השלמה Fluorescence bimolecular

ניסוי זה נועד להגדיר אם שני חלבונים מתקשרים בתאים ולתאים ולתאר היבטים של אתרי האינטראקציה הזו. תאים ראשונים עוברים טרנספטציה עם מבני ביטוי המקודדים את שני החלבונים המעניינים, אחד מהם מאוחה לקצה הסופי של חלבון פלואורסצנטי מקוטע והשני מאוחה לקצה C המשלים של החלבון הפלואורסצנטי המקוטע. לאחר שאפשרו לתאים שעברו טרנספטציה לפתח אות פלואורסצנטי בתרבית, קומפלקסי החלבון של הדמיה וכתמים חיסוניים.

לאחר מכן, התמונות שנאספו מיוצאות לתוכנת הדמיה כגון Image J על מנת לכמת את עוצמת הקרינה הממוצעת לתא בניסוי מבוקר, תוצאות BIFC יכולות להדגים אינטראקציות חלבון ולוקליזציה של קומפלקסים אלה, כמו שלושת התחומים SH של חלבון הפיגום המצטלבים והתחום העשיר של PI שלוש KC שני בטא. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון קולוקליזציה, משקעים חיסוניים ועצבנות, הוא ש-BFC מאפשר לוקליזציה מרחבית של אינטראקציות חולפות חלשות יותר בתא. ושיטה זו אינה דורשת תמונות נרחבות לאחר עיבוד כפי שניתן לראות עם fret.

שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום העברת האותות, כגון אינטראקציה בין חלבוני DO X ו-Y, ואם כן, מהם התאים הספציפיים שאליהם ממוקמים קומפלקסים אלה בתא? בדרך כלל, מצטרפים חדשים לשיטה זו יתקשו מכיוון שהם לא בחרו את התצורה המתאימה לביטוי הביופסיה שלהם. חלבונים מתויגים מעניינים התחל בבחירת אחד מהפלואורופורים המרובים עבור חלבוני ההיתוך של BIFC.

קחו בחשבון שקצוות האמינו והקרבוקסי של נוגה מסוגלים ליצור קומפלקס ב-37 מעלות צלזיוס בעוד שברי Y-F-P-B-I-F-C דורשים דגירה מוקדמת ב-30 מעלות צלזיוס. תכנן וקטורי ביטוי להוספת תגים לחלבונים המעניינים על ידי התחשבות באופן שבו התקשרות של שברי BIFC עשויה להשפיע על תפקוד החלבונים המעניינים. לדוגמה, משפחת RAs, GTP a's משתנים בשומנים בקצה הקרבוקסי ולא ניתן לתייג אותם בקצה זה מבלי לשבש את השינוי הזה.

בצע תמיד ניסויי פיילוט כדי לקבוע תנאי טרנספקציה. עקוב גם אחר התאים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות זמן אופטימלי להתפתחות האות. לאחר מכן בצע ניתוח פריחה מערבית כדי לאשר ביטוי שווה של המבנים.

חשוב לציין צביעה חיסונית עבור ה-HA או תג הדגל כדי לוודא שהוספת שברי ה-BIFC אינה משנה את הלוקליזציה התאית של החלבונים המעניינים עבור כל לוחית דגימה. 1.3 כפול 10 מתוך החמישה גורמים לתאים כל אחד על צלחת חומר תחתונה מזכוכית אחת ושתי בארות של צלחת שש בארות ומאפשרים לתאים להתיישב למשך הלילה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למחרת. הכן DNA לטרנספקציה על ידי כריתת שומן או שיטה מועדפת אחרת.

ראשית, יש לדלל את ה-DNA ב-250 מיקרוליטר של DMEM ללא סרום כבקרת טרנספקציה. הוסף CFP ב-50 אחד, הסכום הכולל של ה-DNA של ה-BIFC שלך. כעת יש לדלל את השפה ב-250 מיקרוליטר של DMEM ללא סרום באמצעות 10 מיקרוליטר שפה לכל מיקרוגרם אחד של DNA.

מערבבים את ה-DNA ודילול השפתיים מדגרים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. יש לשטוף את התאים פעמיים עם DMEM חם ללא סרום. הוסף שני מיליליטר של DMEM ללא סרום לכל צלחת תחתונה מזכוכית או באר של צלחת שש בארות.

לאחר מכן חלקו כל תערובת טרנספקציה באופן שווה בין צלחת תחתית זכוכית אחת לשתי בארות של שש. ובכן, צלחת דוגרת על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות. לבסוף, הסר את מדיית ההעברה והחלף ב-DMEM מלא בתוספת 10% מדיית FBS.

דגירה על התאים למשך הזמן שנקבע בניסויי פיילוט כדי להשיג את רמות הביטוי הדרושות של החלבונים המעניינים. בחן את התאים הטרנספטנטיים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי כדי לוודא שהבקרה החיובית היא פלואורסצנטית. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS להדמיית תאים חיים.

מקם את התאים במדיה חסר מחוון מת. להדמיית תאים קבועים. מוסיפים 2%פרה פורמלדהיד ומניחים על קרח למשך 10 דקות.

לאחר מכן שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS המכוסה כעת במיליליטר אחד של PBS ואחסנו בחושך בארבע מעלות צלזיוס, מיד חבטו את התאים בצלחת שש הבארות. עבור ניתוחי כתמים מערביים, חשוב שכל התאים יהיו מוכנים בו זמנית כך שתאי ה-lys ייצגו את תאי התמונה. בצע כתם מערבי כדי להבטיח שחלבוני התגית יבואו לידי ביטוי ברמות שוות.

כאשר מדמים תאים במיקרוסקופ קונפוקלי, חשוב לשמור על הגדרות קבועות לאורך כל הניסוי כך שהפלואורסצנטיות תהיה דומה בין הדגימות. הקפד לצלם תאים בודדים שבהם הפיקסלים אינם רוויים. מכיוון ש-CFP נכלל כבקרת טרנספקציה, בחר רק תאים חיוביים ל-CFP לניתוח אותות BIFC.

כימות פלואורסצנטי באמצעות תוכנת הדמיה כגון image J.פתח קובצי תמונה ב-Image J.Go כדי לנתח מדידות שנקבעו. סמן את התיבות עבור שטח וערך אפור ממוצע בתיבה מידות. שימו לב שבדוגמה זו, תמונות ורידיות היו תמונות פסאודו בצבע ירוק ותמונות CFP, פסאודו בצבע אדום.

בעזרת הכלי בחירה ביד חופשית, צייר קו מתאר סביב קצה התא כולו בערוץ CFP והשאיר את קו המתאר במקומו. עבור לערוץ YFP. עבור לנתח, מדוד את הערך האפור הממוצע משקף את עוצמת הקרינה הממוצעת לתא עבור כל תמונה.

ציירו עיגול בערוץ YFP באזור שאינו כולל תא. בצע מדידה עבור אזור זה כרקע. הפחיתו את הרקע מכל תמונה.

לבסוף, כדי לחשב את עוצמת הקרינה הממוצעת עבור אוכלוסיית תאים, ממוצע את ערך הציון הממוצע פחות הרקע עבור כל התאים שצולמו בדגימה אחת. כמת באופן אידיאלי 60 תאים בשלושה ניסויים. חלבון הפיגום הרב-תחומי, המצטלב, מווסת את ההישרדות העצבית באמצעות ויסות של מחלקה חדשה, שתיים, PI, שלושה קינאז, PI, שלושה KC, שני בטא מצטלבים, SH, שלושה תחומים מקיימים אינטראקציה עם האזור העשיר בפרולין של מסוף האמינו של PI, שלושה KC, שני טרנספקציה בטא של VN, מצטלבים עם VC מתויג, PI שלו, שלוש, שני בטא, מביא לאות פלואורסצנטי בערוץ YFP, שהוא פסאודו בצבע ירוק המציין היווצרות מורכבת.

פסאודו CFP צבוע כאן באדום משמש כבקרה לסימון מוטציות בתאים שעברו טרנספטציה בתחום העשיר בפרולין של PI שלוש KC שני בטא, המשבשות משקעים משותפים של הצטלבות ו-PI שלוש KC שתיים בטא מפחיתות את אות ה-BIFC. הבדל זה באות BIFC אינו נובע מהבדלים בביטוי של סוג הבר וחלבוני PA PI שלושה K לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה ימים אם היא נעשית כראוי. בעת ביצוע הליך זה, עליך לזכור להפעיל את הפקדים המתאימים ולבדוק את ביטוי החלבון כדי להבטיח שהבדלים באות BC נובעים מהבדלים בהיווצרות מורכבת ולא עקב ביטוי לאחר הליך זה.

ניתן לבצע טכניקות אחרות כגון פלזמה על פני השטח על תושבים על מנת לענות על שאלות כגון מהן הזיקות השונות של קומפלקסים אלה זה לזה?