מיפוי יישומים הביטוי Flippase Enhancer-מלכודת הזחל וגם למבוגרים תסיסנית CNS

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחדד את ביטוי GAL 4 באמצעות שימוש בליפאז ספציפי לרקמה עם כלי המרה של GAL 80. זה מושג על ידי יצירת אוסף של קווי זבוב טרנסגניים של פיליפ מלכודת משפר וקביעת דפוס הביטוי של מערכת העצבים המרכזית של ליפאז בכל קו. באמצעות דוח GFP, דוחות אימונוכימיה ו-GFP יכולים להבדיל בין GL לביטוי עצבי כדי לחצות את ביטוי GAL ארבעה בקווי עניין של קווי היפוך ET על פני הזבובים המכילים כלי המרת GAL 80 בצאצאים.

ניתן להשתמש בניתוח שיבוט כדי לנתח את העידון של ביטוי GAL four, כגון בעין. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שניתן להשתמש בקווים מבוססי משחק משפרים יחד עם כלי המרה של GAL 80 עם אוסף מהיר של GAL four alliance שכבר זמין בקהילת הזבובים. בנוסף, ניתן להרחיב את המושג הזה לאורגניזמים אחרים של GALI ארבעה כטב"מים מתפתחים כגון דג הזברה.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במיפוי מעגלים עצביים העומדים בבסיס ההתנהגות. למרות שפרוטוקול זה מדגים את השימוש בבסיס היפוך בתת-קבוצה של תאים קולטני אור, ניתן ליישם את שיטת ההצטלבות לניתוח רקמות אחרות, כולל רקמות שאינן עצביות. ככל שמאופיינים קווי ליפאז משפרים יותר.

גאוט ארבע ארה"ב היא טכניקה חשובה שנמצאת בשימוש נרחב על ידי ביולוגים של זבובים. אזהרה אחת של רוב ארבע שורות GAL היא זו המבוטאת בצורה רחבה מדי מכדי לשמש למיפוי התנהגות מוחית בשיטות האצבעות. לא ניתן לכוונן את ביטוי GAL ארבע בחולצות טריקו מעניינות לפני שימוש בטרנסגן היפוך ET כדי להגביל חלקית את הביטוי של GAL ארבעה קווי ביטוי

ראשית מועיל לדעת את דפוס הביטוי של ET flip x שני טרנסגנים בשלב מאוחר של התפתחות לבה ואצל מבוגרים כדי לדמיין את הביטוי של flip a במערכת העצבים המרכזית הקימו הכלאה בין זכרים עם ET t flip X שני טרנסגנים מעניינים ונקבות בתולות המחזות מדווח GFP לביטוי et flip מהצאצאים. אסוף זחלי F1 משוטטים של כוכב שלישי לדיסקציה. מניחים אותם בכלי מגן S נקי ומסירים כל פסולת בעזרת מברשת צבע ושוטפים את הכלי פעם אחת עם PBS פעם אחת.

עכשיו מלאו את המנה בקור קרח פעם אחת PBS כדי להרדים את הזחלים כדי לגשת למערכת העצבים המרכזית של לבה להחזיק את וו הפה שלה עם זוג מלקחיים. תפסו את הקוטיקולה ליד הכדור הקדמי המתארך וקלפו אותה בחזרה. מערכת העצבים המרכזית נשארת מחוברת לוו הפה יחד עם כמה מבנים אחרים.

עכשיו עם מלקחיים, הסר את כל המבנים העודפים המקיפים את מערכת העצבים המרכזית בזמן שאתה מנתח את מערכת העצבים המרכזית. העבירו אותם בנפרד לכלי פיירקס של שלושה עולמות במילוי PBS. לאחר ניתוח כל מערכת העצבים המרכזית, תקן אותם על ידי טבילה מלאה ב-200 מיקרוליטר של 4% PFA על קרח.

אם מערכת העצבים המרכזית צפה, היא לא נוקתה לחלוטין מכל הרקמות שמסביב. אם זה קורה, השתמש בזוג מלקחיים כדי להטביע מחדש את מערכת העצבים המרכזית לתוך הקיבוע לאחר קיבוע במשך 15 דקות, שטוף את הטישו ב-PB S3 קר כקרח פעמים ולאחר מכן שטוף את הטישו שלוש פעמים נוספות ב-PBT קר כקרח. הרקמה מוכנה כעת להדמיה או לתיוג על ידי נוגדנים או לאחסון ב-PBT בארבע מעלות צלזיוס למועד מאוחר יותר.

צביעה מאותו צלב ששימשה ליצירת זחלים לאסוף F1 בוגרים לפני הנתיחה. טבלו חמישה עד 10 זבובים וציננו 95% אתנול למשך 30 שניות כדי להסיר את השעווה על פני הציפורן. כדי להסיר את האתנול, שטפו את המבוגרים שלוש פעמים בקור קרח פעם אחת PBS ולאחר השטיפה השלישית, העבירו אחד מהם לצלחת 35 מילימטר מלאה בקור קרח פעם אחת PBS כדי להכין מבוגר לדיסקציה.

הניחו אותו עם הצד הגחוני כלפי מעלה והכניסו סיכת מיניון באמצע הדרך דרך הבטן. התחל לנתח באמצעות מלקחיים להסרת הרגליים. לאחר מכן הסר את קוטיקולת הראש על ידי קיבוע הראש באביזרים ובמקביל קילוף הקוטיקולה מתחת לעין לכיוון החלק העליון של הראש.

השתמש בזהירות במלקחיים מושחזים, הסר, עקוב אחר הרקמות המקיפות את המוח שלך מכיוון שלרקמות שלך יש אוטופלואורסצנטיות חזקה וזה גורם למוח לצוף במהלך התיקון. המוח הוא רק חלק ממערכת העצבים המרכזית של המבוגרים. החלק השני הוא חוט העצבים הגחוני או VNC בבית החזה ויש לנתח גם אותו.

ראשית, הסר את ציפורן בית החזה על ידי אבטחת הזבוב בבסיס הרגל האחורית ומשיכה עדינה של ציפורן בית החזה עד לבסיס הצוואר. שנית, כדי לחשוף את ה-VNC יש לפזר בעדינות את שני חצאי ציפורן בית החזה. שלישית, הסר את הבטן מבית החזה על ידי קיבוע בבסיס הרגל השנייה ומשיכת הבטן מסמוך לערב ערבוב הבטן הראשון.

רביעית, נקו את ה-VNC על ידי קיבוע באזור עצם הזרוע וקריעת הרקמה המקיפה את ה-VNC. קרעו את טבעת רקמת החיבור המקיפה את חיבור צוואר הרחם והמשיכו להסיר רקמות עודפות בזמן שאתם אוספים את המוח. ו- VNC מעבירים אותם כאגסים לתוך צלחת פיירקס עולמית מלאה ב- PBS צונן שנשמר על קרח.

כדי לתקן את הרקמות הבוגרות, טבלו אותן ב-4% PFA על קרח למשך 15 דקות. עקוב אחר האמבטיה עם שלוש שטיפות PBS קרות כקרח ושלוש מכונות כביסה PBT. הרקמה מוכנה כעת להדמיה או לתיוג על ידי נוגדנים כדי לנתח את ביטוי הטרנסגנים בצורה מדויקת.

כדאי לתייג את מערכת העצבים המרכזית עם סמנים עצביים או גליה כדי לספק מסגרת התייחסות להתחיל בדגירה של הרקמה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה עם נוגדנים לנוירונים או לגליה למחרת. שטפו את התכשיר חמש פעמים עם PBT ודגרו עם הנוגדן המשני הפלואורסצנטי בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. עטפו את הצלחת ונייר הכסף כדי למנוע פוטוהלבנה של הנוגדן בסיום הדגירה.

שוטפים את התכשיר עם PBS ומרכיבים את כל התכשיר לשקופית. השתמש בטבעת פלסטיק OSHA כדי למנוע את ריסוק הרקמה על ידי החלקת הכיסוי. מערכת העצבים מוכנה כעת לבחינה של דפוסי ביטוי GFP ו-LL תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

בדרך כלל נבדקים שלושה עד חמישה שכפולים כדי לקבוע את יכולת השחזור של דפוס ביטוי ההיפוך. דפוס הביטוי של היפוך בהיפוך, ניתן להשתמש בקו יחד עם טרנסגנים אחרים כדי לשנות את האופן שבו מדכא GAL 4 GAL 80 מתבטא. שינוי ביטוי המדכא GAL 80 הוא שיטה יעילה לביצוע שינויים.

בביטוי GAL 4, שיטה אחת היא להעיף את ביטוי GAL 80 עם ביטוי GAL 80 הטרנסגן משבית את GAL 4, שאחרת מניע ניוון עיניים בכל העין. גיבוב קו ההיפוך ET 6 88 A משמש כאן כדי להעריך את היעילות של כלי ההמרה GAL 80 בתת-קבוצה של קולטני אור בצאצאי F1, להשוות את פנוטיפ העין לפנוטיפ העין של זני ההורים. כל הופעה של עיוות או פיגמנטציה בעיניים מאשרת כי דפוס ביטוי ההיפוך קיים בקולטני האור והיפוך GAL 80 היה מוצלח.

אסטרטגיה משלימה שאינה מיותרת היא להפוך בביטוי GAL 80 באמצעות אותו קו היפוך של עניין. אסטרטגיה זו דומה מאוד לאחרת, אך כעת פיגמנטציה וניוון של זיהוי בצאצאי F1 מדוכאים. בהיפוך X שתיים.

ביטוי קולטני אור לאחר שליטה בדיסקציה של מערכת העצבים המרכזית ניתן לבצע תוך כחמש דקות למבוגרים ודקה אחת לזחלים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להשתמש במלקחיים חדים כדי להסיר את קנה הנשימה והרקמה המקיפים הן את הבוגר והן את Libre C וחשוב Ss.It להשתמש בכלי ללא קיבוע לדיסקציה. היפוך הלם חום משמש כיום ליצירת שיבוטים אקראיים.

לעומת זאת, היפוך מלכודת משפר מאפשר ליצור שיבוטים הניתנים לשחזור, מה שמקל על ניתוח מורפולוגי והתנהגותי. חוזק נוסף של שיטת האצבע הוא שניתן להגביל עוד יותר את ארבע דפוסי הביטוי של GAL על ידי שימוש בקווים נוספים המבוססים על מלכודת אנאן וקווי גל אחרים. חולשה של תצורת עצירת טובולין GAL 80 היא ששילובים מסוימים של GA 4 ואפקטורים של כטב"מים כגון LAG 4 ו-U-A-S-K-I-R אינם תואמים מכיוון שהם יהרגו את הזבובים.

ניתן להתגבר על בעיה זו בקלות על ידי שימוש באפקטור כטב"ם מותנה, כגון UAS Shiri Ts, המאפשר לבחון התנהגות בטמפרטורות מגבילות כצפוי. לא כל קווי הליפאז של מלכודת המשפרים יבטאו רמות גבוהות מספיק של ליפאז כדי להיות שימושיים. עם זאת, טכניקת האצבע המתוארת כאן מספקת גישה חדשה לחוקרי דרוזופילה לחדד את ניתוח הפסיפס עבור מעגלי התפתחות או התנהגות.