Name: ניתוח Transcriptome של תאים בודדים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: למדו שיטה לאיסוף תאים בודדים מתרביות נוירונים ראשוניות של עכברים לניתוח טרנסקריפטומי באמצעות הגברת aRNA. טכניקה זו מאפשרת חקר הביטוי הגני ברמת התא הבודד ומסייעת להבנת ההטרוגניות התאית במחקר נוירולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תודה קווין Miyashiro עבור ציפוי ושמירה על תרביות תאים, ד&quot;ר טרי שוחט למתן בתרביות תאים עבור התמונות הכלולים במסמך זה. בנוסף, תודה קווין Miyashiro, ד&quot;ר פיטר באקלי, ו Tiina Pertiz עבור קלט על ההליך ארנה. מימון עבור עבודה זו היה מן המכון הלאומי להזדקנות, המכון הלאומי לבריאות הנפש ואת משאבי אנוש Finder עובדה כספים Commonwealth פנסילבניה.

<ol><li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li>
<li>Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell molecular biology.</a> Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).</li>
<li>Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1%3A+Demonstration+and+Validation+of+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity.</a> The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).</li>
<li>Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neurons+as+experimental+systems+in+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Single neurons as experimental systems in molecular biology.</a> Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).</li>
<li>Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+gene+expression+analysis%3A+Implications+for+Neurodegenerative+and+Neuropsychiatric+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neeurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders.</a> Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).</li>
<li>Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+DNA+synthesis+in+situ%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enxymol%22%5BJournal%5D)">Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications.</a> Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).</li>
<li>Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).</li>
<li>Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+antisense+RNA+amplification+and+microarray+analysis+as+a+tool+for+studying+neurological+degeneration+and+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Aging+Knowledge+Eviron%22%5BJournal%5D)">Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration.</a> Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).</li>
<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126, 397-425 (1977).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22P-1000+%26+P-97+Pipette+Cookbook%22">P-1000 & P-97 Pipette Cookbook</a>. , rev. F, Sutter Instrument. (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MinElute+Handbook+For+MinElute+Reaction+Cleanup+Kit%22">MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit</a>. , Qiagen. 28-29 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Megascript+kit%22">Megascript kit</a>. , Ambion. 7-8 Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MEGAclear+kit%22">MEGAclear kit</a>. , Applied Biosystems. 4-5 Forthcoming.</li>
<li>Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+expression+analysis+of+tissue+sections+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">mRNA expression analysis of tissue sections and single cells.</a> The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).</li>
<li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).</li>
<li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis%3A+Implications+for+neuronal+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li>
<li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li>
<li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis%3A+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+%28PREXCEL-Q%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li>
<li>Vandewoestyne, M., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+forensic+research%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> Int J Legal Med. 124, (2010).</li>
<li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li>
</ol>

ד&quot;ר Eberwine הוא ממציא על הפטנט ארנה כי כבר ברישיון כדי טכנולוגיות LBS שבו ד&quot;ר Eberwine הוא בעל המניות.

הערות ופתרון בעיות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומלץ לקחת לפני ואחרי תמונות מראה כי תא היעד היה מבודד וכי הילה הנותרים נותר ללא שינוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הפתרון יותר מדי נכנסת פיפטה כפי שאתה קציר, אתה יכול להשתמש 3 דרך Luer-Lock אביזרי על הבוכנה של המזרק כדי להחזיק לחץ חיובי בצינור. הנפח הרצוי ישתנו עם סוג של עיבוד אבל עד 5 μl אמור להיות בסדר עבור רוב היישומים. </li></ul> טיפים כלליים על שיטות ביולוגיות מולקולריות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס כל צינורות מניות ספין אותם לפני הוספת התגובה. לעולם אנזימים מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב ביסודיות התגובות לפני הוספת האנזים על מנת להבטיח כי המאגר הינו בריכוז הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על מניות אנזים ב -20 ° C ואם אפשר באמצעות stratacooler. אחרת, להסיר מיד לפני השימוש, לשמור על הקרח, ולחזור מיד -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיד לעשות מאסטר מתערבב בעת הכנת אחד או יותר התגובה כדי להפחית טעויות pipetting. חשב את נפח הנדרש מבוסס על מספר דוגמאות ולהוסיף 10-20%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות RNA ב -80 ° C עד השפלה מפגר. RNA הוא היציב ביותר מאוחסנים חיץ apurination מפגר של רנ&quot;א מתרחשת בתנאים חומציים. </li></ul> תרשים כללי של נוהל ארנה איור 4A מדגים את הסיבוב הראשון של ההליך ארנה. בתגובה הגדיל הראשון, החלק poly-T של פריימר (DT) T7-אוליגו בוחר עבור מינים mRNA (מלבן לבן ארוך) באמצעות קשירה של זנבות פולה. רנ&quot;א חלקם polyadenylated גם יהיה שנתפסו על ידי הליך זה. וחשוב יותר, עם זאת, RNAs הנפוץ ביותר בתא, RNAs ריבוזומלי, לא. אוליגו זה משמש פריימר עבור transcriptase הפוכה לסנתז גדיל משלים של cDNA (מלבן אפור ארוך) באמצעות ה-mRNA כתבנית. החלק T7 של פריימר (DT) T7-אוליגו משלבת את האמרגן T7-RNA פולימראז בתוך מסגרת עם antisense את רצף ה-mRNA אל ההתחלה. זה משמש מאוחר יותר את התגובה במבחנה ב שעתוק. בשלב הבא, ה-mRNA ב היברידית mRNA / DNA שנוצר בשלב הקודם הוא הידרוליזה חלקית על ידי Rnase H ליצירת רנ&quot;א &quot;פריימרים&quot; (מלבנים לבנים קטנים) דומה שברי Okazaki נוצר גדיל DNA סינתזה מפגרת. פולימראז ה-DNA אני משתמשת שברי RNA סינתזה DNA הממשלה באמצעות DNA משלים mRNA כתבנית. כשזה מגיע קטע הבא RNA, שלה 5 &#39;ל 3&#39; פעילות nuclease מסיר את ribonucleotides ומחליף אותם עם deoxyribonucleotides. האנזים דנ&quot;א מתווסף ולקשור כל גדילי שם החלפת גדיל מוביל אינה שלמה. פולימראז ה-DNA T4 הוא הוסיף למלא את האזורים בהם שברי RNA שימש primers הראשוני פולימראז ה-DNA אני יוצר בוטה, הסתיים גדילי כפול cDNA כלומר מטוהרים אז לפני ביצוע התגובה IVT. בתגובה IVT, T7-RNA פולימראז נקשר האמרגן T7 שולבו הכפול תקועים cDNA ו מסנתז antisense מולקולות RNA (מלבנים שחור ארוך) באמצעות גדיל תחושה כתבנית. זה משמש כצעד הגברה שבו אלפי מולקולות RNA antisense מיוצרים מולקולה כפולה כל cDNA תקועים (איור 4 א). הסיבוב השני, כמתואר באיור 4 ב &#39;, מתחיל עם תגובה שעתוק לאחור כי שונה במקצת מזו של הסיבוב הראשון מאז RNA המוצא היא antisense (מלבן שחור מוצק) וחסר הזנב polyadenylated כי היה ממוקד על ידי T7-אוליגו (DT) תחל בסיבוב הראשון. לכן, התגובה הזו היא ערוכה עם primers אקראית (קטן מלבנים אפורים) ו-RNA מפוגל לאחר מכן. התגובה גדיל השני הוא דרוך מכן על ידי פריימר (DT) T7-אוליגו, אשר נקשר את רצף פולי-A בסוף &#39;3 של ה-RNA תחושה שנוצר בתגובה שעתוק שקדמו הפוך. תגובה נוספת IVT מתבצע באותו אופן כמו בסיבוב הראשון. בסיבוב השני הוא חזר על זה בדרך כלל לפחות פעם אחת להשיג שלושה סיבובים של הגברה מתא בודד. יישומים טכניקות אשר הצגנו במאמר זה יכול להיות מתורגם למספר רב של יישומים. פרוטוקול יחיד בידוד תא יכול להיות שונה לשימוש פרוסות חריפה. 14 למרות שטכנית יותר מאתגר, אותם עקרונות יחולו כהכנה זה חלופי. בנוסף, אם הגודל של פיפטה מותאם מעט הקלטות של הפיזיולוגיה של התאים יכולה להתבצע לפני הקציר המאפשר חקירה מבוקר היטב של המנגנונים המולקולריים מאחורי פלטי פיזיולוגיים. עוד שינוי קל הוא לבודד תהליכים סומה התא. 15 עבור יישום זה, לאסוף גופות בתא עם פיפטה אחת ולאחר מכן לחזור עם טפטפת טריים לאסוף 100-300 dendrit מזוההes או אקסונים לכל צינור האיסוף. 16 לאחר התאים נקצרו, השוואות שכיחותם של mRNA ויצירות יכול להתבצע בין שונים, גם בתוך אוכלוסיות תאים זהים. שילוב biotinylated-UTP לתוך ארנה בסיבוב השלישי מאפשר ניתוח microarray כדי לקבוע אלו שכיחותם היחסית mRNA. הרכב האוכלוסייה mRNA המקורי ניתן גם נקבע לאחר ההליך ארנה באמצעות רצף של הדור הבא. ארנה מוגבר יכול לשמש גם כדי לאשר את פנוטיפ התא המרה מחקרים בהם סט מלא של mRNAs מסוג אחד לתוך תא transfected סוג תא אחר כדי לגרום למעבר של פנוטיפ של סוג התא האחרון לתוך כי לשעבר, הליך שפותח על ידי המעבדה המכונה TIPeR. 17 מחקרים אלה הם שימושיים במיוחד עבור הלומדים מדינות מחלות פנוטיפים התא מחקרים כאלה מתקיימים כיום במעבדה. RT-PCR או qPCR יכול להתבצע על החומר מוגבר כדי לאשר את הביטוי של גנים ספציפיים בתא. בנוסף, הערכות של היעילות של transfection או התמרה יכול להתבצע ברמת תא בודד. יתרונות ומגבלות כאמור באופן מופשט, בידוד של תאים בודדים לניתוח מבטל את ההשפעות בממוצע ראיתי עם ניתוח של אוכלוסיות תאים הטרוגנית. תופעות בממוצע לסלף שכיחותם mRNA בתוך תא בודד על ידי יתר המייצג תמלילי שפע בממוצע בחוץ ומניעת גילוי נמוכה שפע תעתיקים רבים. Cytometry זרימה ניתן להשתמש כדי למיין תאים בודדים, אך שיטה זו דורשת ידע סמנים ספציפיים של התא וציוד יקר. ללכוד 18 microdissection לייזר או עם UV או IR microdissection מערכות לייזר ללכוד לאפשר תא בודד ואפילו ללכוד subcellular אבל דורש תאים עניין להיות ממוקם על פני השטח של חלקים דק מאוד. 19 בדומה cytometry זרימה, microdissection לייזר ללכוד גם דורש ציוד יקר. אחד היתרונות העיקריים של השיטה אלקטרודה מבוסס אוסף שתוארו לעיל היא כי נתונים אלקטרו יקר ניתן להשיג התא עניין לפני הקציר, דבר המאפשר ניתוח פונקציונלי transcriptome להתבצע על באותו תא. 20 החיסרון של הטכניקה שלנו זה דורש ניסיון באמצעות micromanipulators. החוקרים מכירים micromanipulators ימצאו טכניקה זו מאוד אינטואיטיבי, עם זאת, אנשים עם ניסיון כזה צריך להיות נוח עם התנועות בסדר הנדרש. הטמון בטכניקה כל הגברה היא הגברה מועדף של תמלילי מסוימים על סמך גודל והרכב נוקלאוטיד. 4,6,7 שרשרת פולימראז התגובה (PCR) טכניקות המבוססות כגון תגובה הפוכה תעתיק פולימראז שרשרת (RT-PCR) ו הגברה המהירה של cDNA מסתיים (RACE) לגרום הגברה אקספוננציאלית של תמלילי, בעוד ההליך הגברה תוצאות ארנה ב הגברה ליניארית. לכן, אחד היתרונות הגדולים של ההליך ארנה הוא ביכולת טובה יותר לשמר את שכיחותם היחסית של תעתיקי mRNA רק באופן ליניארי על ידי הגברה שגיאות או הטיות המתרחשות בתהליך הגברה בניגוד הגברה אקספוננציאלית אמר שגיאות הטיות. ההליך ארנה בשילוב עם ניתוח microarray מאפשר להשוות את שכיחותם mRNA בין תאים בודדים של מורפולוגיה דומה או שונה, או מטופלים מטופל. בנוסף, חומר מוגבר ניתן להגיש עבור סידור הדור הבא. 5,8 עם זאת, יש להיזהר בניתוחים כאלה שכן, בניגוד לשימוש primers אקראי עבור ההליך, את ההליך אוליגו DT-דרוך שתוארו לעיל הגברה הטיות של &quot;3 הקצוות של ה-mRNA, ובדרך כלל התוצאות קיצור קל של חומר מוגבר לאחר מכן עם כל סיבוב. יש להקפיד בניתוח תוצאות microarray עם שיטות סטנדרטיות כמו כמה שיחות נעדר שווא יכול לנבוע חומר מוגבר מקוצרת מעט. בנוסף, תוצאות תוך רצף אכן מספקים את מלוא 5 &quot;רצף של רוב mRNA המקורי, 5&quot; רצפים של mRNA מסוימים עשויים לפספס. מסיבות אלה, מספר סיבובים של amplifications צריך להיות מוגבל.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/2634/transcriptome-analysis-of-single-cells">Transcriptome Analysis of Single Cells</a>. There were errors in the volumes used in the aRNA Amplification section.

Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells

<table><tbody><tr><td>לוחיות כיסוי של Spiegelgas</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית Nunc בגודל 35x10 מ"מ</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>מים לתרבית תאים</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-724Q</td><td>להכנת תמיסות המשמשות לתרבית תאים ולשטיפת לטיות זכוכית (coverslips)</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine MW70-150K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6407</td><td></td></tr><tr><td>למינין, בדרגת טוהר גבוהה מאוד (ultrapure)</td><td>BD Biosciences</td><td>354239</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>MEM עם Earle&amp;rsquo;מלחים ו-glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>41090-101</td><td>לזריעת תאים</td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוס</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>ציטוזין בטא-D-ערבינופירנוזיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>MEM עם Earle&amp;rsquo;מלחים ו-L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>11095-098</td><td>לגידול תאים</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27 נטול סרום</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>צינורות קפילריה מזכוכית בורוסיליקט (קוטר חיצוני 1.5 מ"מ, אורך 100 מ"מ)</td><td>קימבל צ'ייס</td><td>34500 99</td><td>כל פיפטת זכוכית בורוסיליקאט תתאים, כל עוד הושג קוטר הפייה המתאים. </td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>כל תמיסה תתאים, כל עוד הרכיבים לא&amp;rsquo;לא יפריעו לכל עיבוד עתידי (כלומר, ללא Ca)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; או Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td></tr><tr><td>מזרק של 1 מ"ל</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>מחט</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>המדד (Gauge) תלוי בקוטר של הפפיטות</td></tr><tr><td>תערובת dNTP</td><td>Amersham</td><td>28-4065-51</td><td></td></tr><tr><td>אוליגו dt-T7</td><td>מותאם אישית</td><td>Midland Certified</td><td></td></tr><tr><td>בופר לגדיל גדיל שני (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>Y01129</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td></td><td></td><td>סופק עם בופר לגדילה של הגדיל השני</td></tr><tr><td>DNA Ligase של E.coli</td><td>Invitrogen</td><td>100002324</td><td></td></tr><tr><td>DNA polymerase I</td><td>Invitrogen</td><td>100004926</td><td></td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>ערכת Megascript T7</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים אקראיים</td><td>ביולוגיה של ממברנות וביוכימיה</td><td>11034731001</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>56575</td><td>בערכה (18080-044) מגיעים באפר לגדיש ראשון (Y02321) ו-DTT</td></tr><tr><td>ערכה MEGAclear</td><td>Ambion</td><td>1908</td><td></td></tr><tr><td>ערכה לניקוי תגובות MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>100004994</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega Corp.</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>ערכה להגברת RNA מסוג Illumina TotalPrep</td><td>Ambion</td><td>AMIL1791</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר למשיכת מיקרופיפטות בשיטת שריפה/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-87</td><td>ל-Sutter ישנם דגמים רבים אחרים, שרבים מהם נידונים במדריך (cookbook)</td></tr><tr><td>מיקרו-מניפולטור</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>מיקרו-מניפולטורים רבים אחרים יעבדו, כגון הדגמים החדשים יותר של Eppendorf</td></tr><tr><td>מעמד לפיפטות</td><td>Warner Instruments</td><td>MP-S15A</td><td>ישתנה בהתאם למניפולטור המיקרוסקופי ולקוטר החיצוני (O.D.) של הפיפטה.</td></tr><tr><td>ערכה לניתוח RNA 6000 Nano עבור Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח transcriptome של תאים בודדים

Transcriptome Analysis of Single Cells

ביטוי גנים רבים מסתמכים על טכניקות ניתוח חומר מבודד אוכלוסיות הטרוגנית של תאים או רקמות homogenates התאים בתרבית. 1,2,3 במקרה של המוח, אזורים כמו ההיפוקמפוס מכילים הסדר מורכב של תאים מסוגים שונים, כל אחד עם mRNA פרופילים שונים. היכולת קציר תאים בודדים מאפשר יותר בחקירה לעומק את ההבדלים מולקולרית בין ובתוך אוכלוסיות תאים. אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה של קצירת התאים לעיבוד נוסף. Pipettes משמש לעיתים קרובות electrophysiology מנוצלים לבודד (באמצעות שאיפה) תא עניין ובנוחות להפקיד אותו לתוך צינור Eppendorf לעיבוד נוסף עם כל מספר של טכניקות הביולוגיה המולקולרית. פרוטוקול שלנו יכול להיות שונה לקציר של דנדריטים של תרבית תאים או אפילו תאים בודדים מתוך פרוסות חריפה. כמו כן, אנו מתארים את שיטת הגברה ארנה כיישום הזרם העיקרי של isolations תא בודד. שיטה זו פותחה בעבר כחלופה אחר ביטוי גנים טכניקות ניתוח כגון שעתוק, הפוך או בזמן אמת שרשרת התגובה פולימראז (PCR) על ידי המעבדה שלנו. 4,5,6,7,8 טכניקה זו מאפשרת הגברה ליניארית של RNA polyadenylated החל femtograms רק של החומר וכתוצאה מכך כמויות מיקרוגרם של antisense RNA. החומר מוגבר באופן ליניארי מספקת הערכה מדויקת יותר מאשר הגברה PCR מעריכי השפע היחסי של מרכיבי transcriptome של התא המבודד. ההליך הבסיסי מורכב משני סיבובים של הגברה. בקצרה, RNA פולימראז אתר מקדם T7 הוא שולב cDNA גדילי כפול נוצר מתוך תמלילי mRNA. לילה שעתוק במבחנה (IVT) התגובה מתבצעת לאחר מכן שבה T7-RNA פולימראז מייצר תמלילי antisense רבים מן cDNA גדילי כפול. הסיבוב השני חוזר על התהליך הזה, אבל עם כמה הבדלים טכניים מאז חומר המוצא היא antisense RNA. זהו תקן לחזור על הסיבוב השני, וכתוצאה מכך שלושה סיבובים של הגברה. לעתים קרובות, בסיבוב השלישי בתגובה שעתוק במבחנה מבוצע באמצעות triphosphates nucleoside biotinylated כך RNA antisense המיוצר יכול להיות הכלאה ו זוהה על microarray. 7,8

במאמר זה אנו מתארים שיטה פשוטה קצירת של תאים בודדים מתרבויות עכברוש העיקרי העצבית וניתוח transcriptome הבאים באמצעות הגברה ארנה. גישה זו היא להכליל לכל סוג תא.

ניתוח Transcriptome של תאים בודדים

טכניקות רבות לניתוח ביטוי גנים מסתמכות על חומרים שבודדו מאוכלוסיות תאים הטרוגניות מתוך הומוגנאטים של רקמות או תאים ב...

המטרה הכללית של הליך זה היא להכין דגימות מתאים בודדים לצורך אנליזה של הטרנסקריפטום. דבר זה מושג תחילה על ידי מציאת תא המתאים לבידוד. לאחר מכן, המיקרו-פיפט ממוקם לצד התא המיועד לבידוד.בשלב הבא, מפעילים יניקה באמצעות המזרק עד שהתא נמשך אל קצה המיקרו-פיפט. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא שבירת קצה המיקרו-פיפט לתוך מבחנת האיסוף וריקון התכולה שנותרה במיקרו-פיפט לתוך המבחנה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות הבדלים באוכלוסיות mRNA בין תאים באמצעות ניתוח microarray של חומר שהוגבר בשיטת arna amplification, המתוארת אף היא בפרוטוקול, או עבור יישומים אחרים כגון PCR או next generation sequencing.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ההבדלים בין תאים בודדים, ניתן להחיל אותה גם על מדורים תת-תאיים כגון דנדריטים או סוגים של דנדריטים, ובכך להפיק מידע חשוב על תפקוד הדנדריטים. את הפרוצדורה תדגים ג'ניפר סינג, פוסט-דוקטורנטית במעבדתי. לפני תחילת הפרוטוקול, נוירונים ראשוניים מיום עוברי 18 של Hippo Campi של חולדה נזרעו על לבישות זכוכית (cover slips) בקוטר 12 מילימטר בתוך צלחת של 35 מילימטר ונשמרו כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. להכנת פיפטות לאיסוף, השתמשו במכשיר משיכה של מיקרו-פיפטות כדי למשוך פיפטות זכוכית שעברו עיקור באוטוקלאב לקוטר המתאים לאלקטרופיזיולוגיה.בשימוש בתוכנית המוגדרת מראש של היצרן, גודל הפיה אינו קריטי כיוון שהקצה יישבר לפני איסוף התאים. אחסנו את הפיפטים בזהירות בסביבה נקייה מאבק, כגון צנצנת אחסון לפיפטים מיקרו, כדי שהטיפים יישמרו שלמים עד למועד קצירת התאים. הכינו את מספר צינורות ה-eppendorf בנפח 1.7 milliliter הרצוי על ידי הוספת 2 µL של PBS לאחסון החומר שנקצר.הוצא מתוך האינקובטור, תחת מנדף לתרביות רקמה, צלחת אחת בקוטר 35 מילימטר המכילה לוחות כיסוי. העבר במהירות לוח כיסוי אחד מצלחת זו אל המכסה של צלחת חדשה בקוטר 35 מילימטר המכילה HBSS. חשוב להחזיר את לוחות הכיסוי שאינם בטיפול לאינקובטור, שכן התאים עלולים להיפגע.אם הם נשארים בחוץ לפרקי זמן ממושכים. לצורך קצירת התאים נדרש מיקרוסקופ אור הפוך עם עדשה אובייקטיבית של 40x המצוידת במניפולטור מיקרוסקופי. השתמש במחזיק פיפט עם צינור גמיש המוביל הרחק מהמחזיק, והצמד את הצינור למשטח יציב כדי למנוע תזוזה לא רצויה של הפיפט במהלך האיסוף.בקצה הצינור, הכנס מחט כך שניתן יהיה לחבר ולהחליף מזרק של one milliliter עם חיבור lure lock בין משתמשים שונים. הכן את המיקרופיפט על ידי שבירה מבוקרת של הטיפ, תוך כדי מתיחת נייר Kim wipe בין אצבעות יד אחת והעברה עדינה מאוד של קצה הפיפט על פני הנייר פעם אחת עד פעמיים. הפתח צריך להיות בערך 75% עד 100% מגודל התא המטרה.הדק את המיקרו-פיפט במחזיק המיקרו-פיפט וחבר את מחזיק המיקרו-פיפט למתאם של המיקרו-מניפולטורים. לבסוף, הגדר את העדשה האובייקטיבית 40x. הנח את הצלחת עלבמה של המיקרוסקופ ואתר אזור של תאים המתאים לאיסוף.במקרה של תרביות נוירונים ראשוניות, התא צריך להיות מבודד יחסית משכניו. כדי למנוע איסוף של תאים סביבים ו/או של שלוחותיהם, מקמו את התא המיועד לאיסוף במרכז שדה הראייה. השתמשו במיקרו-מניפולטור כדי להקדם את המיקרו-פיפט לעבר התמיסה שבצלחת אל תוך נתיב האור.הנמיקו את קצה הפפיטה אל תוך התמיסה. במבט דרך העינית, הפפיטה צריכה להופיע כצל בשדה הראייה. מהשלב הזה ואילך, הפילו לחץ חיובי על ידי נשיפה קלה דרך המזרק, הרחק מעל מישור התאים.כוון את מיקום קצה הפיפטה עד שיהיה בתוך שדה הראייה, ובצע פוקוס על קצה הפיפטה באמצעות גלגלי המיקוד הגס. בנקודה זו, הערך האם קוטר החור של הפיפטה גדול מדי או קטן מדי. אם קוטר החור אינו נכון, החלף במיקרו-פיפטה אחרת עד למציאת קוטר החור המתאים, וזאת כדי למנוע שבירה של הפיפטה באזור האיסוף.השתמשו בגלגל המיקוד הגס כדי להקדים את מישור המיקוד לפני קידום קצה הפ pipette לעבר התאים באמצעות המיקרו-מניפולטורים. ככל שהתאים מתקרבים, השתמשו במיקוד העדין עד שהתאים וקצה ה-pipette נמצאים במיקוד. הפסיקו להפעיל לחץ חיובי לפני ההגעה לתאי המטרה כדי למנוע את דחיפתם מהזכוכית של כיסוי הלמינציה.מקמו את קצה הפפטה באמצעות המיקרו-מניפולטורים כך שיהיה במגע עם סומת התא המיועד לאיסוף. באמצעות המזרק, הפעילו יניקה עדינה בעזרת הפה עד שהתא יישאב לתוך קצה הפפטה. אם התא אינו נשאב לפפטה, הזיזו בעדינות את הקצה קרוב יותר לתא ומטה עד שהוא יתנתק מזכוכית הכיסוי.השתמשו במיקרו-מניפולטור כדי להרכיב מיד את הפ pipette כלפי מעלה ולהוציאו מהתמיסה. הוציאו את ה-pipette מהמעמד. החזיקו ביד אחת את מבחנת ה-einor בנפח 1.7 milliliter שהוכנה, ושברו בעדינות את קצה ה-pipette על דופן המבחנה לכיוון התחתית.כוון אל סימון ה-0.1 milliliter כאשר הקצה השבור ממורכז בתוך המבחנה, והחדר מחט המחוברת למזרק של one milliliter אל הפתח העליון של הפיפטה. לחץ במהירות על הבוכנה כדי לדחוף את התמיסה שבפיפטה להתרסס אל תוך המבחנה. הקפד שהקצה לא ייגע בנוזל כלשהו על דפנות המבחנה.מכיוון שפעולת הנימיות תחזיר את הנוזל אל תוך הפיפטה, התא אמור להישאר בקצה הפיפטה, ודבר זה אמור להספיק כדי להוציא את התא כראוי. סובבו במהירות את תכולת המבחנה באמצעות מיקרו-צנטריפוגה שולחנית והקפיאו על קרח יבש או הניחו על קרח לעיבוד המשך או ליישומים אחרים כגון PCR או ריצוף מהדור הבא. מוצגת כאן דוגמה לאיסוף מוצלח של נוירון מבודד.בתחילה, נבחר אזור בעל צפיפות תאים נמוכה יחסית. לאחר מכן, קצה הפ pipette הובא לעבר התא הרצוי. כאן מוצג שדה הראייה לאחר שהתא נאסף.שימו לב שהתהליכים שסביב נשארים על לביב הכיסוי. לעומת זאת, איור זה מציג שתי תמונות של קצות פיפט, שגודלם אינו מתאים לאסוף את הדגימות ביעילות. קצה פיפט זה יוביל לאיסוף חלקי, בעוד שקצה הפיפט המוצג כאן יגרום לאיסוף של הסביבה המקיפה.לאחר הקצירה, וביצוע אנליזת הגברה של RNA, מומלץ להשתמש ב-bioanalyzer כדי לבחון את ההתפלגות והכמות של ה-RNA שהוגבר. הגברה מוצלחת מחומר של תא בודד תניב כמויות כוללות בסדר גודל של מיקרוגרמים בודדים ותהיה בעלת התפלגות חלקה ורחבה. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן להשלימה תוך דקות במידה והיא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להשתמש בטכניקה נטולת RNA.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

RNA פולימראז II קינטיקה תעתיק נמדדים על גנים ספציפיים בתאים חיים. mRNAs עיבד מן הגן של עניין מתויגים fluorescently באמצעות שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) ב קינטיקה vivo של התארכות תעתיק מתקבלים.

מדידת קינטיקה של שעתוק mRNA בתאים חיים יחיד

פרופיל יחיד ביטוי התא מאפשר את הגן מפורט ביטוי בניתוח של תאים בודדים. אנו מתארים שיטות הבידוד של cardiomyocytes, והכנת lysates וכתוצאה מכך עבור microarray או transcriptome qPCR כולו או מטרות ספציפיות.

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

אנו מתארים שיטה למיון תאי יונקים בודדים ולכמת את הביטוי של עד 96 גנים מעניינים בכל תא. שיטה זו כוללת שימוש בתקני qPCR פנימיים כדי לאפשר הערכה של ספירת תעתיקים מוחלטת.

תאים יחידים Gene Expression Profiling שימוש FACS ו qPCR עם סטנדרטים פנימיים

תפזורת ג'ין ביטוי מדידות ענן תא בודד הבדלים באוכלוסיות הטרוגניות תא. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור ביטוי מפענוח ואינדקס איך החד-תאיים מיון על-ידי Florescence מופעל התא מיון (FACS) יכול להיות משולב על הטרוגניות, immunophenotypically מאפיינות אוכלוסיות תאים נפרדים מולקולרי.

הגישה קומבינטורית תא בודד כדי לאפיין את מולקולרית והטרוגניות Immunophenotypic של גזע האדם ואוכלוסיות קדמון

פרוטוקול זה מתאר את התהליכים כללי, בקרת איכות בודק הדרושים להכנת בריאים למבוגרים תאים בודדים בתרבית של תפוקה גבוהה, מבוסס-droplet תא בודד RNA-Seq ההכנות. קביעת רצף פרמטרים, יישור קריאה וניתוח bioinformatic תא בודד במורד הזרם הינם גם מסופקים.

רביב Transcriptomics מבוססי Barcoding תא בודד של רקמות בוגרות יונקים

פרוטוקול זה מסביר כיצד לאסוף נוירונים בודדים, microglia, ו אסטרוציטים מן הגרעין המרכזי של האמיגדלה עם דיוק גבוהה וספציפיות אנטומיים באמצעות לכידת לייזר מיקרוניתוח לכידה. בנוסף, אנו מסבירים את השימוש שלנו במיקרופלואידיג RT-qPCR כדי למדוד תת-קבוצה של התאים הללו.

שילוב לכידת לייזר ובדיקות מיקרופלוטואידים לניתוח פרופילים של תאים בודדים: גישת ביולוגיה של מערכות לתלותיות באופטואיד

כאן הצגנו מרבב תא יחיד mRNA שיטת רצף לביטוי גנים פרופיל ברקמות עובריים העכבר. השיטה המבוססת על droplet בודדת של תא mRNA (scRNA-Seq) בשילוב עם אסטרטגיות ריבוב יכולה לפרופיל תאים בודדים מדגימות מרובות בו זמנית, אשר מפחית באופן משמעותי את עלויות החומרים וממזער את השפעות האצווה הנסיוניות.

מרבב תא יחיד mRNA ניתוח הרצף של העכבר תאים עובריים

פרסום זה מתאר פרוטוקול לבידוד של גרעינים מאדיפוציטים בוגרים, טיהור על-ידי מיון המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית ורמת תא בודדת מופעלת.

בידוד של שאדיפוז של גרעיני הרקמה עבור יישומים גנומית של תא יחיד

נייר זה מציג שיטות לגידול מיוציטים לבביים עם צורות שונות, המייצגות פתולוגיות שונות, ומיון מיוציטים לביים דבקים אלה בהתבסס על המורפולוגיה שלהם ברמת תא אחד. הפלטפורמה המוצעת מספקת גישה חדשנית לתפוקה גבוהה והקרנת סמים עבור סוגים שונים של אי ספיקת לב.

גישה לחקר תעתיק תלוי צורה ברמת תא יחיד

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חד-תאית לאנליזות אפיגנומיות איטרטיביות באמצעות תא בודד לשימוש חוזר. התא הבודד הניתן לשימוש חוזר מאפשר ניתוח של סימנים אפיגנטיים מרובים באותו תא בודד ותיקוף סטטיסטי של התוצאות.

תא בודד לשימוש חוזר לניתוחים אפיגנומיים איטרטיביים

מאמר זה מציג פרוטוקול לביצוע פרופיל טרנסקריפטומי מרחבי מקיף של RNA מארח, ויראלי, פטרייתי ומיקרוביום מקטעי רקמה משובצים בפרפין קבוע פורמלין באמצעות Stereo-seq, המאפשר מיפוי ברזולוציה גבוהה של טרנסקריפטומים מגוונים תוך שמירה על ארכיטקטורת רקמות.

פרופיל מרחבי מקיף של טרנסקריפטומים אגנוסטיים למינים באמצעות סטריאו-רצף

למדו שיטה לאיסוף תאים בודדים מתרביות נוירונים ראשוניות של עכברים לניתוח טרנסקריפטומי באמצעות הגברת aRNA. טכניקה זו מאפשרת חקר הביטוי הגני ברמת התא הבודד ומסייעת להבנת ההטרוגניות התאית במחקר נוירולוגי.

ניתוח Transcriptome של תאים בודדים

גלה סרטונים נוספים