאי עצב או מדורים רלוונטיים למחלה, ובכך תומך בגילוי ביומרקרים תרגומיים.
- שומר על רצף משלב הגילוי המוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוחים ברזולוציית תא בודד.
- מפחית את הסיכון לקידום מטרות שאינן רפרזנטטיביות באמצעות אישור הביטוי באוכלוסיות תאים רלוונטיות.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
תהליך עבודה זה לבידוד תאים בודדים והגברה של aRNA מגשר בין שלב הגילוי המוקדם למחקר פרה-קליני, ומספק נתונים טרנסקריפטומיים ברזולוציה גבוהה לצורך תיקוף מטרות וזיהוי מועמדים תרופתיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות לניתוח ביטוי גנים ברמת התא הבודד.
- סריקה: מספק תוצרי RNA כמותיים וניתנים לשחזור המתאימים לבדיקות בעתק גבוה (high-throughput) בהמשך התהליך.
- אנליטיקה: מייצר RNA מוגבר עבור מערכים של מיקרו-מערכים (microarray) או ריצוף, מה שמאפשר השוואה חסונה של ביטוי גנים בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מולקולריים לסוגי תאי עצב או מדורים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר בארגון: מספק זרימת עבודה סטנדרטית וניתנת להתאמה עבור סוגי תאים ומודלים ניסיוניים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בידוד והגברה של תא בודד, ובכך משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability).
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלות לגבי המשך או הפסקת התהליך (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים וקידום של מטרות בעלות רלוונטיות תאית מאושהת.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בתאים בודדים ובטכניקה נטולת RNA למניעת זיהום.
- נדרשת גישה למכשור למיקרו-מניפולציה ולפלטפורמות אנליטיות לכימות וניתוח של RNA.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי בידוד והגברה לצורך הדירות (reproducibility).
- ניתן להתאימה לסוגי תאים שונים ולתאים תת-תאיים באמצעות שינויים בפרוטוקול.
- שלמות הדגימה ותשוא ה-RNA רגישים לאופן הטיפול ולתזמון, דבר הדורש ניהול קפדני של זרימת העבודה.
